عزل الحمض النووي الميكروبي للبراز: دراسة تأثير الإثراء البيئي على تنوع الميكروبيوم في نموذج ورم الفئران

- يشير الإثراء البيئي ، أو EE ، إلى التعديلات في معايير السكن للحصول على آثار مفيدة على الأمراض المختلفة مثل السرطان. في الفأر الحامل للورم ، ينشط EE جهاز المناعة ويقلل الالتهاب ، مما يحسن في النهاية ميكروبات الأمعاء ويحسن معدل البقاء على قيد الحياة. لدراسة التغيرات في ميكروبات الأمعاء ، أضف الكمية المطلوبة من محلول تحلل البراز في أنبوب يحتوي على براز الفأر.

الطرد المركزي العينة ونقل المادة الطافية إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد. أضف المخزن المؤقت لتحلل كلوريد الجوانيدينيوم الذي يفسد DNase و RNase. بعد ذلك ، أضف الإيثانول وانقل العينة إلى عمود دوران السيليكا.

يساعد الإيثانول الحمض النووي على الارتباط بالسيليكا. الطرد المركزي العينة. الآن ، انقل العمود إلى أنبوب طرد مركزي دقيق جديد وأضف مخزن مؤقت للشطف إلى العمود لتصفية الحمض النووي.

الطرد المركزي العينة وتجاهل العمود. انقل العينة إلى أنبوب PCR وقم بتشغيل تفاعل البوليميراز المتسلسل لتضخيم الحمض النووي. قم بتحميل الحمض النووي على هلام الاغاروز وقم بإجراء الرحلان الكهربائي لتحديد حجم الحمض النووي الميكروبي. في البروتوكول التالي ، سنقوم بعزل الحمض النووي من البراز لتحليل تأثير كفاءة الطاقة على ميكروبات القولون في الفأر الورمي.

- استخدم مجموعة تجارية لعزل الحمض النووي الميكروبي من البراز باتباع بروتوكول الكشف عن مسببات الأمراض في البراز. عند القيام بذلك ، انقل العينات من الفريزر 80 درجة مئوية تحت الصفر على الثلج الجاف ووزنها. بعد ذلك ، قم بإعداد تفاعل البوليميراز المتسلسل الذي يضخم الحمض النووي الميكروبي كما هو موضح في بروتوكول النص. ثم قم بتنظيف منتجات التفاعل باستخدام الخرز المغناطيسي.

للتنظيف ، أولا ، قم بالطرد المركزي لفترة وجيزة للوحة Amplicon PCR لسحب منتجات التفاعل. بعد ذلك ، قم بتدوير الخرزات المغناطيسية لتفريقها بالتساوي ونقل 20 ميكرولترا إلى كل تفاعل جيدا. امزج الخرزات مع المحلول جيدا عن طريق سحب الحجم بالكامل ببطء 10 مرات. ثم اترك الخرزات تستقر لمدة 5 دقائق.

بعد ذلك ، ضع لوحة PCR على حامل مغناطيسي وانتظر دقيقتين حتى يتم مسح المواد الطافية بعد الجمع المغناطيسي للخرز. ثم قم بإزالة المواد الطفية والتخلص منها. بعد ذلك ، مع بقاء اللوحة على المغناطيس ، املأ كل بئر من الخرز ب 200 ميكرولتر من الإيثانول الطازج بنسبة 80 في المائة وانتظر 30 ثانية. ثم قم بإزالة المادة الطافية بعناية.

كرر خطوة الغسيل هذه مرة واحدة واترك الخرزات تجف في الهواء لمدة 10 دقائق. الآن ، قم بإزالة نواتج التفاعل من الخرزات عن طريق إزالة اللوحة من الحامل المغناطيسي وإضافة 52.5 ميكرولتر من Tris إلى كل بئر. امزج الخرزات تماما في المحلول عن طريق سحب الحجم بالكامل ببطء 10 مرات. بعد ذلك ، اجمع الخرزات على الحامل المغناطيسي كما كان من قبل وانقل 50 ميكرولترا من المواد الطافية إلى لوحة PCR نظيفة. غطي الطبق بمادة لاصقة شفافة واحفظيه على حرارة 20 درجة مئوية تحت الصفر لمدة تصل إلى أسبوع واحد.