فحص الزرع تحت الجلد: طريقة لزرع خلايا الورم الميلانيني من متبرع إلى نموذج سمكة الزرد المتلقية

- أثناء فحص زرع الورم الميلانيني ، يتم زرع الخلايا السرطانية من أسماك الزرد الحاملة للورم في نموذج متلقي يعاني من نقص المناعة لدراسة تطور الورم. ابدأ بأخذ سمكة زرد متبرعة حاملة للورم الرحيم واستئصال الورم جراحيا من جسمه. انقل الورم إلى طبق بتري يحتوي على مخزن مؤقت مناسب وقم بفرمه إلى قطع صغيرة.

بعد ذلك ، قم بتقطيع شظايا الورم باستخدام ماصة. هذا يفصل قطع الورم إلى خلايا فردية. الآن ، قم بتحميل تعليق الخلية السرطانية في حقنة. بعد ذلك ، قم بإعداد متلقي يعاني من نقص المناعة Casper Zebrafish على ورق ترشيح. يفتقر هذا النوع المتحور من أسماك الزرد الذي يعاني من نقص التصبغ إلى الخلايا الصباغية والقزحية ، مما يجعله شفافا ومتعدد الاستخدامات لتجارب التصوير والزرع.

بعد ذلك ، قم بحقن معلق خلية الورم الميلانيني المحمل مسبقا تحت الجلد في المنطقة فوق التجويف البريتوني ، في منتصف الطريق بين الدماغ الخلفي والزعنفة الظهرية لأسماك الزرد كاسبر. الآن ، انقل السمكة المتلقية إلى الماء وراقبها لمراقبة تطور الورم. يساعد الجسم الشفاف لأسماك الزرد في سهولة تصور الأورام المتطورة.

في البروتوكول التالي ، سنعرض زرع خلايا الورم الميلانيني من متبرع بأسماك الزرد الحاملة للورم المعدلة وراثيا إلى نموذج أسماك كاسبر المتلقي الذي يعاني من نقص المناعة.

- بعد تشعيع سمكة كاسبر المتلقية التي يبلغ عمرها من 2 إلى 3 أشهر مع 25 Gy من تشعيع جاما قبل يوم واحد من الزرع ، اسمح للأسماك بالتعافي في مياه السمك. استخدم التريكيين للقتل الرحيم لسمكة حاملة للورم. اقطع الورم وضعه في طبق بتري مع ما يقرب من 5 ملليلتر من المرشح المعقم 0.9x PBS مع 5٪ FPS. باستخدام ماكينة حلاقة ، قم بتقطيع الورم إلى مكعبات أثناء المحلول.

العمل في درجة حرارة الغرفة وباستخدام ماصة P1000 ، قم بعمل ثلاثي لإنتاج خلايا مفردة. ارفع الحجم إلى 25 ملليلترا. قم بتصفية المحلول من خلال مرشح شبكي 40 ميكرومتر وقم بتدويره في جهاز طرد مركزي منضدي عند 453 RCF لمدة 10 دقائق. أعد تعليق الحبيبات في 0.9٪ PBS 5٪ FBS إلى التركيز المطلوب.

باستخدام مقياس كثافة الدم ، احسب العدد الدقيق للخلية وقم بتخفيف تعليق الخلية بحيث يكون حجم الحقن النهائي حوالي 5 ميكرولتر. على سبيل المثال ، إذا كان سيتم حقن 50,000 خلية ، فيجب تخفيف تعليق الخلية إلى تركيز نهائي يبلغ 10,000 خلية لكل ميكرولتر. قم بنقر الأنبوب الذي يحتوي على تعليق الخلية كل بضع دقائق لمنع تكتل الخلايا.

مع 100٪ إيثانول و 0.9x PBS ، اغسل حقنة هاميلتون بمقياس 26 ثانية (طرف مائل مائل) 701 N 10 ميكرولتر من 2 إلى 3 مرات قبل تحميل المحقنة ب 5 ميكرولتر من تعليق الخلية. بعد تخدير السمكة المتلقية للإشعاع في التريكين ، ضعها على جانبها على كيمويب رطب.

قم بتثبيت السمكة بيد واحدة وأدخل الإبرة بحيث يكون الشطبة متجهة لأعلى بزاوية 45 درجة في جناح السمكة فوق التجويف البريتوني في منتصف الطريق تقريبا بين الحدود الخلفية للدماغ الخلفي والحدود الداخلية للزعنفة الظهرية. اضغط برفق على المكبس. اسمح للأسماك بالتعافي في مياه السمك العذبة وراقب الأسماك يوميا بحثا عن نقش الورم. إذا حدث النقش ، يمكن أيضا ملاحظة استمرار النمو وتطور المرض.