موسوعة JoVE للتجارب
أبحاث السرطان
0 مشاهدة • 6:00 دقيقة • April 30th, 2023
- يكتشف HCR-FISH ، أو تفاعل التهجين المتسلسل - التألق في الموقع ، تسلسلات الحمض النووي الفيروسي داخل جينوم الخلايا المصابة بالفيروس. للبدء ، قم بإصلاح ثقافة ملتصقة للخلايا المصابة بالفيروس واختراق غشاء خلياها. احتضان الخلايا بمخزن مؤقت تهجين لتقليل أي إشارة في الخلفية. عالج الخلايا بمجسات بادئ تحمل تسلسل بادئ HCR وتسلسل تكميلي يستهدف الحمض النووي الفيروسي. قم بتسخين العينة لتشويه طبيعة الحمض النووي المضيف مزدوج الشريطة إلى الحمض النووي أحادي الشريطة. احتضان العينة للسماح للمسبار بالارتباط بتسلسل الحمض النووي الفيروسي المستهدف التكميلي.
بعد ذلك ، عالج بمخزن مؤقت للتضخيم يحتوي على مجموعتين من مجسات دبوس شعر قليل النوكليوتيدات المسمى بالفلورسنت ، H1 و H2. احتضان لتسهيل تفاعل سلسلة التهجين. يرتبط تسلسل البادئ غير المزاوج بذيله H1 التكميلي ، مما يضفي خطية على بنية دبوس الشعر. يرتبط تسلسل H1 المكشوف بالمثل بذيله H2 التكميلي. يستمر H2 الزائدة في الارتباط بذيل H1. بهذه الطريقة ، تتضخم المجسات ذات العلامات الفلورية حول الموقع المستهدف ، مما ينبعث منها إشارة قوية. عالج العينة باستخدام DAPI لتلطيخ نوى الخلية.
استخدم مجهر مضان للكشف عن التألق الساطع من بؤر النسخ المتماثل داخل نوى الخلايا المصابة. في البروتوكول التالي ، سنعرض أسماك HCR-DNA في الموقع للكشف عن جينوم فيروس ورم خلية ميركل في خلايا الجلد البشري الأولية المصابة.
- أولا ، قم بتثبيت الخلايا على زلات الغطاء مع 4٪ PFA في PBS لمدة 10 دقائق. بعد ذلك ، اغسل زلات الغطاء مرتين باستخدام PBS وعالجها بنسبة 70٪ من الإيثانول عند 4 درجات مئوية طوال الليل لاختراق الخلايا. في اليوم التالي ، استبدل الإيثانول بمخزن مؤقت لترطيب المسبار واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 60 دقيقة لتهجين العينات مسبقا. قبل 30 دقيقة من نهاية حضانة ما قبل التهجين ، قم بتخفيف المجسات في محلول تهجين المسبار عند تخفيف 1: 500 واحتضانها عند 45 درجة مئوية.
عند اكتمال الحضانات ، ضع الماصة ما يقرب من 10 ميكرولترات من خليط المسبار المخفف على شريحة مجهرية لكل زلة غطاء. ضع كل زلة غطاء ، بحيث يكون جانب الخلية لأسفل ، على قطرة مزيج التهجين الخاصة بها. باستخدام كمية كبيرة من الأسمنت المطاطي ، قم بإغلاق حواف وظهر كل زلة غطاء إلى شريحتها. ضع الشرائح على الجانب المسطح من كتلة الحرارة وقم بتسخينها إلى 94 درجة مئوية لمدة 3 دقائق. بعد ذلك ، انقل الشرائح إلى غرفة رطبة واحتضانها عند 45 درجة مئوية طوال الليل.
في اليوم التالي ، استخدم الملقط لتقشير الأسمنت المطاطي بعناية. ضع زلات الغطاء ، بحيث يكون جانب الخلية لأعلى ، في آبار لوح مكون من 24 بئرا واغسلها باستخدام محلول غسيل المسبار ثلاث مرات في درجة حرارة الغرفة. أضف 200 ميكرولتر من مخزن التضخيم إلى كل بئر يحتوي على زلة غطاء واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 إلى 60 دقيقة. وفي الوقت نفسه ، قم بتلدين كل من دبابيس الشعر قليلة النوكليوتيد المسماة للتعرف على المجسات في أنابيب PCR منفصلة عن طريق تسخينها إلى 95 درجة مئوية لمدة 90 ثانية ثم تبريدها إلى درجة حرارة الغرفة لمدة 30 دقيقة. امزج دبابيس الشعر معا في مخزن مؤقت للتضخيم عند تخفيف 1:50.
بعد ذلك ، قم بتمديد فيلم البارافين على الوجه المفتوح لغطاء لوح مكون من 12 بئرا لعمل سطح لتفاعل التضخيم. الماصة 50 إلى 100 ميكرولتر قطرات من خليط دبوس الشعر على طبقة البارافين لكل زلة غطاء. باستخدام الملقط ، قم بإزالة كل زلة غطاء بعناية من محلول التضخيم المسبق ولمس الحافة بمنديل مسامي يمكن التخلص منه حتى يجف. ضع كل زلة غطاء مجففة ، بحيث يكون جانب الخلية لأسفل ، على قطرة تضخيم. انقل غطاء اللوحة إلى غرفة رطبة واحتضنه طوال الليل في درجة حرارة الغرفة وفي الظلام.
في اليوم التالي ، أعد زلات الغطاء إلى آبار اللوحة المكونة من 24 بئرا. أضف 5x DAPI المحتوي على SSCT بتركيز 0.5 ميكروغرام لكل مليلتر لكل بئر واحتضانه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة. بعد ذلك ، اغسل العينات مرتين باستخدام 5x SSCT في درجة حرارة الغرفة. قم بتركيب زلات الغطاء المغسول على شرائح المجهر، واستخدم مجهر فلوري مقلوب لتحليل الخلايا وتصوير العينات.