Name: مزمنة التصوير ماوس القشرة البصرية باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-10-25T17:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 12 s
Description: تعلم تقنية التصوير المزمن للقشرة البصرية في الفئران باستخدام إعداد الجمجمة الرقيقة. تتيح هذه الطريقة مراقبة ديناميكيات الأشواك التشعبية الحية لفهم اللدونة العصبية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل جائزة بوروز ويلكوم شهادة في العلوم الطبية الحيوية (AKM) ، ومؤسسة البحوث وايتهول غرانت (AKM) ، زمالة مؤسسة سلون (AKM) ، NIH EY019277 (AKM) ، وNEI الممولة ، والرؤية المنح التدريبية وEY013319 ( EAK).

<ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتصور الخلايا العصبية في الدماغ سليمة باستخدام اثنين من الفوتون المجهري ، والتحضير حيث وصفت الخلايا العصبية مع علامات الفلورسنت المستخدمة. في التجارب المقدمة هنا نستخدم الماوس المعدلة وراثيا GFP - M الذي تسميات خط طبقة الخلايا الهرمية 5 1. طبقة 5 خلايا هرمية المشروع شجيري العمليات في الطبقات السطحية ، والسماح للتصور من التشعبات والعمود الفقري شجيري يصل إلى عمق 300 ميكرومتر دون مستوى الحنون. نهج بديل يتمثل في استخدام الخلايا تسمية علامات الفيروسية (انظر لوري وآخرون ، التي قدمت إلى إن الرب). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعقيم مساحة العمل باستخدام الايثانول 70 ٪ وأدوات تعقيم لجراحة العقيم. تغطية التشغيل السطح مع خلع الملابس النظيفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تخدير الفئران مع كوكتيل الفنتانيل (الفنتانيل 0.05 ملغم / كغم ؛ الميدازولام 5 ملغ / كلغ ؛ metatomadin 0.5 ملغ / كلغ) ، تليها جرعة ربع AVERTIN (0.0075 ملغم / لتر) باستخدام IACUC الإجراءات المعتمدة. يمهد للمعالجة الفئران مع المسكنات ، والبوبرينورفين (0.5 ملغ / كلغ) تدار تحت الجلد (SQ). رصد مستوى الطائرة مخدر اختبار رد الفعل الى الذيل / اصبع قرصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على الحيوانات في 37.5 درجة مئوية باستخدام بطانية للتدفئة مع ترمومتر المستقيم المرفقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق مرهم للعين للعيون لمنع العينين من الجفاف. عيون هود مع ورقة صغيرة من الورق لحماية العينين من مصدر الضوء أثناء الجراحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام مقص ، وإزالة الشعر من مؤخرة الرأس (خلف الأذن) في العينين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يتبع تنظيف الجزء العلوي من الرأس الحيوان مع التطبيق متتابعة من الايثانول 70 ٪ ، عن طريق فرك betadine betadine والحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إجراء شق L - قطع خلف الأذنين وعلى طول الجانب إما الأيمن أو الأيسر من خط الوسط (اعتمادا على نصف الكرة الأرضية الذي سيتم تصويره) في العينين. طية الجلد أكثر من موقع ، وبعيدا عن الجراحة. لا تقم بإزالة الجلد حيث سيتم خياطة الجلد التالية للدورة التصوير. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام الملقط غرامة برفق الجلد وحتى بعيدا من اهتماماتك. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كشط بلطف بعيدا سمحاق من المنطقة المكشوفة من الجمجمة مع ملقط نظيف أو شفرة المجهرية. استخدام مسحة القطن ، وتطبيق كمية صغيرة من كلوريد الحديديك 10 ٪ في الجمجمة حتى يجف تماما الغشاء سمحاق وضمان أنه قد تم إزالته تماما. من المهم أن الجمجمة جافة تماما لضمان الالتزام السليم من الغراء (انظر 11). باستخدام الملقط أو شفرة المجهرية ، كشط بلطف بعيدا المجففة غشاء السمحاق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تطبيق طبقة رقيقة من الغراء cyanoacrylate حول نافذة التصوير من الواح الصلب غير القابل للصدأ الرأس (انظر الشكل 1) ويلصق لوحة في الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نهاية باستخدام عصا خشبية من القطن المسحة ، وتطبيق الغراء لطبقات داخل إطار التصوير ، مع التأكد من ملء جميع الفجوات بين لوحة التصوير وانحناء الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع قطرة من الصمغ التسريع في النافذة. يمسح بسرعة بعيدا الزائدة التسريع الغراء مع مسحة القطن أو مسح كيم. يجب أن يكون الغراء توطد تماما قبل الحفر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبدأ رقيقة الجمجمة في إطار التصوير باستخدام حفر الأسنان الملصقة مع 0.7 مم لدغ الفولاذ المقاوم للصدأ. حفر بديلة مع التطبيق أحيانا عقيمة المالحة 0.9 ٪ لتجنب توليد الكثير من الحرارة على الجمجمة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> رقيقة ملم 4X4 نافذة على الجمجمة باستخدام ضربات صغيرة على سطح الجمجمة مع حفر الأسنان. اختبار ركاكة من الجمجمة مع ملقط نهاية حادة. سوف سطح الجمجمة البادئة قليلا مع ضغط لطيف. سمك الجمجمة الأمثل لتصوير ما بين 10 و 30 ميكرومتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما الجمجمة هي رقيقة والإطار تنظيفها من كل الحطام والمكان المالحة على الجمجمة. صورة نافذة التصوير مع الكاميرا الرقمية التي شنت على نطاق وتشريح. والتصوير الفوتوغرافي واستخدام الأوعية الدموية في الدماغ تساعد في تحديد مكان وجود موقف لوضع لوحة التصوير لجلسات التصوير لاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الحيوانات إلى تلاعب 2 - الفوتون. ينبغي أن تبقى على الحيوان بطانية للتدفئة (المستقيم مع التحقيق) خلال الدورة التصوير بأكمله. ملاحظة : عندما تكون تحت التخدير ، ودرجة حرارة جسم الحيوان الأساسية سوف تتقلب بشكل كبير في غياب وحدة التدفئة مما أدى إلى أضرار القشرية أو ربما الموت. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويستخدم مجهر ثنائي الفوتون مع ليزر ماي تاي ، وهو 10W مضخة الحالة الصلبة لأقصى قدر من السلطة وأوليمبوس تعديل وحدة مبائر Fluoview. تم تحسين نظام للتصوير الأنسجة العميقة ويتم تثبيت كاشفات الخارجية أقرب إلى الهدف ممكن للسماح للكشف القصوى لمضان من الدماغ. يتم استخدام LUMPlan أوليمبوس الهدف 20X/0.95NA فلوريدا / IR العدسة. وتستخدم المياه المالحة 0.9 ٪ خلال التصوير لغمر الهدف. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام هذا المجهر ، وتقريب رقمي منخفضة (X1) تحديد منطقة تحتوي على الخلايا العصبية المسماة الزاهية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الكاميرا الرقمية الملصقة على قطعة المجهر العين ، ويلتقط صورا للمنطقة التصوير. بدلا من ذلك ، يرسم نمط الأوعية الدموية في الدم. هذا أمر ضروري لإعادةأنتقل إلى موقع التصوير نفسه في نقطة زمنية لاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحصول على المكدس التكبير المنخفض (X20 الهدف ، 512x512 بكسل ، 5 الخطوة ميكرون) من خلال مدى مرئية بالكامل من الدماغ (الذي يمتد عادة ~ 200 ميكرون) مما يبين مدى تشعب شجيري. ملاحظة : سيتم استخدام هذه الصورة التكبير المنخفضة لتحديد منطقة التصوير في نقاط وقت لاحق كما الأوعية الدموية على حد سواء ، والحفاظ على هيكلها التشعبات في الحيوانات الصغار والكبار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التصوير باستخدام برنامج (Fluoview ، V. 5.0 ، FV300) ، وزيادة التكبير الرقمي 8 أضعاف. ضبط إحداثيات س ، ص (PAN إحداثيات) إذا لزم الأمر ، وجمع كومة التكبير العالية التي سوف تظهر مورفولوجيا شجيري مفصلة بما في ذلك مواقع وهيكل العمود الفقري شجيري. تدوين ملاحظات مفصلة عن كل مجموعة مكدس ، أي عموم الإحداثيات ، ومجموعة من جمع وحجم ض خطوة وعدد من الخطوات في الكدسة. وسيتم استخدام هذه الملاحظات عند عودته الى هذا تغصن أو محور عصبي في نقطة زمنية لاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد التصوير ، وإزالة لوحة فصل رأسه بلطف لوحة من سطح الجمجمة. باستخدام الملقط ، وإزالة أي بقايا الغراء المتبقية على سطح الجمجمة والجمجمة مع مسح المالحة عقيمة 0.9 ٪. خياطة الجلد فوق الجمجمة معا باستخدام # 6 الصفحات خياطة. مسح المنطقة مع الايثانول 70 ٪. لتخفيف الألم أثناء التعافي بعد الجراحة ، وإدارة مسكن البوبرينورفين 0.1 ملغ / كلغ ، SQ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان الحيوان في القفص نظيفة تحت مصباح الحرارة حتى يستيقظ ، والمحمول. عودة إلى قفص الحيوان الأصلي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحيوان reimage في وقت لاحق نقطة (نقطة وقتنا ويمكن في أي مكان التصوير في الفترة من 2 إلى أيام عدة أشهر بعيدا) ، إزالة أو إعادة فتح غرز الجلد على الرأس باستخدام أساليب العقيم على النحو الوارد أعلاه. استخدام الصور الرقمية من الأوعية الدموية في الدماغ (التي اتخذت في تاريخ الجراحة الأولى) لتحديد موقع التصوير الأصلي. Reaffix headplate الفولاذ المقاوم للصدأ (الخطوات 10-12). استخدام شفرة المجهرية رقيقة بلطف بعيدا أي العظام التي قد تكون إعادة نمت بين نقاط وقت التصوير. إذا لزم الأمر ، رقيقة مع حفر الأسنان. نافذة واضحة التصوير من الحطام وتطبيق قطرة من المياه المالحة عقيمة 0.9 ٪. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحمل الحيوانات لاثنين من الفوتون المجهر وتحديد مجال التصوير الأصلي. استخدام الصورة الرقمية التي اتخذت خلال الدورة الأولى للتصوير المساعدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح البرنامج وفتح Fluoview الأصلي صورة التكبير منخفضة. لصق ورقة الشفافية على شاشة الكمبيوتر والرسم والاوعية الدموية الرئيسية النمط باستخدام قلم الشفافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> فتح الصورة الحية ويعيد تنظيم الدم الأوعية الدموية للنمط رسمت على الفيلم الشفافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لreimage 8X والتكبير في الهياكل ، وفتح المكدس المطلوب جمعها من الدورة السابقة التصوير. رسم الهيكل (أي محواري ، شجيري ، الدبقية) على فيلم والشفافية ، والملصقة على شاشة الكمبيوتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تكبير 8X من صورة حية وتعيين الإحداثيات لعموم المعلمات يوم التصوير الأول. اعتمادا على دقة محاذاة موقع التكبير منخفضة ، قد يكون من الضروري أيضا ضبط زاوية من الصورة قليلا. مرة واحدة تم العثور على الهيكل المطلوب ، لتصل المباراة إلى الهيكل الخاص رسمت نمط التكبير عالية. جمع ض المكدس مع حجم خطوة مماثلة ، وعدد من Z - المكدس لتحليل الصور اللاحقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> كرر الخطوات 29 و 30 حتى يتم كل الصور عالية التكبير إعادة جمعها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عند اكتمال التصوير ، كرر الخطوات من 22-24. ويمكن تكرار إعادة التصوير بسرعة تصل الى 2 نقطة زمنية منفصلة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وقد أجريت تجارب على الحيوانات وفقا للمبادئ التوجيهية واللوائح التي وضعتها الحظيرة وشعبة الطب مختبر الحيوان من جامعة روتشستر مدرسة الطب وطب الأسنان ، والاعتماد الكامل من قبل الرابطة لتقييم واعتماد المختبرات رعاية الحيوان ، الدولية (AAALAC) وامتثالا لدولة القانون ، القانون الفيدرالي ، وسياسة المعاهد الوطنية للصحة. </li></ol> ممثل النتائج في GFP - M معربا عن الفئران ، يمكن أن مجموعة فرعية من طبقة الخلايا الهرمية 5 والعمليات المقابلة شجيري يمكن بسهولة تصور باستخدام 2 الفوتون المجهري مسح الليزر (2PLSM) 1. تظاهر هنا لدينا إعداد ضعفت - الجمجمة التي ضعفت الجمجمة حول موقع التصوير المطلوب ل10-30 ميكرومتر ~. بروتوكول يسمح لنا القيام بشكل صحيح ، علينا وضع تصور واضح والتشعبات القشرية العمود الفقري في القشرة البصرية سليمة للتحليل حاد أو مزمن (الشكل 2). <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. لوحة مخصصة الرأس والقاعدة : (أ) أعلى عرض مخصص رأس وقدم لوحة الأساسية المستخدمة لإعداد جراحة ضعفت - الجمجمة. (ب) عرض الجانب العرف من صنع لوحة الرأس والقاعدة. (C ، D) وصورة تخطيطية تفصيلية لوحة الرأس. <img src="/files/ftp_upload/2060/2060fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> <stro>في الجسم الحي في القشرة البصرية للماوس GFP - M المعدلة وراثيا باستخدام اثنين من الفوتون المجهري. الصورة هي صورة واحدة من الإسقاط حصل كل من 5 ميكرون الحنون إلى عمق النهائي من 175 ميكرون. محاصر في المنطقة ويمثل المنطقة في تضخيم (B) و (C) التقط في اليوم 0 (D0) وبعد ذلك بأربعة أيام (D4). خسر (D ، E) التكبير العالي فرع شجيري محاصر في وباء وجيم يتظاهرون أشواك مستقرة (رؤوس السهم الأبيض) ، والعمود الفقري التراجع / (رؤساء السهم الأحمر) ، والعمود الفقري جديدة (رؤساء السهم الأخضر). أشرطة النطاق = 200 ميكرومتر ألف وباء وجيم 20 ميكرون ، D ، E. 5 ميكرون. </stro>

<ol><li>Feng, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imaging+neuronal+subsets+in+transgenic+mice+expressing+multiple+spectral+variants+of+GFP%5BTitle%5D)+AND+%22Neuron%22%5BJournal%5D)">Imaging neuronal subsets in transgenic mice expressing multiple spectral variants of GFP.</a> Neuron. 28 (1), 41-51 (2000).</li>
<li>Holtmaat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((high-resolution+imaging+in+the+mouse+neocortex+through+a+chronic+cranial+window%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">high-resolution imaging in the mouse neocortex through a chronic cranial window.</a> Nat Protoc. 4 (8), 1128-1144 (2009).</li>
<li>Majewska, A. K., Newton, J. R., Sur, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Remodeling+of+synaptic+structure+in+sensory+cortical+areas+in+vivo%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Remodeling of synaptic structure in sensory cortical areas in vivo.</a> J Neurosci. 26 (11), 3021-3029 (2006).</li>
<li>Mostany, R., Portera-Cailliau, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+Craniotomy+Surgery+Procedure+for+Chronic+Brain+Imaging%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">A Craniotomy Surgery Procedure for Chronic Brain Imaging.</a> J Vis Exp. , (2008).</li>
<li>Yang, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Thinned-skull+cranial+window+technique+for+long-term+imaging+of+the+cortex+in+live+mice%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protocols%22%5BJournal%5D)">Thinned-skull cranial window technique for long-term imaging of the cortex in live mice.</a> Nat Protocols. 5 (2), 201-208 (2010).</li>
<li>Xu, H. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choice+of+cranial+window+type+for+in+vivo+imaging+affects+dendritic+spine+turnover+in+the+cortex%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Choice of cranial window type for in vivo imaging affects dendritic spine turnover in the cortex.</a> Nat Neurosci. 10 (5), 549-551 (2007).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

التصوير المزمنة باستخدام اثنين من الفوتون المجهري أصبحت تقنية شعبية متزايدة لدراسة التغيرات المورفولوجية أثار خلال اللدونة 2-5. هنا علينا أن نظهر استعدادا ضعفت - الجمجمة لمتابعة العمود الفقري شجيري التي تم تحديدها في مخ الفأر سليمة في أيام التصوير المختلفة. في هذا البروتوكول ، يتم ترك الجمجمة سليمة ، مما تسبب في أضرار طفيفة في القشرة ويؤدي إلى مستويات منخفضة جدا من neuroinflammation الذي قد يغير وظيفة المخ 6. وهذا يسمح ليمكن تصوير الحيوان فورا بعد الجراحة أول...

<table><tbody><tr><td>سترات الفنتانيل</td><td></td><td>داخلي</td><td></td><td>مزيج الفنتانيل: مزيج التخدير؛&lt;دماغ/&gt;الجرعة عن طريق الحقن البريتوني: 0.0125 مل/جم&lt;br/&gt;&lt;دماغ/&gt;التركيز النهائي للمزيج: 0.05 ملجم/كجم</td></tr><tr><td>هيدروكلوريد الميديتوميدين</td><td></td><td>داخلي</td><td></td><td>مزيج الفنتانيل: مزيج التخدير؛&lt;br/&gt;جرعة الحقن داخل الصفاق: 0.0125 مل/جم&lt;br/&gt;&lt;br/&gt;التركيز النهائي للمزيج: 0.05 مجم/كجم</td></tr><tr><td>ميدازولام هيدروكلوريد</td><td></td><td>داخلي</td><td></td><td>مزيج الفنتانيل: مزيج التخدير؛&lt;br/&gt;جرعة الحقن داخل الصفاق: 0.0125 مل/جم&lt;br/&gt;&lt;تصوير حيوي/&gt;تركيز الخليط النهائي: 0.05 مجم/كجم</td></tr><tr><td>2،2،2-تراي برومو&amp;#8211;إيثانول </td><td></td><td></td><td></td><td>مزيج أفيرتين: مخدر؛&lt;br/&gt;جرعة الحقن الصفاقي: 0.0075 سم مكعب/جم&lt;دماغ/&gt;&lt;تسمح تقنية التصوير الحي (in vivo) باستخدام المجهر الماسح بالليزر ثنائي الفوتون (2PLSM) بدراسة الخلايا الحية والزوائد العصبونية في الدماغ السليم. وتتيح التقنية المعروضة هنا تصوير المنطقة نفسها من الدماغ في نقاط زمنية متعددة (التصوير المزمن) بدقة مجهرية تسمح بتتبع الأشواك التغصنية، وهي البنى الصغيرة التي تمثل غالبية مواقع الاستثارة بعد التشابكية في الجهاز العصبي المركزي. إن القدرة على تمييز البنى القشرية الدقيقة بوضوح عبر نقاط زمنية متعددة توفر مزايا عديدة، خاصة في دراسة اللدونة الدماغية التي قد تساعد فيها التغيرات المورفولوجية في المشابك العصبية وإعادة تشكيل الدوائر العصبية في تفسير الآليات الكامنة. نعرض في هذا الفيديو والمواد التكميلية بروتوكولاً للتصوير المزمن الحي للدماغ السليم باستخدام تحضير الجمجمة الرقيقة. ويعد تحضير الجمجمة الرقيقة نهجاً طفيف التوغل، يتجنب إلحاق ضرر محتمل بالأم الجافية و/أو القشرة الدماغية، مما يقلل من بدء الاستجابة الالتهابية. وعند تنفيذ هذا البروتوكول بشكل صحيح، يصبح من الممكن مراقبة التغيرات في خصائص الأشواك التغصنية بوضوح في الدماغ السليم على مدى فترة زمنية طويلة.&gt;تركيز الخليط النهائي: 1%</td></tr><tr><td>2-ميثيل-2-بيوتانول (التركيز النهائي: 0.775%)</td><td></td><td></td><td></td><td>مزيج أفيرتين: مخدر؛&lt;دماغ/&gt;الجرعة داخل الصفاق (IP): 0.0075 سم3/جم&lt;دماغ الثدييات/&gt;&lt;br/&gt;التركيز النهائي للمزيج: 0.775%</td></tr><tr><td>نظام TC-1000 للتحكم في درجة الحرارة للفئران</td><td></td><td>شركة CWE, Inc.</td><td>فأر TC-1000</td><td>تنظيم درجة حرارة الجسم</td></tr><tr><td>توبيراديكس</td><td></td><td>داخلي</td><td></td><td>مرهم للعين</td></tr><tr><td>كلوريد الحديديك بتركيز 10%</td><td></td><td>شركة ريكا للمواد الكيميائية (Ricca Chemical Company)</td><td>3120-32</td><td>تحضير الجمجمة الرقيقة</td></tr><tr><td>شفرة جراحة مجهرية</td><td></td><td>Sable Industries</td><td>S-6400</td><td>تحضير الجمجمة الرقيقة</td></tr><tr><td>سيانوأكريليت 404,401</td><td></td><td>Loctite</td><td>رقم القطعة 46551</td><td>تحضير ترقيق الجمجمة</td></tr><tr><td>سيانوأكريليت 401</td><td></td><td>Loctite</td><td>رقم القطعة 40140</td><td>تحضير ترقيق الجمجمة</td></tr><tr><td>مسرع غراء Zip Kicker</td><td></td><td>تقنية الـ Pacer</td><td>PT-29</td><td>تحضير الجمجمة الرقيقة</td></tr><tr><td>سنابك حفر مجهرية فولاذية بقطر رأس 0.7 مم</td><td></td><td>Fine Science Tools</td><td>19008-07</td><td>تحضير الجمجمة الرقيقة</td></tr><tr><td>صندوق التحكم في عزم الدوران الدقيق والمقبض اليدوي Tech2000</td><td></td><td>Ram Products, Inc.</td><td>TECH2000 تشغيل/إيقاف</td><td>تحضير الجمجمة الرقيقة</td></tr><tr><td>غرزة جراحية حريرية بمقاس 6-0 (0.7 ملم)</td><td></td><td>Ethicon Inc.</td><td>K8894H</td><td>المسبر C-1</td></tr><tr><td>ملقط ضمادات العين، 10 سم، عرض الطرف 0.5 مم، منحني</td><td>الأدوات الجراحية</td><td>Fine Science Tools</td><td>11152-10</td><td></td></tr><tr><td>مقصات بون فائقة الدقة، 8.5 سم، طرف مستقيم، حافة قطع 13 ملم</td><td>الأدوات الجراحية</td><td>Fine Science Tools</td><td>14084-08</td><td></td></tr><tr><td>ملقط نمطي قياسي، مستقيم، طرف 2.5 ملم × 1.35 ملم، 12 سم</td><td>الأدوات الجراحية</td><td>Fine Science Tools</td><td>11000-12</td><td></td></tr></tbody></table>

مزمنة التصوير ماوس القشرة البصرية باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة

Chronic Imaging of Mouse Visual Cortex Using a Thinned-skull Preparation

المجراة في التصوير باستخدام اثنين من الفوتون المجهري المسح الضوئي ليزر (2PLSM) يسمح لدراسة الخلايا الحية وعمليات الخلايا العصبية في الدماغ سليمة. التقنية المقدمة هنا يسمح التصوير من نفس المنطقة من الدماغ في الوقت عدة نقاط (التصوير المزمنة) مع قرار السماح للالمجهرية تتبع في العمود الفقري شجيري التي هي هياكل الصغيرة التي تمثل الغالبية العظمى من المواقع مثير بعد المشبكي في الجهاز العصبي المركزي. القدرة على حل بوضوح الهياكل القشرية غرامة على نقاط عدة مرات العديد من المزايا ، وتحديدا في دراسة الدماغ في اللدونة التي تغيرات شكلية في نقاط الاشتباك العصبي ، وإعادة تشكيل الدوائر قد يساعد في تفسير الآليات الكامنة. في هذا الفيديو والمواد التكميلية ، وتبين لنا بروتوكول للمزمنة في الجسم الحي من تصوير الدماغ سليمة باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة. إعداد ضعفت - الجمجمة هو نهج مينيملي ، الذي يتجنب احتمال حدوث تلف و / أو قشرة الجافية ، وبالتالي تقليل ظهور رد فعل للالتهابات. عندما يتم تنفيذ هذا البروتوكول بشكل صحيح ، فمن الممكن لرصد التغيرات في الخصائص بوضوح شجيري العمود الفقري في الدماغ سليمة على مدى فترة طويلة من الزمن.

في هذا الفيديو والمواد التكميلية ، وتبين لنا بروتوكول للالمزمنة<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; تصوير الدماغ سليمة باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة.

يتيح التصوير الحي باستخدام المجهر المسحي الليزري ثنائي الفوتون (2PLSM) دراسة الخلايا الحية والزوائد العصبية في الدماغ السليم. إن ...

تُعد الأشواك التغصنية بروزات غشائية تمتد من تغصنات العصبون وتستقبل المدخلات التشابكية. ويحدث استطالة هذه الأشواك أو انكماشها أو ظهورها أو اختفاؤها استجابةً للتغيرات في وظيفة الشبكة العصبية الناتجة عن أنماط محددة من النشاط العصبي. تُعرف هذه الظاهرة باللدونة القشرية، والتي تهدف لمراقبة التغيرات المورفولوجية في الأشواك التغصنية.في الحيوانات الحية، يتم تثبيت لوحة تصوير على جمجمة الفأر. يتم ترقيق منطقة من الجمجمة جراحيًا، وتُؤخذ صور بتكبير منخفض وعالٍ. ثم يتم إعادة تصوير هذه المناطق في نقاط زمنية لاحقة.تظهر النتائج التي تم الحصول عليها أنه يمكن تصور مورفولوجيا الأشواك التغصنية بوضوح باستخدام تحضير الجمجمة الرقيقة في نقاط زمنية متعددة. كما أن مورفولوجيا الأشواك تتسم بمرونة عالية، حيث تظهر تغيرات في البنية بالإضافة إلى ظهور واختفاء الأشواك التغصنية. مرحباً، أنا إميلي كيلي من مختبر أنايا ماكا في قسم البيولوجيا العصبية والتشريح بجامعة روتشستر.سنعرض لكم اليوم إجراء التصوير المزمن للقشرة البصرية للفأر بعد تحضير يُعرف بـ "fins". نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة معدل تجدد الأشواك الشجيرية. لذا، لنبدأ.ابدأ الإجراء بتعقيم الأدوات المستخدمة في الجراحة العقيم. ثم قم بتعقيم مساحة العمل باستخدام 70%ethanol وغطِ سطح العمل بضمادة نظيفة. راقب عمق التخدير في فأر مخدر بمزيج الفنتانيل عبر اختبار استجابته لقرص الإصبع؛ الفأر الموضح هنا هو فأر معدل وراثياً A-G-F-P-M يتم فيه التعبير عن GFP.في الطبقة الخامسة، تبرز الخلايا بجانب الهرمية (parametal cells) استطالات شجيرية نحو الطبقات السطحية. وللحفاظ على درجة حرارة الجسم عند 37.5 درجة Celsius، يُوضع الحيوان على بطانية تدفئة مع مراقبته بواسطة مقياس حرارة شرجي متصل. بعد ذلك، يُوضع مرهم للعين على العينين لمنع جفافهما باستخدام مقص.قم بإزالة الشعر من الجزء الخلفي لرأس الفأر، من المنطقة خلف الأذنين وصولاً إلى العينين. بعد ذلك، نظف الجزء العلوي من رأس الحيوان بوضع 70% ethanol، يليه فرك بمحلول Betadine ثم غسل بمحلول Betadine. قم بإجراء شق LCU خلف الأذنين وبمحاذاة الجانب الأيمن أو الأيسر من الخط الناصف، بناءً على نصف الكرة المخية المراد تصويره، وصولاً إلى العينين، ثم اطوِ الجلد بعيداً عن موقع الجراحة.لا تقم بإزالة الجلد لأنه سيتم خياطته لاحقاً باستخدام ملاقط دقيقة. اسحب الجلد برفق للأعلى وبعيداً عن المنطقة المراد فحصها. وباستخدام ملاقط نظيفة، قم بكشط السمحاق برفق من المنطقة المكشوفة من الجمجمة.ضع كمية صغيرة من كلوريد الحديد بنسبة 10% على الجمجمة لتجفيف غشاء السمحاق تماماً والتأكد من إزالته بالكامل. من الضروري أن تكون الجمجمة جافة تماماً. ولضمان التصاق الغراء بشكل صحيح، قم بكشط غشاء السمحاق المجفف برفق باستخدام شفرة جراحة مجهرية.بعد ذلك، ضع طبقة رقيقة من غراء Sano الأكريليكي حول نافذة التصوير في لوحة الرأس المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ، ثم قم بتثبيت اللوحة على الجمجمة. وباستخدام الطرف الخشبي لعصا مسحة قطنية، ضع الغراء على الدرزات الداخلية لنافذة التصوير، مع التأكد من ملء جميع الفجوات بين لوحة التصوير وانحناء الجمجمة. ثم ضع قطرة من مُسرع جفاف الغراء داخل النافذة.بعد ذلك، قم بمسح الكمية الزائدة بسرعة. اترك الغراء ليجف حتى يجف تماماً. وباستخدام مثقاب أسنان مثبت عليه ريشة من الفولاذ المقاوم للصدأ بقطر 0.7 millimeter، ابدأ في ترقيق الجمجمة في نافذة التصوير.قم بالتبديل بين الحفر والتطبيق المتقطع لمحلول ملحي معقم بتركيز 0.9%، وذلك لتجنب توليد حرارة زائدة على الجمجمة. قم بترقيق نافذة بمقاس 4×4 مليمتر على الجمجمة باستخدام ضربات صغيرة عبر سطح الجمجمة.باستخدام المثقاب السني، يتم اختبار مدى رقة الجمجمة باستخدام ملقط ذو طرف غير حاد؛ حيث سيحدث انبعاج طفيف في سطح الجمجمة عند تطبيق ضغط خفيف.يتراوح سمك الجمجمة الأمثل للتصوير بين 10 و 30 ميكرون. وبمجرد ترقيق الجمجمة، قم بتنظيف نافذة التصوير من جميع الشوائب ووضع المحلول الملحي على الجمجمة. ثم قم بتصوير نافذة التصوير باستخدام كاميرا رقمية مثبتة على مجهر تشريحي.ستساعد الأوعية الدموية الدماغية في هذه الصورة في تحديد الموضع المناسب لوضع لوحة التصوير في جلسات التصوير اللاحقة. انقل الحيوان إلى منصة التصوير ثنائي الفوتون. يجب أن يظل الحيوان على بطانية التدفئة، مع مراقبة درجة حرارة الجسم باستمرار طوال جلسة التصوير.مجهر ثنائي الفوتون مزود بليزر mi tai. يتم استخدام مضخة حالة صلبة بقدرة 10 watt لتحقيق أقصى قدر من الطاقة، ووحدة confocal من طراز Olympus flow view معدلة. النظام مُحسَّن للتصوير العميق للأنسجة، وقد تم تركيب كواشف خارجية في أقرب نقطة ممكنة من العدسة الشيئية للسماح بأقصى قدر من الكشف عن الفلورة في الدماغ؛ أضف قطرة من المحلول الملحي إلى نافذة التصوير باستخدام تكبير رقمي منخفض.حدد منطقة تحتوي على عصبونات مصبغة بوضوح باستخدام كاميرا رقمية مثبتة بالمجهر. بعد ذلك، التقط صورة لمنطقة التصوير. يعد هذا الإجراء ضرورياً للعودة إلى نفس موقع التصوير في نقطة زمنية لاحقة.قم بالحصول على مجموعة من الصور بتكبير منخفض تشمل كامل المدى المرئي للدماغ لإظهار مدى التفرع الشجيري. سيتم استخدام هذه الصور لتحديد منطقة التصوير في النقاط الزمنية اللاحقة، حيث تحافظ كل من الأوعية الدموية والزوائد الشجيرية على بنيتها في الحيوانات الصغيرة والبالغة باستخدام برنامج التصوير.قم بزيادة التكبير الرقمي ثماني مرات، واضبط إحداثيات XY إذا لزم الأمر، ثم قم بتجميع مكدس (stack) بتكبير عالٍ، وهو ما سيظهر المورفولوجيا الشجيرية المفصلة بما في ذلك مواقع وبنية الأشواك الشجيرية. دوّن ملاحظات تفصيلية بخصوص كل عملية تجميع مكدس، بما في ذلك إحداثيات التحريك (pan coordinates)، ونطاق التجميع، وحجم خطوة Z، وعدد الخطوات في المكدس. ستُستخدم هذه الملاحظات عند العودة إلى هذه الشجيرة أو المحوار في نقطة زمنية لاحقة.بعد التصوير، قم بإزالة صفيحة الرأس عن طريق فصلها برفق عن سطح الجمجمة باستخدام الملقط. قم بإزالة أي بقايا غراء وامسح الجمجمة بمحلول ملحي معقم بتركيز 0.9%.قم بخياطة الجلد فوق الجمجمة باستخدام خيط خياطة رقم 6. امسح المنطقة بـ 70% ethanol بعد الانتهاء من إجراء التصوير. ضع الحيوان في قفص نظيف تحت مصباح حراري حتى يستيقظ ويستعيد قدرته على الحركة.بعد ذلك، أعد الحيوان إلى قفصه الأصلي لتصويره مرة أخرى في نقطة زمنية لاحقة، تتراوح من يومين إلى عدة أشهر، ثم قم بإزالة الغرز وإعادة فتح الجلد في منطقة الرأس. وباستخدام طرق معقمة، استعن بالصورة الرقمية للأوعية الدموية في الدماغ التي تم التقاطها أثناء الجراحة الأولى لتحديد موقع التصوير الأصلي. ثم أعد تثبيت لوحة الرأس كما فعلت سابقاً.استخدم شفرة جراحة مجهرية لترقيق أي عظم قد يكون قد نما مجددًا بين الفترات الزمنية للتصوير برفق إذا لزم الأمر. قم بالترقيق باستخدام مثقاب أسنان، ونظف نافذة التصوير من الحطام ثم ضع قطرة من 0.9%sterile saline. انقل الحيوان إلى مجهر فوتوني ثنائي (two photon microscope) وحدد منطقة التصوير الأصلية باستخدام الصورة الفلورية الرقمية التي تم التقاطها خلال الجلسة السابقة.ابدأ تشغيل برنامج عرض التدفق. افتح الصورة الأصلية ذات التكبير المنخفض، وثبّت ورقة شفافة على شاشة الكمبيوتر وارسم نمط الأوعية الدموية الرئيسية باستخدام قلم شفاف. بعد ذلك، افتح الصورة المباشرة وأعد محاذاة الأوعية الدموية لتتطابق مع النمط المرسوم على الفيلم الشفاف.قم بإزالة الورقة الشفافة لإعادة تصوير التراكيب المكبرة بمقدار 8 مرات. افتح مجموعة الصور المكدسة (stack) المطلوبة التي تم جمعها من جلسة التصوير السابقة. ارسم التراكيب على فيلم شفاف مثبت على شاشة الكمبيوتر.قم بتكبير الصورة الحية بمقدار ثمانية أضعاف وقم بمحاذاة الصورة مع الشريحة الشفافة. وبناءً على دقة محاذاة الموقع عند التكبير المنخفض، قد يكون من الضروري أيضاً ضبط زاوية الصورة قليلاً؛ قم بتعيين إحداثيات التحريك وفقاً لمعايير التصوير لليوم الأول، بما في ذلك حجم الخطوة وعدد الصور التي سيتم جمعها في مجموعة الـ Z-stack. يمكن إجراء إعادة التصوير مرتين، ويجب الحد من عدد مرات فتح فروة الرأس لتجنب الإخلال بسلامة الجمجمة، مما سيؤدي إلى ضعف دقة التصوير في الفئران التي تعبر عن GFPM.تم تصوير مجموعة فرعية من خلايا الطبقة الخامسة حول الهامشية والزوائد الشجيرية المقابلة لها باستخدام المجهر الليزري الماسح ثنائي الفوتون في الجسم الحي، وتظهر هنا الزوائد الشجيرية للقشرة البصرية الموسومة ببروتين GFP. هذه الصورة هي مسقط لصورة واحدة تم الحصول عليها كل 5 microns من الـ PIA وصولاً إلى عمق نهائي قدره 175 microns. تظهر المنطقة المحددة بإطار هنا بتكبير أعلى في اليوم صفر، ومرة أخرى في اليوم الرابع هنا، مع مقارنة لصورة فرع شجيري بتكبير أعلى من اليوم صفر واليوم الرابع.توضح هذه الصور الأشواك المستقرة التي تشير إليها رؤوس السهام البيضاء، والأشواك التي تلاشت وتراجعت والتي تم تمييزها برؤوس سهام حمراء، والأشواك الجديدة التي يشير إليها رأس السهم الأخضر. لقد عرضنا لكم للتو كيفية إجراء التصوير المزمن بفوتونين في القشرة البصرية للفأر باستخدام تحضير الجمجمة الرقيقة. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر توخي عناية خاصة أثناء عملية الترقيق لتجنب إتلاف الجمجمة والأم الجافية الموجودة أسفلها، لأن ذلك سيؤدي إلى ضعف دقة التصوير، كما يجب تدوين ملاحظات تفصيلية.هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.

chronic-imaging-mouse-visual-cortex-using-thinned-skull

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

هذا الفيديو وبروتوكول لشرح كيفية زرع زجاج النافذة المغطاة الجمجمة لدى القوارض. ويمكن استخدام هذه المستحضرات لمزمنة في الجسم الحي two الفوتون التصوير من القشرة المخية الحديثة على جداول زمنية لأشهر. ويمكن أيضا استخدامه لأنواع أخرى من التصوير ، والتصوير الضوئي بما في ذلك إشارة جوهرية.

إجراء جراحة حج القحف لتصوير الدماغ المزمن

نحن تصف طريقة لتصور مرارا الفئران الخلايا الدبقية الصغيرة وتعميم...

تقنية نافذة رقيقة الجمجمة لالمزمنة ثنائي الفوتون في الجسم الحي التصوير من الخلايا الدبقية الصغيرة في الفئران نماذج من Neuroinflammation

نقدم وسيلة لتشكيل نافذة التصوير في جمجمة الفأر الذي يمتد ملليمتر وغير مستقرة لشهور دون التهاب في الدماغ. هي مناسبة تماما هذه الطريقة لدراسات طولية من تدفق الدم، وديناميات الخلوية، وخلية / بنية الأوعية الدموية باستخدام ثنائي الفوتون المجهري.

مصقول وعززت ضعيفة، جمجمة نافذة على المدى الطويل التصوير من مخ الفأر

من خلال الجمع بين ومصقول المقوى رقيقة الجمجمة (منافذ) الجمجمة وورم أرومي دبقي إطار حقن الخلايا (GBM)، يمكننا أن نلاحظ بدء دبقي والنمو من خلايا GBM حقن في دماغ فأر حي طوليا.

بدء تصوير دبقي<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; من خلال نافذة رقيقة الجمجمة ملمع وعززت القحف

نقدم وسيلة لخلق نافذة ضعيفة-الجمجمة القشرية (TSCW) في نموذج الفأر...

ضعفت-الجمجمة وتقنيات النافذة القشرية لل<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; البصرية بالاتساق التصوير المقطعي التصوير

يوفر التصوير بفاصل زمني &lt; p class = 'jove_content'&gt; في الحي معلومات قيمة عن إعادة التنظيم الهيكلي في الدماغ السليم. هنا ، نقدم مستحضر جمجمة رقيق يسمح بالتصوير عبر الجمجمة للهياكل المشبكية المصنفة بالفلورسنت في قشرة الفأر الحي عن طريق الفحص المجهري ثنائي الفوتون.

ثنائي الفوتون<em&gt; في الجسم الحي</em&gt; التصوير من العمود الفقري شجيري في اللحاء باستخدام الماوس الجمجمة ضعفت إعداد

الصدمة الدماغ الحاد هو إصابة الشديدة التي لا يوجد لديه العلاج المناسب حتى الآن. Multiphoton المجهري يسمح دراسة طوليا عملية التنمية الصدمة الدماغ الحادة وسبر الاستراتيجيات العلاجية في القوارض. وأظهرت نموذجين من الصدمة الدماغ الحادة درس في الجسم الحي مع اثنين من الفوتون التصوير من الدماغ في هذا البروتوكول.

الصدمة الحادة الدماغ في الفئران تليها الطولية التصوير ثنائي الفوتون

توضح هذه المخطوطة إجراء لتتبع إعادة تشكيل cerebrovasculature خلال تراكم ترسبات الأميلويد في الجسم الحي باستخدام طولية اثنين من الفوتون المجهري. وإعداد ضعفت الجمجمة يمكن تصور الأصباغ الفلورية لتقييم تطور الضرر الدماغية في نموذج الفأر من مرض الزهايمر.

طولي<em&gt; في فيفو</em&gt; التصوير من Cerebrovasculature: الأقرب للأمراض الجهاز العصبي المركزي

يصف هذا البروتوكول تقنية زرع نافذة القحفية المزمنة التي يمكن استخدامها للتصوير الطولي للهياكل العصبية-الدبقية-الأوعية الدموية، والتفاعلات، والوظيفة في كل من الظروف الصحية والمُرَضَّة. وهو بمثابة بديل تكميلي لنهج التصوير عبر الكريات الذي، رغم أنه يفضل في كثير من الأحيان، فإنه يمتلك بعض القيود الحرجة.

رسم خرائط دقيقة للدماغ لأداء المتكررة في التصوير فيفو من ديناميات العصبية المناعية في الفئران

يظهر هنا بروتوكول لزرع نافذة جمجمة مزمنة للتصوير الطولي لخلايا الدماغ في الفئران المستيقظة المقيدة الرأس.

زرع نافذة جمجمية للتصوير المتكرر في الجسم الحي في الفئران المستيقظة

تعلم تقنية التصوير المزمن للقشرة البصرية في الفئران باستخدام إعداد الجمجمة الرقيقة. تتيح هذه الطريقة مراقبة ديناميكيات الأشواك التشعبية الحية لفهم اللدونة العصبية.

مزمنة التصوير ماوس القشرة البصرية باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة

استكشف المزيد من الفيديوهات