الاستزراع السريع للخلايا الصباغية الأولية والخلايا الليفية في الفئران: عزل الخلايا الصباغية والخلايا الليفية من عينة جلد الفئران الكاملة

- يتكون الجلد من خلايا مختلفة تملأ طبقاته المختلفة. الخلايا الصباغية ، الخلايا المنتجة للميلانين ، موضعية عند تقاطع البشرة والجلد ، بينما توجد الخلايا الليفية ، الخلايا المولدة للنسيج الضام ، في الأدمة.

لعزل الخلايا الصباغية والخلايا الليفية بسرعة ، ابدأ بأخذ جذع جرو فأر قتل رحيم. قطع الجلد بطنيا من خلال طول الجذع. قشر الجلد الذي يحتوي على طبقة البشرة والجلد وافرم الأنسجة إلى قطع صغيرة.

الآن ، عالج باستخدام عازل الهضم الذي يحتوي على إنزيمات التربسين والكولاجيناز التي تحلل المصفوفة خارج الخلية ، وتطلق الخلايا في حالة تعليق. جهاز طرد مركزي لتكوير الخلايا والتخلص من المادة الطافية. أعد تعليق الخلايا في وسط الخلايا الصباغية وانقل التعليق إلى صفيحة متعددة الآبار.

أثناء الزراعة ، تلتصق معظم الخلايا الليفية بقاع البئر ، بينما تظل الخلايا الصباغية وخلايا البشرة الأخرى معلقة. استنشق الخلايا العالقة وأضف وسائط خاصة بالخلايا الليفية إلى مزرعة الخلايا الليفية لتعزيز نموها. انقل المعلق المستنشق إلى بئر جديد مطلي بالكولاجين للمساعدة في تكوين ثقافة ملتصقة.

مكمل مع الوراثة ، وهو مضاد حيوي ، وأضف وسائط نمو الخلايا الصباغية الطازجة. يقضي Geneticin بشكل انتقائي على أي خلايا ليفية متبقية ، بينما تعزز الوسائط نمو الخلايا الصباغية على أنواع خلايا البشرة الأخرى. في البروتوكول التالي ، سنقوم بعزل الخلايا الصباغية والخلايا الليفية من جلد جرو الفئران.

- في خزانة التدفق الصفحي ، قم بلف جذع كل فأر تم القتل الرحيم لفترة وجيزة في طبق بتري معقم يحتوي على 70٪ إيثانول. أخرج الماوس من الإيثانول وضعه في طبق بتري معقم فارغ. بعد ذلك ، قم بتعقيم المقص الجراحي في 70٪ من الإيثانول. استخدم هذا المقص لعمل شق في الجلد على الجانب البطني من الجذع ، بدءا من الرقبة ويستمر إلى الذيل. باستخدام ملقط معقم ، قشر الجلد بعيدا عن جذع الفأر وقم بإزالة الأنسجة الدهنية الزائدة من الجانب الجلدي من الجلد.

ضع الجلد ، بحيث يكون جانب الأدمة لأسفل ، في طبق مكون من 6 آبار يحتوي على 3 ملليلتر من محلول مضاد حيوي / مضاد للفطريات 1x. احتضن في درجة حرارة الغرفة لمدة 2 إلى 3 دقائق. بعد ذلك ، قم بتشغيل مفرمة المناديل واضبط الإعدادات على تلك الموضحة هنا.

- تأكد من توخي الحذر عند تركيب شفرة مفرمة المناديل وعند تشغيل الماكينة.

- انقل الجلد ، بحيث يكون جانب الأدمة لأسفل ، إلى طبق مفرمة مناديل معقمة وقم بتمرير الجلد بالكامل عبر مفرمة المناديل ثلاث مرات. بعد ذلك ، انقل الجلد المتجانس إلى أنبوب مخروطي معقم سعة 15 مليلتر يحتوي على 3 ملليلتر من محلول هضم الجلد.

باستخدام ماصة دقيقة P1000، امزج التعليق الناتج عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل بقوة من عشر إلى خمس عشرة مرة. قم بتغطية الأنبوب المخروطي واحتضان العينة في حمام مائي عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة ، مع التأكد من قلب الأنبوب كل 3 إلى 5 دقائق.

بعد ذلك ، قم بالطرد المركزي للأنبوب في دوار دلو متأرجح عند 750 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق لتجانس الخلايا في الجلد. استخدم ماصة دقيقة P1000 لإزالة عازلة هضم الجلد ببطء وبشكل كامل ، مع الحرص على عدم إزعاج الحبيبات.

- تأكد من شفط كل عازلة هضم الجلد. إذا كنت تواجه مشكلة ، اغسل حبيبات الخلية ب 2 إلى 3 ملليلتر من وسط الخلايا الصباغية وكرر الطرد المركزي وقم بإزالة المخزن المؤقت لهضم الجلد الزائد.

- بعد ذلك ، قم بإعادة تعليق حبيبات الخلية تماما في 1 مليلتر من وسائط الخلايا الصباغية عن طريق سحب العينات لأعلى ولأسفل من خمسة عشر إلى عشرين مرة باستخدام ماصة P1000. انقل محلول الخلية الناتج إلى بئر غير مغلف في طبق مكون من 6 آبار يحتوي على 1 مليلتر من وسط الخلايا الصباغية. احتضان الجلد المطلي متجانس في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة 40 دقيقة.

بعد ذلك ، انقل المادة الطافية المزروعة من الطبق غير المطلي إلى بئر واحد من طبق 6 آبار مغطى بالكولاجين المغسول مسبقا. أضف G418 إلى الوسائط بحيث يكون التركيز النهائي 100 نانوجرام لكل ملليلتر. أضف 2 مل من وسائط الخلايا الليفية إلى بئر واحد من الطبق غير المطلي ، والذي يحتوي الآن على الخلايا الليفية الملتصقة. احتضان كلتا المزرعتين طوال الليل في حاضنة زراعة الأنسجة عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

بعد 16 إلى 24 ساعة من الحضانة ، قم بشفط الوسائط وأي حطام من كل ثقافة بشكل منفصل. اغسل كل طبق مرتين باستخدام 1 ملليلتر من PBS لكل غسلة. ثم أضف 2 مل من وسائط الخلايا الصباغية الطازجة إلى ثقافة الخلايا الصباغية ، وأضف 2 مل من وسائط الخلايا الليفية الطازجة إلى ثقافة الخلايا الليفية.