JoVE Encyclopedia of Experiments
أبحاث السرطان
0 مشاهدات • 4:55 د • April 30th, 2023
- العضيات عبارة عن تركيبات خلوية ثلاثية الأبعاد في المختبر تنظم ذاتيا لتقليد خصائص الأنسجة الرئيسية لعضوها الأصلي. لبدء وضع العلامات ، عالج العضيات المحصودة بكوكتيل إنزيم محلل للبروتين وتحليل الكولاجينات لفصل الخلايا في تعليق. جهاز طرد مركزي لفصل الخلايا عن المادة الطافية المحتوية على الإنزيم. تخلص من المادة الطافية. قم بإذابة حبيبات الخلية باستخدام وسيط يحتوي على نواقل الفيروسات العدسية. تحمل هذه الفيروسات المؤتلفة تسلسل الترميز لبروتين الفلورسنت الأخضر أو GFP.
تندمج الفيروسات مع الخلايا وتطلق مادتها الوراثية وبعض الإنزيمات الفيروسية في السيتوبلازم. يصنع النسخ العكسي الفيروسي الحمض النووي الفيروسي التكميلي الذي ينتقل إلى نواة المضيف. يساعد التكاملات الفيروسية على دمج الحمض النووي الفيروسي المحتوي على تسلسل GFP في جينوم المضيف. قم بزراعة هذه الخلايا المنقولة في مصفوفة خارج الخلية أو صفيحة ثقافة مطلية ب ECM. استنشق الوسط وجهاز الطرد المركزي لجمع أي خلايا غير متصلة. أعد تعليق الخلايا في ECM إضافية.
تراكب التعليق على الثقافة الملتصقة لتعزيز صلاحية الخلية. بمجرد أن تصلب المصفوفة ، أضف وسيط الاستزراع واحتضانه لتسهيل تكوين العضوية. راقب الثقافة تحت المجهر الفلوري. تقوم الخلايا المنقولة بتصنيع البروتينات الفلورية الخضراء. تظهر العضيات المتكونة من هذه الخلايا إيجابية GFP. يوضح البروتوكول التالي نقل الفيروسات العدسية GFP إلى الخلايا العضوية لسرطان القولون والمستقيم المشتقة من المريض.
- بعد 7 إلى 10 أيام من الثقافة ، افصل العضيات ميكانيكيا باستخدام مكشطة خلية معقمة وانقل العضيات إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 مليلتر لطردها المركزي. بعد ذلك ، أعد تعليق الكريات في 500 ميكرولتر من PBS مع النقر اللطيف لجهاز طرد مركزي آخر. لفصل عضيات سرطان القولون والمستقيم ، أضف 500 ميكرولتر من محلول الإنزيم المحلل للبروتين والتحلل الكولاجيني إلى الأنابيب واخلطها مع النقر اللطيف.
بعد 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة ، أضف 500 ميكرولتر من الوسط المكمل بنسبة 1٪ FBS إلى الخلايا ، وقم بسحب تعليق الخلية برفق عدة مرات لتفتيت العضيات.
- يعد سحب العينة اللطيف لعضويات CRC البشرية أثناء المرور أمرا بالغ الأهمية للحفاظ على تكوين كروي سليم في الثقافة.
- قم بالطرد المركزي للخلايا مرة أخرى وأعد تعليق الكريات في 100 ميكرولتر من مخزون 5x GFP من الفيروسات العدسية و 400 ميكرولتر من وسط الثقافة العضوية الطازجة لسرطان القولون والمستقيم.
- من الضروري إصابة عضيات CRC البشرية بعيار عال من فيروس العدسات GFP ، خاصة لتحقيق كفاءة عدوى بنسبة 100٪ تقريبا.
- اضبط الحجم في كل أنبوب لتحقيق 5 أضعاف 10 إلى الخلية السرطانية الخامسة المنفصلة لكل 500 ميكرولتر من التركيز المتوسط ، وقم بوضع 500 ميكرولتر من الخلايا في كل بئر من صفيحة مصفوفة اصطناعية خارج الخلية مطلية ب 12 بئرا كما هو موضح. بعد 18 ساعة في حاضنة زراعة الخلايا ، قم بنقل المواد الطافية المحتوية على الخلايا العائمة إلى أنابيب طرد مركزي دقيقة فردية سعة 1.5 مليلتر للطرد المركزي ، متبوعة بإعادة تعليق الكريات في 70 ميكرولترا من المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية لكل أنبوب على الجليد.
لتعزيز صلاحية خلايا سرطان القولون والمستقيم ، قم بتراكب المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية المحتوية على الخلايا السرطانية على عضيات الورم في الصفيحة المكونة من 12 بئرا وضع اللوحة في حاضنة زراعة الخلايا لمدة 30 دقيقة. عندما يتجمد طلاء المصفوفة الاصطناعية خارج الخلية ، قم بتغذية الثقافات ب 1 ملليلتر من وسط الاستزراع العضوي الطازج CRC المكمل بنسبة 1٪ FCS وأعد الخلايا إلى حاضنة زراعة الخلايا لمدة ثلاثة أيام. بعد ذلك ، راقب الخلايا المصابة عن طريق الفحص المجهري الفلوري لتأكيد إيجابية GFP بنسبة 100٪ تقريبا وإعادة الخلايا إلى الحاضنة لمدة 4 إلى 6 أيام أخرى.