تحضير فيريون فيروس ورم خلية ميركل المؤتلف (MCPyV): تقنية لإنتاج فيريون MCPyV المؤتلف عالي العيار

- فيروس ورم خلية ميركل ، أو MCPyV ، هو فيروس ورم الحمض النووي مزدوج الشريطة مع جينوم دائري يسبب سرطان خلايا ميركل ، وهو نوع من سرطان الجلد. لتحضير فيروسات MCPyV ، أولا ، قم بمعالجة ثقافة ملتصقة لخلايا التعبئة بكوكتيل يحتوي على عامل تعداء ، والجينوم الفيروسي ، واثنين من البلازميدات المشفرة للبروتينات المطلوبة لتعزيز تكاثر الفيروس.

أثناء الحضانة ، يشكل كاشف التعدين lypoplexes مع البلازميدات ، مما يسهل توصيلها إلى خلايا التغليف. بمجرد دخولها إلى النواة ، تسمح آلية الخلية بالتعبير عن الجينومات الفيروسية والبلازميد. يشفر تعبير البلازميدات مستضد الورم الكبير وبروتينات المستضد الورمي الصغير. تنتقل هذه البروتينات إلى النواة وتدفع تكرار الحمض النووي الفيروسي. بعد ذلك ، يقوم الجينوم الفيروسي بتشفير بروتينات القفيصة الهيكلية. تنتقل هذه البروتينات إلى النواة وتساعد في تجميع الفيروسات المؤتلفة.

بعد ذلك ، حصاد الخلايا المستزرعة. عالجها بمحلول يحتوي على منظف و DNase. يعمل المنظف على تحلل الخلايا لإطلاق الفيروسات. يحط DNase أي حمض نووي بلازميد حر من التعليق. جهاز طرد مركزي لفصل الحطام الخلوي في الحبيبات. قم بتحميل المادة الطافية المحتوية على الفيروس في أنبوب يحمل وسط تدرج كثافة مناسب. جهاز الطرد المركزي للحصول على كسور مركزة غنية بالفيريون داخل وسط التدرج.

في البروتوكول التالي ، سنعرض تحضير فيريونات MCPyV المؤتلفة عالية العيار باستخدام خلايا 293TT.

- في وقت متأخر من بعد الظهر أو في المساء ، قم بزرع 6 ملايين خلية 293TT-28 في طبق 10 سم يحتوي على وسط DMEM مكمل. احتضان عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون. في صباح اليوم التالي ، تأكد من أن الخلايا ملتقية بنسبة 50٪. بعد ذلك ، قم بنقل الخلايا ب 66 ميكرولتر من كاشف التعدي ، و 12 ميكروغراما من الحمض النووي المعزول ل MCPyV المعاد ربطه ، و 8.4 ميكروغرام من البلازميد pMtB للتعبير عن ST ، و 9.6 ميكروغرام من بلازميد التعبير LT pADL. احتضان الخلايا طوال الليل عند 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون.

في اليوم التالي ، عندما تكون الخلايا المنقولة متقاربة تقريبا ، قم بتربسين الخلايا ونقلها إلى طبق طوله 15 سم لاستمرار التوسع. عندما يصبح هذا الطبق ملتقى تقريبا ، انقل الخلايا إلى ثلاثة أطباق جديدة بحجم 15 سم. عندما تصبح هذه الأطباق الجديدة متقاربة تقريبا ، قم بحصاد الخلايا كما هو موضح في بروتوكول النص. جهاز طرد مركزي عند 180 × جم في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق. ثم قم بإزالة المادة الطافية وإضافة حجم خلية واحدة من DPBS-Mg.

أضف 25 ميكرومولار كبريتات الأمونيوم ، متبوعة ب 0.5٪ Triton X-100 ، و 0.1٪ بنزوناز ، و 0.1٪ من DNase المعتمد على ATP. تخلط جيدا وتحتضن على حرارة 37 درجة مئوية طوال الليل. في اليوم التالي ، قم بتبريد الخليط على الثلج لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك ، أضف 0.17 حجم من كلوريد الصوديوم. تخلط وتحتضن على الثلج لمدة 15 دقيقة أخرى. جهاز طرد مركزي عند 12000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إذا لم يكن المادة الطافية واضحة ، فقم بقلب الأنبوب برفق وكرر الطرد المركزي.

بعد ذلك ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب جديد. أعد تعليق الحبيبات في حجم واحد من DBPS مكملا ب 0.8 مول من كلوريد الصوديوم. جهاز طرد مركزي عند 12000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق. إذا لم يكن المادة الطافية واضحة ، فقم بقلب الأنبوب برفق وكرر الطرد المركزي. امزج بين الطافية وجهاز الطرد المركزي مرة أخرى عند 12000 × جم عند 4 درجات مئوية لمدة 10 دقائق.

بعد ذلك ، استخدم ماصة لإيداع تدرجات من اليوديكسونال في أنابيب بولي ألومر رقيقة الجدران سعة 5 مليلتر كما هو موضح في بروتوكول النص. قم بتحميل 3 ملليلتر من المادة الطافية الموضحة المحتوية على الفيروسات فوق التدرج اليودي المحضر. جهاز طرد مركزي مع دوار SW55ti عند 234,000 × جم وعند 16 درجة مئوية لمدة 3.5 ساعة ، مع التأكد من ضبط التسارع والتباطؤ على البطء. بعد اكتمال الطرد المركزي الفائق ، اجمع 12 جزءا في أنابيب السيليكون.