مقايسة الفوسفاتيز في خلايا سرطان القولون والمستقيم: طريقة لفحص حالة فسفرة بروتين تاو في خلايا سرطان القولون والمستقيم

- يتوجب بروتين تاو محيطيا في النواة في خلايا سرطان القولون والمستقيم ويساعد في الحفاظ على بنية النواة. في الغالب ، تعبر هذه الخلايا عن بروتين تاو مفرط الفسفرة ، مما يؤدي إلى مقاومة الأدوية. وبالتالي ، نقوم بتحليل مستويات فسفرة تاو عن طريق إجراء فحص الفوسفاتيز.

ابدأ بأخذ محللة الخلية التي تحتوي على البروتين الكلي من خلايا سرطان القولون والمستقيم البشرية في قارورتين مصنفتين على أنهما اختبار وتحكم. عالج عينة الاختبار بإنزيم الفوسفاتيز القلوي. يزيل الفوسفاتيز القلوي مجموعات الفوسفات من تاو ، بينما تحتفظ قارورة التحكم ببروتين تاو الفسفري.

بعد ذلك ، قم بتشغيل كل من العينة والتحكم في تاو على هلام بولي أكريلاميد لفصل البروتينات. يتحرك تاو الفسفوري بشكل أبطأ على الجل من بروتين تاو غير الفسفري. قم بإزالة اللطخة الكهربائية لعينة البروتين إلى غشاء مناسب وإضافة الأجسام المضادة الأولية المقابلة لكل من تاو الفسفرة والعادية.

احتضن اللطخة بين عشية وضحاها. عالج اللطخة بالجسم المضاد الثانوي المترافق مع إنزيم المراسل الذي يرتبط بمنطقة Fc من الجسم المضاد الأولي. أخيرا ، قم بتطوير اللطخة باستخدام الركيزة الكيميائية لتحديد بروتين تاو من إجمالي عينة البروتين الموجودة في اللطخة. في البروتوكول التالي ، سنوضح مقايسة الفوسفاتيز لتقييم حالة الفسفرة الإجمالية لتاو في خلايا CRC.

- بعد تحضير عينات تحتوي على 20 ميكروغراما من البروتين الكلي ، أضف ميكرولترين من محلول الفوسفاتيز القلوي و 10 ميكرولتر من الفوسفاتيز القلوي لكل منهما. ثم أضف الماء المقطر بحيث يكون الحجم النهائي لكل عينة 20 ميكرولترا.

احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. أثناء احتضان العينات ، قم بإعداد عينات إضافية بنفس التركيز ، ولكن بدون فوسفاتيز للمقارنة. بعد ساعة واحدة ، أوقف التفاعل بإضافة EDTA بتركيز نهائي قدره 50 ملليمولات ، أو أورثوفاناديت الصوديوم بتركيز نهائي يبلغ 10 ملليمول.

أضف المخزن المؤقت لتحميل هلام 4X SDS المحضر حديثا والذي يحتوي على 400 مللي مولار DTT. باستخدام كتلة حرارية ، احتضن العينات عند 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق. قم بتدوير العينات ثم اتركها تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة.

بعد ذلك ، قم بتحميل 13 ميكرولترا من العينة لكل بئر بالإضافة إلى سلم الوزن الجزيئي على هلام بولي أكريلاميد بنسبة 10٪. قم بتوصيل نظام الرحلان الكهربائي بمصدر طاقة واضبط الجهد على 70 فولت لمدة 20 دقيقة لنقل عينات البروتين من هلام التكديس إلى هلام الحل.

بعد ذلك ، قم بزيادة إلى 125 فولت وقم بتشغيل الجل لمدة 70 إلى 120 دقيقة تقريبا ، حتى تصل العينات وسلم البروتين إلى نهاية الجل. باستخدام نظام النشاف الكهربائي الرطب ، انقل الجل إلى غشاء فلوريد البولي فينيلدين عند 100 فولت لمدة 100 دقيقة تقريبا.

بعد ذلك ، قم باحتضان الغشاء لتلطخ ألبومين مصل البقر بنسبة 4٪ لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. احتضان اللطخة طوال الليل في محلول الجسم المضاد الأولي عند 4 درجات مئوية. في اليوم التالي ، اغسل اللطخة ثلاث مرات في PBST ، واغسلها لمدة سبع دقائق في كل مرة.

احتضن في محلول الأجسام المضادة الثانوية ذات الصلة لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسلها باستخدام PBST أربع مرات ، مع كل غسلة لمدة سبع دقائق. قم بتطوير اللطخة باستخدام مجموعة تلألؤ كيميائي وفقا لتعليمات الشركة المصنعة.

قم بتغطية اللطخة المطورة بغلاف بلاستيكي شفاف ثم احصل على صور تلألؤ كيميائي للبقعة باستخدام نظام تصوير التلألؤ الكيميائي المتاح تجاريا.