مقايسة تكوين مستعمرة الخلايا الكيراتينية: اختبار في المختبر لتقييم قدرة الخلايا الكيراتينية على النمو إلى مستعمرات

- يحدد اختبار تكوين المستعمرة قدرة الخلايا الفردية على التكاثر وتشكيل المستعمرات. ابدأ بجلد الفأر الظهري المستأصل في صفيحة المزرعة. اكشط الأنسجة تحت الجلد والدهون من الجانب البطني من الجلد. عالج الأنسجة بمحلول الهضم. تعمل الإنزيمات المحللة للبروتين في المحلول على تدهور المصفوفة خارج الخلية ، مما يؤدي إلى تفكك خلايا البشرة.

اكشط طبقة البشرة برفق لتحرير الخلايا والشعر المنفصل في وسط الحصاد. قم بتصفية المعلق من خلال مصفاة مناسبة لاحتجاز الشعر أو أي حطام والحصول على تعليق أحادي الخلية لخلايا البشرة. انقل الحجم المطلوب من معلق الخلية هذا إلى صفيحة مطلية بالكولاجين تحتوي على طبقة ملتصقة من خلايا التغذية التي توقف عن النمو. مكمل بوسائط مناسبة تفضل بقاء الخلايا الكيراتينية.

أثناء الثقافة ، تلتصق الخلايا الكيراتينية بطبقة التغذية. بالإضافة إلى ذلك ، تفرز هذه الخلايا المغذية عوامل النمو وتقوم بتصنيع بروتينات المصفوفة خارج الخلية التي تدعم نمو الخلايا الكيراتينية. اعتمادا على القدرة التكاثرية للخلايا الكيراتينية الفردية ، فإنها تبدأ في تكوين مستعمرات. قم بإزالة الوسائط وإصلاح المستعمرات. تلطيخ الخلايا بصبغة مناسبة للكشف عن المستعمرات للعد. في البروتوكول التالي ، سنقوم بإجراء الفحص الاستمرابط للخلايا الكيراتينية الأولية التي تم حصادها من الفئران البالغة بعد العلاج بمركبات الاختبار.

- بعد حصاد عينات الجلد الظهرية من الفئران البالغة القتل الرحيم ، استخدم ملقطا معقما ومشرطا لوضع جلد ظهري واحد في كل مرة ، بحيث يكون الجانب المشعر لأسفل ، في طبق بتري رقيق وكشط الأنسجة تحت الجلد ، بما في ذلك الدهون من الجانب البطني لأنسجة الجلد ، حتى يصبح النسيج شبه شفاف.

ضع هذا الجلد المكشط في PBS حتى تتم معالجة جميع القشرة المتبقية. بعد ذلك ، استخدم مشرطا لتقطيع عينات الجلد إلى شرائح من 0.5 × 1 إلى 1.5 سم. ضع الشرائط مشعرة لأعلى في طبق بتري معقم قبل تعويم العينات على سطح 20 مليلتر PBS بالإضافة إلى 2x محلول جنتاميسين مكمل بنسبة 0.25٪ تريبسين في طبق بتري بلاستيكي 100 × 20 ملم لمدة ساعتين عند 32 درجة مئوية.

في نهاية الحضانة ، ضع طبق بتري بلاستيكي مربع معقم يحتوي على 15 مل من وسط الحصاد عند منحدر 30 درجة ، واستخدم ملقطا منحنيا لنقل شريط جلد عائم بعناية إلى الطبق. أمسك شفرة مشرط جديدة بزاوية عمودية على الجلد وباستخدام قوة كافية ولكن ليست مفرطة ، اكشط البشرة والشعر من العينة إلى الوسط.

عندما يتم كشط جميع الشرائط ، قم بصب المادة الطافية المحتوية على خلايا البشرة بعناية في وعاء معقم سعة 60 مليلتر يحتوي على شريط تحريك مغناطيسي مقاس 1.5 بوصة ، واشطف طبق بتري بوسط حصاد إضافي لجمع أي خلايا بشرة متبقية.

ارفع الحجم النهائي في البرطمان إلى 30 مل مع وسط طازج ، وحرك محلول خلايا البشرة بمعدل 100 دورة في الدقيقة لمدة 20 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في نهاية حضانة التحريك ، في خزانة السلامة الحيوية ، قم بإزالة قضيب التحريك وقم بتصفية محلول الخلية من خلال مصفاة 70 ميكرومتر في أنبوب مخروطي سعة 50 مل.

استخدم ملقطا ثم ماصة للضغط على الشعر ومواد الطبقة القرنية من خلال المصفاة لمعالجة الأنسجة لتحرير خلايا الشعر المحاصرة ، واستخدم 5 ملليلتر إضافية من وسط الحصاد لتحرير خلايا الشعر المحاصرة المتبقية في الأنبوب.

- من الأهمية بمكان أن يتم التلاعب بخلايا البشرة والشعر لتحرير الخلايا من بصيلات الشعر.

- ارفع الحجم الكلي في الأنبوب إلى 50 مل بوسط جديد واجمع ترشيح الخلية عن طريق الطرد المركزي. أعد تعليق الحبيبات في 5 مل من وسط الحصاد الطازج وحوالي 20 تريتورات باستخدام ماصة 5 مل. خذ 0.5 مل من التخفيف 1:20 وانقله إلى أنبوب ميكرو فوج سعة 2 ملليلتر.

بعد خلط العينة بعناية ، خذ 200 ميكرولتر من أنبوب الطرد الدقيق واخلطه برفق بحجم متساو من محلول Trypan Blue بنسبة 0.4٪. امزج هذا المحلول برفق ثلاث مرات وانقل الخلايا إلى مقياس الدم لحساب الخلايا الكيراتينية النواة.

قم بتسجيل جميع الخلايا الزرقاء الداكنة كخلايا غير قابلة للحياة ، وسجل الخلايا الوردية الذهبية الصغيرة كخلايا قابلة للحياة. يبلغ متوسط الجدوى حوالي 80٪ ، ويجب أن يكون العائد النهائي للخلايا الكيراتينية لكل فأر حوالي 30 مليون خلية قابلة للحياة. بعد العد ، اجمع الخلايا باستخدام طرد مركزي آخر ، وللثقافة الجماعية ، أعد تعليق 2 إلى 4 مرات 10 إلى سادس الخلايا الكيراتينية القابلة للحياة لكل طبق بتري 35 ملم في 2 مل من وسط زراعة الخلايا.

للحصول على مقايسة تكوين مستعمرة استمائية ، قم بإعادة تعليق الخلايا عند 1 في 10 إلى الخلية الكيراتينية الثالثة لكل 4 ملليلتر من وسط ويليام E المعدل مع المكملات الغذائية وتركيز المصل لكل طبق بتري 60 ملم مطلي بالكولاجين على طبقات تغذية الفأر السويسري 3T3 المشع بالأشعة السينية.

بالنسبة للاستزراع الجماعي ، قم بزراعة المزارع عند 32 درجة مئوية في 5٪ ثاني أكسيد الكربون لفترة زراعة الخلايا المناسبة ، وتغيير الوسط بعد 24 ساعة من البذر الأولي للاستزراع الجماعي و 3 مرات في الأسبوع بعد ذلك.

في نهاية الثقافة النسيلة ، استنشق الوسط وقم بإصلاح المستعمرات في 10٪ فورمالين مخزن طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. في صباح اليوم التالي ، قم بتلطيخ المستعمرات بنسبة 0.5٪ من الرودامين ب في ماء معقم لمدة ساعة واحدة قبل شطف الأطباق بالماء البارد المعقم حتى يصبح الماء صافيا. بعد ذلك ، قم بإمالة الأطباق على أغطية لتجف قبل عد المستعمرات.