عزل الخلايا الكيراتينية في جلد الإنسان: طريقة لزراعة الخلايا الكيراتينية الأولية من عينات الجلد

- الخلايا الكيراتينية هي أبرز الخلايا الموجودة في البشرة ، أو الطبقة الخارجية من الجلد. ترتب نفسها في طبقات متعددة فوق الأدمة ، مرتبطة بأنواع مختلفة من الخلايا الأخرى مثل الخلايا الصباغية والخلايا المتغصنة وخلايا الميركل.

لعزل الخلايا الكيراتينية ، ابدأ بأخذ أنسجة البشرة من جلد الإنسان. بعد ذلك ، تعامل مع عازلة الهضم الأنزيمية. تعمل الإنزيمات الموجودة في المخزن المؤقت على تحلل بروتينات المصفوفة خارج الخلية الموجودة في أنسجة البشرة ، وبالتالي تبدأ في تفكك الخلايا. الآن ، أضف وسيطا مناسبا وقم بتعطيل الأنسجة ميكانيكيا.

لتحرير الخلايا المنفصلة في معلقة ، قم بتصفية معلق خلايا البشرة من خلال مصفاة لإزالة أي كتل أو حطام من الخلايا. جهاز طرد مركزي لتكوير خلايا البشرة وفصلها عن المادة الطافية المحتوية على الإنزيم. قم بإزالة المادة الطافية وإعادة تعليق الخلايا باستخدام وسط نمو الخلايا الكيراتينية المفضل. استزراع الخلايا للمدة المطلوبة.

أثناء الاستزراع ، تثري الوسائط المحسنة توسع الخلايا الكيراتينية من خلال تعزيز نموها الانتقائي على أنواع خلايا البشرة الأخرى. في البروتوكول التالي ، سنعرض عزل الخلايا الكيراتينية عن أنسجة الجلد البشري البالغة.

- اجمع عينات جلدية بحجم 10 سم × 15 سم من المتطوعين البالغين الأصحاء الذين يخضعون لجراحة تجميلية. حافظ على برودة الجلد عن طريق نقل عينات الجلد في صندوق الستايروفوم الذي يحتوي على عنصر تبريد. إذا لزم الأمر ، قم بتخزين عينة الجلد على حرارة 4 درجات مئوية طوال الليل. باستخدام مقص ومشارط وملقط معقم ، قم بإزالة الدهون من تحت قسم الجلد.

ثم ، باستخدام الإبر ، اربط قسم الجلد على غطاء معقم أعلى لوحة. باستخدام وسادة شاش جافة ومعقمة ، نظف الجلد. ثم اتبع 70٪ من الإيثانول على وسادة شاش معقمة. بعد ذلك ، باستخدام مسوي القدم ، قم بقطع طبقة البشرة العليا من قسم الجلد ، وانقلها إلى طبق بتري 9 سم.

ثم أضف على الفور 25 مل من محلول DPBS / التربسين / الجلوكوز المعد مسبقا إلى طبق بتري. احتضان العينات عند 37 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة. باستخدام ماصة، قم بإزالة محلول DPBS/التربسين/الجلوكوز من طبق بتري وأضف 10 ملليلتر من RPMI-1640 بالإضافة إلى 2٪ FBS لتعطيل التربسين.

الآن ، باستخدام ملقطين ، حرر خلايا البشرة في الوسط عن طريق كشط وتحريك كل من البشرة والحيز الجلدي لأقسام الجلد برفق. قم بتصفية تعليق خلية البشرة من خلال مرشح معدني واجمع المرشح في أنبوب سعة 50 مل. أضف أقسام الجلد المتبقية إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على 10 مل من RPMI-1640 بدون FBS والدوامة لمدة 10 ثوان.

قم بتصفية هذا التعليق من خلال المرشح المعدني إلى أنبوب سعة 50 مليلتر يحتوي على تعليق خلايا البشرة. ثم أضف DPBS إلى الحجم الإجمالي البالغ 50 ملليلترا. الطرد المركزي لتعليق الخلية عند 450 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق. ثم, قم بإزالة المادة الطافية, واعتمادا على حجم حبيبات الخلية, أعد تعليق حبيبات خلية البشرة في حوالي 10 ملليلتر من 37 درجة مئوية KSFM.

باستخدام طريقة تلطيخ Trypan Blue ، عد الخلايا تحت المجهر. بعد ذلك ، إلى كل قارورة مزرعة 75 سم مربع ، انقل 8 مرات 10 إلى الخلايا السادسة مع 12 مل من 37 درجة مئوية KSFM. رج قوارير الثقافة برفق لضمان التوزيع المنتظم للخلايا. احتضان الخلايا الكيراتينية في حاضنة 37 درجة مئوية برطوبة 100٪ و 5٪ ثاني أكسيد_{الكربون 2}. قم بتغيير الوسيط بعد يومين ، ثم 3 مرات أسبوعيا.