JoVE Encyclopedia of Experiments
أبحاث السرطان
0 مشاهدات • 3:45 د • April 30th, 2023
- عوامل النسخ هي بروتينات تحتوي على مجالات ربط الحمض النووي. ترتبط بتسلسلات محددة من الحمض النووي وتساعد في تنظيم التعبير الجيني في الخلايا. للكشف عن تعبير عامل النسخ في الخلايا الصباغية المرتبطة بالقشور ، أولا ، حصاد المقاييس الظهرية المصطبغة الداكنة من سمكة الزرد المخدرة. قم بإصلاح المقاييس ومعالجتها بمحلول نفاذية لجعل الخلايا الصباغية الفردية قابلة للنفاذ.
عالج بمحلول مبيض لإزالة حبيبات صبغة الميلانين الداكنة من الخلايا. تقضي عملية التبييض هذه على فرص إشارات الخلفية المرتبطة بالصبغة أثناء خطوات التلوين اللاحقة. احتضان بمحلول مانع يحتوي على بروتينات لمنع مواقع ربط البروتين غير المحددة على سطح الخلية.
الآن ، عالج العينة بالأجسام المضادة الأولية المطلوبة. ترتبط هذه الأجسام المضادة بعوامل النسخ المستهدفة داخل الخلايا. بعد ذلك ، قم بتسمية العينة بالأجسام المضادة الثانوية ذات العلامات الفلورية الخاصة بالأجسام المضادة الأولية. بالإضافة إلى ذلك ، عالج العينة بصبغة ربط الحمض النووي الفلورية المناسبة لتلطيخ نوى الخلية. استخدم المجهر الفلوري للكشف عن انبعاثات الفلورسنت الساطعة من مجمعات عامل النسخ والأجسام المضادة ونواة الخلية.
في البروتوكول التالي ، سنعرض التلوين المناعي للخلايا الصباغية المرتبطة بالقشور الظهرية التي تعبر عن عامل النسخ المحفز للخلايا الصباغية - A ، أو mitfa ، في سمكة الزرد المعدلة وراثيا.
- لإجراء التلوين المناعي ، قم بتخدير الأسماك في 0.17 ملليغرام لكل مليلتر من التريكايين. مع الضوء الساقط تحت مجهر تشريح ، استخدم ملقطا حادا ذو رؤوس دقيقة لنتف المقاييس الظهرية ، مع الحرص على عدم إتلاف نصف المقياس المحتوي على الخلايا الصباغية. ضع المقاييس مباشرة من الملقط في 1 ملليلتر من المثبت واحتضانها في درجة حرارة الغرفة ، أثناء الدوران ، لمدة تزيد عن أو تساوي ساعتين. انقل الأسماك إلى مياه السمك وراقب الأسماك للتأكد من التعافي الناجح.
لتبييض الخلايا الصباغية المصطبغة ، أولا ، اغسل المقاييس الثابتة في PBST مرتين لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك ، أضف 1 مليلتر من محلول التبييض الطازج وقم بتغطيته بأقفال بارافيلم أو غطاء لمنع الغاز من فتح الأنابيب. استمر في التبييض حتى تختفي الصبغة. ثم يغسل في PBST أربع مرات لمدة 5 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
احتضان لمدة 30 دقيقة على الأقل في محلول الكتلة. بعد ذلك ، احتضن بحوالي 400 ميكرولتر من الجسم المضاد الأولي في محلول كتلة طوال الليل في درجة حرارة الغرفة. في اليوم التالي ، اغسل المقاييس ثلاث مرات لمدة 30 دقيقة في PBST في درجة حرارة الغرفة. احتضان بجسم مضاد ثانوي لمدة ساعتين إلى ليلة وضحاها في درجة حرارة الغرفة.
بعد تلطيخ DAPI ، ضع قطرة من vectashield على شريحة زجاجية وقم بتركيب المقاييس بحيث يكون الجانب المقعر من المقاييس متجها لأسفل ضد الشريحة. ضع غطاء زجاجي فوق العينات. استخدم طلاء أظافر شفاف لإغلاق الحواف ومراقبة الشرائح تحت المجهر الفلوري.