JoVE Encyclopedia of Experiments
أبحاث السرطان
0 مشاهدات • 4:28 د • April 30th, 2023
- تاو هو بروتين مرتبط بالأنابيب الدقيقة يشارك في تثبيت وتجميع الأنابيب الدقيقة. تعبر العديد من الخلايا السرطانية عن بروتين تاو مفرط الفسفرة ، والذي يفشل في الحفاظ على ارتباط الأنابيب الدقيقة المنظم جيدا. لدراسة التفاعل بين بروتين تاو والأنابيب الدقيقة ، أضف محللة الخلايا السرطانية التي تحتوي على بروتين تاو ومحلول عمل الأنابيب الدقيقة في أنبوب الطرد الدقيق.
ترتبط بروتينات تاو غير الفسفرية الموجودة في محللة الخلية بالأنابيب الدقيقة. الآن ، أضف الكمية المطلوبة من المخزن المؤقت PEM في الأنبوب لتحقيق الاستقرار في نشاط التوبولين ، وهو بروتين يتبلمر في خيوط لتكوين أنابيب دقيقة. احتضان الخليط للمدة المطلوبة.
الطرد المركزي الخليط لحبيبات البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة. يبقى البروتين غير المرتبط في المادة الطافية. انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد ، وأعد تعليق الحبيبات في مخزن مؤقت مناسب. أضف عازلة تحميل هلام إلى تعليق الحبيبات المعاد تعليقه وقم بتشغيل العينات على هلام بولي أكريلاميد لفصل البروتين المرتبط بالأنابيب الدقيقة واللطخة الكهربائية على غشاء مناسب.
أضف أجساما مضادة مناسبة وقم بتطوير اللطخة باستخدام ركيزة التلألؤ الكيميائي لتحديد بروتينات تاو المرتبطة. في البروتوكول التالي ، سنقوم بإجراء مقايسة ربط الأنابيب الدقيقة لتحديد البروتينات المرتبطة بالأنابيب الدقيقة.
- بعد تحضير عينات طازجة ، احتضنها على حرارة 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. جهاز الطرد المركزي الفائق للعينات عند 100,000 × جم و 25 درجة مئوية لمدة 60 دقيقة. بعد ذلك ، انقل 120 ميكرولترا من كل مادة طافية تحتوي على تاو غير مرتبط لفصل الأنابيب النظيفة والملصقة. أضف 120 ميكرولتر من المخزن المؤقت للعينة 5X إلى الحبيبات التي تحتوي على تاو المقيد.
بعد الخلط جيدا عن طريق الدوامة والماصة ، انقل الخليط إلى أنابيب نظيفة ذات علامات. بعد تحضير عينات من تركيز البروتين المكافئ ، أضف 4X SDS جديد لتحميل الهلام يحتوي على 400 ملليمولار DTT. استخدم كتلة حرارية لاحتضان العينات عند 100 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.
قمبتدوير العينات ، ثم اتركها تبرد في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 إلى 15 دقيقة. قم بتحميل 13 ميكرولترا من العينة لكل بئر وسلم الوزن الجزيئي على هلام بولي أكريلاميد بنسبة 10٪. قم بتوصيل الأقطاب الكهربائية الموجبة والسالبة لنظام الرحلان الكهربائي بمصدر طاقة ، ثم اضبط الجهد على 70 فولت لمدة 20 دقيقة.
بعد ذلك ، قم بزيادة إلى 125 فولت وقم بتشغيل الجل لمدة 70 إلى 120 دقيقة تقريبا حتى تصل العينات وسلم البروتين إلى نهاية الجل. استخدم نظام النشاف الكهربائي الرطب لنقل الجل إلى غشاء فلوريد البولي فينيلدين عند 100 فولت لمدة 100 دقيقة تقريبا. احتضان الغشاء لتلطخ في 4٪ ألبومين مصل البقر لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم احتضن طوال الليل في محلول الأجسام المضادة الأولية عند 4 درجات مئوية.
في اليوم التالي ، اغسل اللطخة أربع مرات باستخدام PBST مع كل غسلة تستمر سبع دقائق. احتضان اللطخة المغسولة في محلول الجسم المضاد الثانوي ذي الصلة لمدة 90 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسلها باستخدام PBST لمدة سبع دقائق مع تكرار الغسيل أربع مرات. قم بتطوير اللطخة باستخدام مجموعة تلألؤ كيميائي. قم بتغطيتها بغلاف بلاستيكي شفاف واحصل على الصور باستخدام نظام التصوير الكيميائي
.