فحص الهيكل الخلوي وتنظيم الالتصاق البؤري: طريقة قائمة على التألق المناعي لدراسة التصاق الخلايا وانتشارها على الركائز

- يؤثر مورفولوجيا الركيزة بشكل كبير على سلوك الخلايا السرطانية واستجابات النقيلية. توفر الشبكة الديناميكية للهيكل الخلوي للأكتين الدعم الهيكلي للخلايا وتتوسط الحركة الخلوية. تربط مجمعات البروتين الكبيرة المرتبطة بالغشاء والتي تسمى الالتصاقات البؤرية الهيكل الخلوي بالمصفوفة خارج الخلية ، مما يسهل انتشار الخلايا.

لبدء التلوين ، خذ مزرعة الخلايا السرطانية ، وعالجها ببارافورمالدهيد لإصلاح الخلايا وتنفاذها. الآن ، احتضان الخلايا بكاشف محسن الإشارة يحتوي على بروتينات لإعداد الخلايا لتقليل تلطيخ الخلفية. أضف الأجسام المضادة الأولية المضادة للفينكولين التي ترتبط بالفينكولين ، أحد البروتينات الموجودة في مركب الالتصاق البؤري.

بعد ذلك ، احتضان العينة بجسم مضاد ثانوي مترافق بصبغة فلورية يستهدف الجسم المضاد الأساسي. أخيرا ، عالج الخلايا بمرافقات الفالويد الموسومة بالفلورسنت والتي ترتبط بشكل انتقائي بخيوط الأكتين في الهيكل الخلوي. راقب الخلايا تحت مجهر المسح الضوئي بالليزر متحد البؤر لدراسة إشارات الفلورسنت الخاصة بها.

تظهر

الخلايا ذات التشكل المنتشر جيدا ألياف أكتين محددة وتقدم التصاقات بؤرية مميزة وممدودة تحتوي على الفينكولين. على العكس من ذلك ، لا تمتلك الخلايا سيئة الانتشار خيوط أكتين محددة ، ولكنها تعرض التصاقات بؤرية تحتوي على فينكولين نقطية. في البروتوكول التالي ، سنعرض مقايسة التألق المناعي لدراسة الهيكل الخلوي وتنظيم الالتصاق البؤري في خلايا سرطان القولون الأولية.

- خذ الركائز ليتم تلطيخها بالمناعة على الغطاء الرقائقي وقم بإزالة وسائط الزراعة. بعد ذلك ، اشطف الركائز بمحلول ملحي مخزن بالفوسفات ، أو PBS ، وقم بإصلاح الخلايا بنسبة 4٪ بارافورمالدهيد في PBS لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. اغسل الركائز باستخدام PBS لمدة خمس دقائق بإجمالي ثلاث مرات. بعد ذلك ، قم باحتضان الركائز ب 500 ميكرولتر من محسن الإشارة لمدة 30 دقيقة قبل شطفها باستخدام PBS.

بعد ذلك ، قم باحتضان الخلايا بجسم مضاد أحادي النسيلة مضاد للفينكولين عند تخفيف من 1 إلى 250 في PBS لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الركائز باستخدام PBS لمدة خمس دقائق بإجمالي ثلاث مرات. احتضان العينات بجسم مضاد ثانوي Alexa Fluor 488 IgG مضاد للفأر عند تخفيف من 1 إلى 200 في PBS في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. ثم اغسل الركائز مرة أخرى باستخدام PBS لمدة خمس دقائق بإجمالي ثلاث مرات.

لتصور بنية F-actin ، احتضان الخلايا بمرافقات رباعي ميثيل رودامين فالويدين بتركيز 50 ميكرولتر لكل مليلتر لمدة 45 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. ثم اغسل الركائز مرة أخرى كما كان من قبل. أخيرا ، تابع تصوير العينات باستخدام مجهر ليزر ماسح متحد البؤر.