Name: مناعي لونين (CHIP) لتعديل هيستون الفحص الحيوي في التعبير الجيني في الخلايا البشرية المنشط (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-07-29T17:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 20 s
Description: استكشف تقنية المناعي لونين (ChIP) لدراسة تعديلات الهيستون الديناميكية في الخلايا البشرية المنشطة. تُستخدم هذه الطريقة لتحليل تغيرات البروتينات المرتبطة بالحمض النووي أثناء تنظيم التعبير الجيني.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويؤيد هذا العمل من قبل جامعة فيرجينيا ، وجامعة فيرجينيا مركز سرطان وواو وكيت توماس ميلر Jeffress الاستئماني التذكارية. نشكر E. جيمس دارنيل مختبر (جامعة روكفلر) وروبرت روس مختبر (جامعة فوردهام) لخطوط الخلية.

<ol><li>Levy, D., Darnell, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Signalling%3A+Stats%3A+transcriptional+control+and+biological+impact%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Reviews+Molecular+Cell+Biology%22%5BJournal%5D)">Signalling: Stats: transcriptional control and biological impact.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 3, 651-662 (2002).</li>
<li>Bromberg, J., Darnell, J. E. Jr <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+STATs+in+transcriptional+control+and+their+impact+on+cellular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Oncogene%22%5BJournal%5D)">The role of STATs in transcriptional control and their impact on cellular function.</a> Oncogene. 19, 2468-2473 (2000).</li>
<li>Hu, X., Ivashkiv, L. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cross-regulation+of+signaling+pathways+by+interferon-gamma%3A+implications+for+immune+responses+and+autoimmune+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">Cross-regulation of signaling pathways by interferon-gamma: implications for immune responses and autoimmune diseases.</a> Immunity. 31, 539-550 (2009).</li>
<li>Campos, E. I., Reinberg, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Histones%3A+annotating+chromatin%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Genet%22%5BJournal%5D)">Histones: annotating chromatin.</a> Annu Rev Genet. 43, 559-599 (2009).</li>
<li>Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chromatin+Modifications+and+Their+Function%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Chromatin Modifications and Their Function.</a> Cell. 128, 693-705 (2007).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293, 1074-1080 (2001).</li>
<li>Wittwer, C. T., Herrmann, M. G., Moss, A. A., Rasmussen, R. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Continuous+fluorescence+monitoring+of+rapid+cycle+DNA+amplification%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">Continuous fluorescence monitoring of rapid cycle DNA amplification.</a> Biotechniques. 22 (130-131), 134-138 (1997).</li>
<li>Higuchi, R., Dollinger, G., Walsh, P. S., Griffith, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+amplification+and+detection+of+specific+DNA+sequences%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechnology+%28N+Y%29%22%5BJournal%5D)">Simultaneous amplification and detection of specific DNA sequences.</a> Biotechnology (N Y). 10, 413-417 (1992).</li>
<li>Kroger, A., Koster, M., Schroeder, K., Hauser, H., Mueller, P. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Activities+of+IRF-1%5BTitle%5D)+AND+%22J+Interferon+Cytokine+Res%22%5BJournal%5D)">Activities of IRF-1.</a> J Interferon Cytokine Res. 22, 5-14 (2002).</li>
<li>Ross, R. A., Spengler, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+neuroblastoma+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Seminars+in+cancer+biology%22%5BJournal%5D)">Human neuroblastoma stem cells.</a> Seminars in cancer biology. 17, 241-247 (2007).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد تم استخدام بروتوكول الشذرة المذكورة بنجاح في المختبر لفحص أكثر من عشرين تعديلات بسيطة مختلفة. بالإضافة إلى ذلك ، لدينا تتميز التغيرات في شغل عوامل النسخ ، هيستون ، بتعديل الانزيمات والبروتينات التي تقر تعديلات بسيطة وآلات النسخ RNA الثاني البلمرة ، في الجينات IFN - γ عدة المستحث. وقد استخدمنا أيضا إجراء تغييرات في لتوصيف تعديلات بسيطة خلال التفريق بين سرطان الخلايا الجذعية 10. نوعية البيانات الشذرة...

<table><tbody><tr><td>فورمالديهيد 37%</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP531-500</td><td></td></tr><tr><td>كلوروفورم/كحول الإيزوأميل</td><td>Acros Organics</td><td>AC32715-5000</td><td></td></tr><tr><td>مثبطات البروتياز الصغيرة الكاملة</td><td>Roche Group</td><td>1836153</td><td></td></tr><tr><td>مصل عجل كوزميك</td><td>Hyclone</td><td>SH30087.04N</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Hyclone</td><td>SH30243</td><td></td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>D0632</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP118-500</td><td></td></tr><tr><td>إيثانول</td><td>Pharmco Products, Inc.</td><td>zp1110EP</td><td></td></tr><tr><td>جليسين</td><td>Roche Group</td><td>100149</td><td></td></tr><tr><td>جليكوجين</td><td>Roche Group</td><td>901393</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3784</td><td></td></tr><tr><td>IFN-gamma</td><td>R&amp;amp;D Systems</td><td>285-IF-100</td><td></td></tr><tr><td>IgG</td><td>Jackson ImmunoResearch</td><td>109-005-003</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>MP Biomedicals</td><td></td><td></td></tr><tr><td>LiCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L4408</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td></td></tr><tr><td>أسيتات الصوديوم</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP333-500</td><td></td></tr><tr><td>ملح الصوديوم لحمض الديوكسيكوليك</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP349-100</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>NP40</td><td>US Biological</td><td>N3500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Histone H3, CT, pan</td><td>EMD Millipore</td><td>07-690</td><td></td></tr><tr><td>فينول/كلوروفورم/إيزوأميل</td><td>Fisher Scientific</td><td>108-95-2</td><td></td></tr><tr><td>محلول ملحي منظم بالفوسفات</td><td>Fisher Scientific</td><td>7647-14-5</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>EMD Millipore</td><td>50-230-0316</td><td></td></tr><tr><td>بروتيناز K</td><td>5 PRIME</td><td>2500140</td><td></td></tr><tr><td>RNAse A</td><td>5 PRIME</td><td>2500130</td><td></td></tr><tr><td>أجاروز DNA نطفة السلمون/بروتين A</td><td>EMD Millipore</td><td>16-157</td><td></td></tr><tr><td>أجاروز DNA نطفة السلمون/بروتين G</td><td>EMD Millipore</td><td>16-201</td><td></td></tr><tr><td>SDS</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP166-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-Cl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T5941</td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Acros Organics</td><td>327372500</td><td></td></tr><tr><td>Anti-K36me3</td><td>Abcam</td><td>ab9050</td><td></td></tr><tr><td>Anti-STAT1</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-345X</td><td></td></tr><tr><td>Anti-RNA Polymerase II</td><td>Santa Cruz Biotechnology, Inc.</td><td>sc-899</td><td></td></tr></tbody></table>

مناعي لونين (chip) لتعديل هيستون الفحص الحيوي في التعبير الجيني في الخلايا البشرية المنشط

Chromatin Immunoprecipitation (ChIP) to Assay Dynamic Histone Modification in Activated Gene Expression in Human Cells

في استجابة لمجموعة متنوعة من يغاندس خارج الخلية ، وSTAT (محول الإشارات ومنشط من النسخ) ويتم تجنيد عوامل النسخ بسرعة من حالة كامنة في السيتوبلازم لمستقبلات سطح الخلية التي يتم تنشيطها من قبل الفسفرة في بقايا a التيروزين واحدة 1. انهم ثم نقل من مكان لآخر وdimerize إلى النواة لدفع النسخ من الجينات المستهدفة ، والتي تؤثر على النمو ، والتمايز ، والتوازن في الاستجابة المناعية. ليس من المستغرب ، نظرا لمشاركتها على نطاق واسع في عمليات الخلية الطبيعية ، التقلبات وظيفة STAT يسهم في الأمراض التي تصيب البشر ، وخاصة لأمراض السرطان وأمراض المناعة الذاتية 2 3. ومن الثابت أن النسخ التي تنظم تعديلات على قالب 4،5 لونين. هذه التعديلات تشمل أنشطة ATP التي تعتمد على المجمعات ، فضلا عن تعديلات بسيطة التساهمية والحامض النووي 6. لأن التنشيط STAT التعبير الجيني على حد سواء بسرعة وعابرة ، فإنه يتطلب آليات محددة لونين القالب تحوير الجينات في مواضع STAT - تعتمد. لتحديد هذه الآليات ، ونحن تميز تعديلات بسيطة والأنشطة الأنزيمية التي تولد لهم في مواضع الجينات التي تستجيب لإشارات STAT. يصف هذا البروتوكول مناعي لونين ، وهو الأسلوب الذي هو قيمة لدراسة STAT إشارة إلى لونين في التعبير الجيني تفعيلها.

هذا البروتوكول يصف كيفية استخدام لونين مناعي (رقاقة) لدراسة التغيرات الديناميكية لونين القالب التي تنظم النسخ التي تحدثها إشارة المسار تنبيغ.

مناعي لونين (CHIP) لتعديل هيستون الفحص الحيوي في التعبير الجيني في الخلايا البشرية المنشط

استجابةً لمجموعة متنوعة من الربائط خارج الخلوية، يتم تجنيد عوامل نسخ STAT (محولات الإشارة ومنشطات النسخ) بسرعة ...

تُستخدم تجربة الترسيب المناعي للكروماتين (ChIP) لمراقبة التغيرات الديناميكية في تعديلات الهيستون التي تحدث أثناء التعبير الجيني المنشط بواسطة STAT one؛ كما يمكن بهذه الطريقة قياس التغيرات في إشغال عوامل النسخ، ومعقدات تعديل الهيستون، وجهاز النسخ نفسه. لبدء المقايسة، يتم تحفيز الخلايا باستخدام interferon gamma لتنشيط إشارات STAT one، يلي ذلك ربط الخلايا تشابكياً باستخدام formaldehyde وجمعها. بعد ذلك، يتم عزل النواة وإجراء عملية السونيكيشن (sonicate)، والتي تؤدي إلى تكسير الكروماتين إلى قطع تتراوح أطوالها تقريباً بين 200 إلى 1000 base pair. بعد ذلك، يُضاف جسم مضاد يستهدف البروتين أو تعديل الهيستون المراد دراسته، ثم يتم ترسيب المعقدات المناعية.يتم غسل المعقدات المناعية، وعكس الروابط المتقاطعة، ثم تنقية الـ DNA. ويمكن تحديد التغيرات في التعديلات الهستونية أو تجنيد البروتينات إلى مناطق محددة من الجين بناءً على تحليل qPCR الكمي للـ DNA الذي تم ترسيبه مناعيًا. مرحبًا، اسمي لورين بورو من مختبر الدكتورة ميليسا هندريكسون وقسم الأحياء بجامعة فرجينيا.سوف نعرض لكم اليوم إجراءً للترسيب المناعي للكروماتين. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة تعديلات الهستونات الديناميكية التي تحدث أثناء عملية النسخ في المسارات التي تلي إشارات STAT one. لذا، فلنبدأ.قبل يوم واحد من بدء هذا الإجراء، قم بزراعة الخلايا بحيث يتوفر عدد كافٍ من خليتي FTGH المستخدمتين هنا. قم بتجهيز طبق زراعة أنسجة واحد بقطر 15 سنتيمتر وبدرجة تلاقي تبلغ 80% لكل مقايسة رقاقة. قم بتضمين ضابط IgG سلبي، وضابط أجسام مضادة شامل للهيستون (pan histone) إيجابي، وعينات مكررة في كل تجربة.لبدء هذا الإجراء، قم بإزالة أوساط الزرع. استبدلها بـ 20 milliliters من DMEM المدعم بـ 10% cosmic calf serum والذي يحتوي على interferon gamma بتركيز خمسة nanograms per milliliter. كذلك، استبدل الأوساط في الأطباق غير المحفزة بـ 20 milliliters من 10%C-C-S-D-M-E-M.يجب إكمال العمل التالي داخل خزانة استرداد الأدخنة. قم بإمالة طبق زراعة الأنسجة الذي يبلغ قطره 15 سنتيمتر وأضف 540 µL من محلول فورمالدهيد بتركيز 37% إلى 20 mL من الوسط الزرعي. بعد ذلك، قم بهز الطبق لتوزيعه بالتساوي.اترك عملية الربط التشعبي (cross-linking) لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة. ثم أضف الجلايسين ليصل التركيز النهائي إلى 125 millimolar لإيقاف تفاعل الربط التشعبي. قم بشفط الوسط باستخدام الشفط الفراغي واغسل الخلايا مرة واحدة باستخدام 10 milliliters من محلول PBS البارد جداً، وباستخدام كاشطة الخلايا (cell scrapper)، اجمع الخلايا في حوالي سبعة milliliters من محلول PBS، ثم ادمج الخلايا التي عولجت بشكل متماثل من ستة أطباق بحجم 15 centimeter في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter على الثلج.أخيرًا، قم بطرد الخلايا المجمعة مركزياً بسرعة 1,800 RPM لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية وقم بشفط الـ PBS. في حال التوقف عند هذه الخطوة، قم بتجميد كعكة الخلايا تجميداً سريعاً وخزنها عند درجة حرارة ناقص 80 درجة مئوية بعد الربط التشابكي. الخطوة التالية هي تحضير الكروماتين.ابدأ بإضافة 1 mM من DTT ومثبطات البروتياز الكاملة إلى منظم الانتفاخ المبرد على الثلج. أعد تعليق الراسب من ستة أطباق، مسحوباً في 4 mL من منظم الانتفاخ، وانقله إلى أنبوب مخروطي سعة 15 mL. قد يؤدي استخدام كمية أكبر أو أقل من المنظم إلى تغيير كفاءة الاستخلاص.قم بتحضين معلق الخلايا على الجليد لمدة 10 دقائق. وعند اكتمال التحضين على الجليد، انقل المعلق إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملي لتر مبرد مسبقاً، وقم بعمل 20 حركة خلط باستخدام PEs A. بعد الخلط، انقل الخلايا مرة أخرى إلى أنبوب مخروطي سعة 15 ملي لتر على الجليد، ثم قم بالطرد المركزي بسرعة 2,500 RPM لمدة خمس دقائق عند درجة حرارة 4 °C، وتخلص من الرائق مع الاحتفاظ بالراسب النووي.أضف مثبطات البروتياز الكاملة إلى محلول التخفيف الخاص بالسونيكة المبرد على الثلج. تعطي ست صفحات ما يقرب من 200 microliters من إعادة تعليق الراسب النووي. قم بتعليق الراسب في 15 ضعف حجم الراسب أو ثلاثة milliliters من محلول التخفيف الخاص بالسونيكة.قد يؤدي استخدام حجم مختلف لهذه الكمية من الخلايا إلى تغيير كفاءة عملية سونيكة الخلايا (sonication). يجب تحديد كفاءة السونيكة مسبقاً لجهاز السونيكتور المستخدم في مختبركم. تم استخدام جهاز Miss Sonic sonicate 3000 المزود برقاقة ميكروية هنا.قم بمعالجة معلق النوى بالموجات فوق الصوتية (Sonicate) على الثلج لمدة 10 دورات، بحيث تكون كل دورة 20 ثانية من التشغيل و40 ثانية من التوقف، مع ضبط السعة على القيمة ثمانية. يؤدي ذلك عادةً إلى الحصول على شظايا كروماتين يتراوح متوسط حجمها بين 200 إلى 1000 زوج قاعدي عند اكتمال عملية السونيكة. انقل المادة التي تمت معالجتها إلى أنبوب طرد مركزي من نوع SS 34، ثم قم بإجراء الطرد المركزي بسرعة 13,000 RPM لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة أربعة درجات مئوية.في جهاز طرد مركزي بدوار SS 34 لترسيب حطام الخلايا، والذي يكون عادةً بكمية صغيرة. انقل السائل الطافي بعناية إلى أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter على الثلج. انتقل إلى مرحلة الحجب (blocking) لتقليل الخلفية الناتجة عن أحداث الارتباط غير النوعي.أولاً، قم بالتنقية المسبقة لتحضير الكروماتين عن طريق إضافة 360 µL من ملاط خرزات agro المكسوة بـ DNA من حيوانات السلمون وبروتين A أو G، مع الرج في درجة حرارة 4 °C لمدة 30 دقيقة على الأقل. استخدم جهاز الطرد المركزي بسرعة 1000 RPM لمدة خمس دقائق عند 4 °C لترسيب خرزات agro. بعد ذلك، انقل السائل الطافي الذي تمت تنقيته مسبقاً إلى أنبوب مخروطي آخر سعة 15 mL على الثلج.بعد ذلك، قم بقياس الامتصاصية عند 260 نانومتر أو وحدات A 260 للكروماتين. خفف 10 µL من الكروماتين المُعد مسبقاً في 190 µL من الماء المقطر مرتين. وبالنسبة للعينة الفارغة (blank)، اخلط 10 µL من محلول منظم السونيكاشن (sonication buffer) مع 190 µL من الماء المقطر مرتين.اضبط حجم العينة باستخدام محلول التخفيف الخاص بالسونيكشن لتصل إلى أربع وحدات من امتصاص A 260. احتفظ بـ 75 µL من الكروماتين الذي تم تنقيته مسبقاً بتركيز أربع وحدات A 260 كعينة مدخلات (input sample)، وخزنها عند درجة حرارة -20 °C حتى يحين وقت عكس الروابط التشابكية. تذكر أن هذه الخطوة حاسمة لتحليل البيانات.لذا، لا تهمل أخذ الحصة المدخلة، ثم قم بتوزيع ما تبقى من تحضير الكروماتين في حصص سعتها 1 مل في أنابيب ميكروية سعة 1.7 مل على الثلج. وفي حال التوقف عند هذه الخطوة، قم بالتجميد السريع للكروماتين المُحضّر على الثلج الجاف وتخزينه عند -80 درجة مئوية.ومع ذلك، وبما أن الكروماتين المخزن يمكن أن يتحلل، فمن الأفضل المتابعة في إجراء الترسيب المناعي (ip). الآن، أضف الأجسام المضادة من درجة ChIP إلى مجموعات العينات المُحفزة وغير المُحفزة. في مكررات.عادةً ما تكون كمية تتراوح بين ميكروغرام واحد إلى ميكروغرامين من الأجسام المضادة كافية وتؤدي الغرض، ولكن يجب تحديد هذه الكمية تجريبياً مسبقاً. أضف 2 µg من IgG و15 µL من pan histone H3 antibody كضوابط سالبة وموجبة إلى مجموعات العينات المحفزة وغير المحفزة. بعد ذلك، قم برج جميع الأنابيب طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C قبل الانتقال إلى عزل المعقدات المناعية بعد فترة الحضانة الليلية مع الأجسام المضادة.أضف 60 µL من ملاط خرزات البروتين A أو البروتين G المرتبط بـ DNA سبرمن السلمون إلى جميع الأنابيب. قم بالتحضين عند 4 °C لمدة 60 دقيقة على الأقل لربط المعقدات المناعية بالخرزات.قم بترسيب المعقدات المناعية المرتبطة بحبيبات agarose عن طريق الطرد المركزي اللطيف عند 2000 RPM لمدة ثلاث دقائق عند درجة حرارة أربع درجات مئوية، ثم اسحب السائل الطافي. بعد ذلك، قم بإجراء سلسلة من غسلات المنظم، بدءاً بغسلة ذات تركيز ملحي منخفض تليها غسلة ذات تركيز ملحي عالٍ. ثم قم بالغسل باستخدام كلوريد الليثيوم.وأخيراً، يتم إجراء غسلتين بمحلول TE لكل من محاليل الغسيل. أضف PMSF قبل الاستخدام مباشرة، واغسل بـ 1m L من المحلول المنظم لمدة 10 دقائق مع الرج عند درجة حرارة 4°C، ثم استخدم جهاز الطرد المركزي لمدة ثلاث دقائق بسرعة 2000 RPM عند درجة حرارة 4°C، واسحب الراشح مع الحفاظ على العينات مبردة على الثلج. بعد إزالة الغسلة الأخيرة بمحلول TE، أضف 500 µL من محلول Lucian المنظم المُحضّر حديثاً إلى الخرز، واستخدم جهاز الفورتيكس لخلط خرز aros في محلول Lucian المنظم، ثم سخنه لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 65°C.قم برج العينات باستخدام جهاز vortex كل 10 دقائق أثناء عملية الاستخلاص، وأذب العينات المدخلة ثم أضف 500 µL من محلول الاستخلاص (elution buffer) إلى كل عينة. قم بتضمين هذه العينات في جميع الخطوات اللاحقة. بمجرد انتهاء العينات من التحضين عند 65 °C، قم برجها في جهاز micro fusion لمدة 30 ثانية بسرعة 2000 RPM، ثم انقل EENT إلى أنبوب micro fuge جديد.أخيرًا، قم بعكس الربط التشابكي. أضف كلوريد الصوديوم بتركيز خمسة مولار للوصول إلى تركيز نهائي قدره 200 millimolar لجميع العينات، ثم ضعها في حاضنة مع الرج (vortex incubator) عند درجة حرارة 65 °C لمدة أربع ساعات على الأقل أو حتى الليلة التالية. وبمجرد عكس الروابط التشابكية للمجمعات المناعية، يمكن استعادة الـ DNA المرتبط عند اكتمال عملية الحضن عند 65 °C.قم بطرد العينات بجهاز الطرد المركزي الدقيق (Micro fuge) لمدة 30 ثانية. ولجمع التكاثف الموجود على الأغطية، أضف ميكرولتر واحد من RNAs A إلى كل أنبوب، ثم قم بالتحضين في درجة حرارة الغرفة لمدة 15 دقيقة بعد معالجة كل أنبوب بـ 10 µL من 0.5 molar EDTA و40 µL من 0.5 molo tris chloride pH 6.5 وميكرولترين من proteinase K، أي بإجمالي 52 µL من المزيج الرئيسي (master mix)، ثم قم بالتحضين عند 45 °C لمدة 60 دقيقة. استخلص العينات باستخدام phenol chloroform وiso aile alcohol، ثم باستخدام chloroform ISO A my alcohol.لترسيب الـ DNA، أضف ميكرولترين من الجليكوجين و0.1 حجم من خلات الصوديوم بتركيز 3 مولار وpH 5.2 إلى كل عينة، ثم قم بالرج باستخدام جهاز الفورتكس. أضف 2.5 حجم من الإيثانول بتركيز 100%، ثم رجها بجهاز الفورتكس واتركها لتحضن عند درجة حرارة -20 °C طوال الليل. استرجع العينات وقم بعملية طرد مركزي مجهرية بسرعة 13,000 RPM لمدة 20 دقيقة عند درجة حرارة 4 °C.اغسل رواسب الجليكوجين والحمض النووي DNA بـ 1 mL من الإيثانول بتركيز 70%، ثم جفف الرواسب في الهواء أو باستخدام جهاز الطرد المركزي المفرغ عالي السرعة. تجنب تجفيف الحمض النووي DNA بشكل مفرط، ثم أعد تعليق الرواسب في 200 µL من منظم TE، وقم بقياس الكمية باستخدام تقنية الزمن الحقيقي (real time) بكمية لا تزيد عن 1 µL.تُظهر نتائج PCR هنا نتائج تجربة ChIP لمتابعة ديناميكيات H3K36me3. وخلال تحريض جين IRF1 بواسطة إنترفيرون غاما، استُخدم جسم مضاد لـ H3K36me3 لترسيب الكروماتين الذي تم جمعه من خلايا 2FTGH التي حُرضت بإنترفيرون غاما لمدة 30 دقيقة و1.5 ساعة وخمس ساعات، مع استخدام IgG كعنصر تحكم سلبي. كما تم تحديد نسبة إشغال STAT1 في هذه النقاط الزمنية، وكذلك نسبة إشغال RNA polymerase II.تم تحديد إشغال الهيستون عبر موقع جين IRF one في الحالتين غير المحفزة والمحفزة باستخدام الجسم المضاد الشامل للهيستون 3، والذي يعمل أيضاً كضابط موجب. ويعود الانخفاض حول -5 زوج قاعدي إلى نضوب النوكليوزوم الذي يوجد عند مواقع بدء النسخ. لقد عرضنا لكم للتو إجراء الترسيب المناعي للكروماتين.يُعد هذا المقايسة مفيداً لمراقبة تعديلات الكروماتين التي تحدث أثناء عملية نسخ الجينات المنشطة. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تحديد آلية القص المناسبة للكروماتين الخاص بك مع المشرف قبل البدء في تجربة chip. تذكر أيضاً أخذ عينات المدخلات (input samples) الخاصة بك.هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.

chromatin-immunoprecipitation-chip-to-assay-dynamic-histone

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

التفريق بين ESC يتزامن مع خلية من نوع تغييرات معينة في بنية وتركيبة لونين. الكشف عن هذه التغييرات يقدم أفكارا قيمة حول الآليات التي تحدد stemcellness وتمايز الخلايا. مناعي لونين (CHIP) يمثل قيمة لأسلوب تشريح الآليات الجزيئية الكامنة وراء تمايز الخلايا الجذعية.

مناعي لونين من الخلايا الجذعية الجنينية البشرية

من خلال الجمع بين الأم ويشابك مناعي لونين مع عالية الدقة الطيف الكتلي، نهج ChroP تمكن من تشريح بنية البروتين المركب من التعديلات هيستون، المتغيرات والبروتينات غير histonic التآزر في المجالات ونين متميزة وظيفيا.

النهج ChroP يجمع بين الشذرة والطيف الكتلي لتشريح المناظر الطبيعية البروتيومية الحالة رقم محدد من الكروماتين

يصف هذا العمل بروتوكول ل لونين إمونوبريسيانتاتيون (رقاقة) باستخدام ناضجة الماوس T- خط الخلية. هذا البروتوكول هو مناسبة للتحقيق في توزيع علامات هيستون محددة في مواقع المروج محددة أو الجينوم واسعة.

كروماتين إمونوبريسيبيتاتيون (رقاقة) في الماوس خلايا T- خطوط

هنا، نحن وصف إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (شريحة) ورقاقة seq المكتبة إعداد بروتوكول لإنشاء التشكيلات الجانبية ابيجينوميك العالمية من عينات الدجاج منخفض-وفرة الجنينية.

الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) بروتوكول لعينات جنينية وفرة منخفضة

هنا، يمكننا وصف بروتوكول الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن من هيستونيس المعدلة من مهدها الخميرة Saccharomyces cerevisiae. إيمونوبريسيبيتاتيد الحمض النووي بعد ذلك تستخدم ل PCR الكمي لاستجواب بوفرة والتعريب من التعديلات هيستون بوستترانسلاشونال في جميع أنحاء الجينوم.

إيمونوبريسيبيتيشن الكروماتين (رقاقة) من "التعديلات هستون" من Saccharomyces cerevisiae

تنظيم البيئة الكروماتين عملية أساسية للتعبير الجيني السليم. هنا، يمكننا وصف أسلوب للتحكم بالتعبير الجيني عن طريق تعيين الكروماتين--تعديل الآلية بطريقة خاصة بالجينات وعكسها.

قمع النسخ الجيني قبل إعادة توجيه الأجهزة الخلوية مع المعدلات جينية الكيميائية

يمكننا وصف بروتوكول خطوة بخطوة للترادف الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن التسلسل (تشيب-Seq) التي تمكن من تحليل الخلية-نوع معين على نطاق الجينوم هستون تعديل.

تشيب-Seq: التنميط Epigenome الخلية-نوع معين

الكروماتين المناعية الترسيب (ChIP) هو أداة قوية لفهم الآليات الجزيئية لتنظيم الجينات. ومع ذلك، فإن الطريقة تنطوي على صعوبات في الحصول على تجزئة الكروماتين القابلة للاستنساخ عن طريق القص الميكانيكي. هنا، نحن نقدم بروتوكول محسن ة لـ ChIP باستخدام الهضم الأنزيمي.

الكروماتين المناعية الترسيب الفحص باستخدام النوكلور اتوcleases Micrococcal في خلايا الثدييات

مثبطات acetyltransferases هيستون (HATs، المعروف أيضا باسم lysine أستيل ترانسفيراليس)، مثل CBP/p300، هي العلاجات المحتملة لعلاج السرطان. ومع ذلك، هناك حاجة إلى أساليب صارمة للتحقق من صحة هذه المثبطات. ثلاث طرق في المختبر للتحقق من الصحة وتشمل المقايسات HAT مع أسيتيل ترانسفيرات المؤتلف، المناعية لاستيل هيستون في ثقافة الخلية، وChip-qPCR.

مقايسات للتحقق من صحة مثبطات هيستون أسيتيل ترانسفيراز

يركز هذا البروتوكول على تحضير الكروماتين من الأنسجة المجمدة المفاجئة وهو مناسب لترسب الكروماتين المناعي المتشابك (X-ChIP) متبوعا إما بتحليل PCR الكمي (X-ChIP-qPCR) أو نهج تسلسل الجيل التالي (X-ChIP-seq).

استخراج الكروماتين من أنسجة الكبد الخيمرية المجمدة لتحليل الترسيب المناعي للكروماتين

استكشف تقنية المناعي لونين (ChIP) لدراسة تعديلات الهيستون الديناميكية في الخلايا البشرية المنشطة. تُستخدم هذه الطريقة لتحليل تغيرات البروتينات المرتبطة بالحمض النووي أثناء تنظيم التعبير الجيني.

مناعي لونين (CHIP) لتعديل هيستون الفحص الحيوي في التعبير الجيني في الخلايا البشرية المنشط

استكشف المزيد من الفيديوهات