مزمنة التصوير ماوس القشرة البصرية باستخدام إعداد ضعفت - الجمجمة

العمود الفقري المتغصني عبارة عن نتوءات غشائية من تغصنات الخلايا العصبية التي تتلقى مدخلات متشابكة. يحدث إطالة أو تقلص مظهر أو اختفاء العمود الفقري استجابة للتغيرات في وظيفة الشبكة العصبية الناتجة عن أنماط محددة من النشاط العصبي. تعرف هذه الظاهرة باسم اللدونة القشرية لمراقبة التغيرات المورفولوجية في العمود الفقري المتغصن.

في الحية ، يتم لصق لوحة تصوير على جمجمة الفأر. يتم ترقق منطقة من الجمجمة جراحيا والصور مطلوبة بتكبير منخفض ومرتفع. ثم يتم إعادة تصوير المناطق في نقاط زمنية لاحقة.

تظهر النتائج التي تم الحصول عليها أنه يمكن تصور مورفولوجيا العمود الفقري المتغصني بوضوح باستخدام مستحضر جمجمة رقيقة في نقاط زمنية متعددة. وهذا التشكل في العمود الفقري شديد المرونة ، ويظهر تغيرات في الهيكل وكذلك ظهور واختفاء العمود الفقري المتغصن. مرحبا ، أنا إميلي كيلي في مختبر أنايا ماكا في قسم علم الأعصاب والتشريح بجامعة روتشستر.

سنعرض لك اليوم إجراء التصوير المزمن لقشرة قارورة الفأر بعد زعانف تسمى التحضير. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة دوران العمود الفقري المتغصن. لذلك دعونا نبدأ.

ابدأ الإجراء بتعقيم أدوات الجراحة المعقمة. ثم قم بتعقيم مساحة العمل باستخدام 70٪ من الإيثانول وقم بتغطية سطح التشغيل بضمادة نظيفة. راقب عمق التخدير في فأر مخدر كوكتيل الفنتانيل عن طريق اختبار استجابته لقرصة إصبع القدم ، الماوس الموضح هنا هو الفأر المعدل وراثيا A-G-F-P-M الذي يتم فيه التعبير عن GFP.

في الطبقة الخامسة من الخلايا شبه المعدنية التي تعرض العمليات المتغصنة في طبقات سطحية. للحفاظ على درجة حرارة الجسم 37.5 درجة مئوية ، ضع على بطانية تدفئة وراقبه باستخدام مقياس حرارة مستقيمي مرفق. ثم ضع مرهم العين على العينين لمنعهما من الجفاف باستخدام المقص.

قم بإزالة الشعر من مؤخرة رأس الفأر من خلف الأذنين إلى العينين. ثم نظف الجزء العلوي من رأس بتطبيق 70٪ من الإيثانول ، متبوعا بمقشر البيتادين ومحلول البيتادين. قم بعمل شق LCU خلف الأذنين وأعلى على طول الجانب الأيمن أو الأيسر من خط الوسط ، اعتمادا على نصف الكرة الأرضية الذي سيتم تصويره للعينين ، قم بطي الجلد فوق وبعيدا عن موقع الجراحة.

لا تقم بإزالة الجلد لأنه سيتم خياطته لاحقا باستخدام ملقط ناعم. اسحب الجلد برفق لأعلى وبعيدا عن منطقة الاهتمام. باستخدام ملقط نظيف ، اكشط السمحاق برفق من المنطقة المكشوفة من الجمجمة.

ضع كمية صغيرة من الكلوريد العادل بنسبة 10٪ على الجمجمة لتجفيف غشاء السمحاق تماما والتأكد من إزالته تماما. من المهم أن تكون الجمجمة جافة تماما. لضمان الالتصاق السليم بالغراء ، اكشط غشاء السمحاق المجفف برفق بشفرة جراحية مجهرية.

بعد ذلك ، ضع طبقة رقيقة من غراء الأكريليك سانو حول نافذة التصوير للوحة الرأس المصنوعة من الفولاذ المقاوم للصدأ وقم بلصق اللوحة على الجمجمة. باستخدام الطرف الخشبي لعصا مسحة القطن ، ضع الغراء على اللحامات الداخلية لنافذة التصوير ، مع التأكد من ملء جميع الفجوات بين لوحة التصوير وانحناء الجمجمة. ضع قطرة من مسرع الغراء في النافذة.

ثم امسح الفائض بسرعة. اترك الغراء يجف بمجرد أن يجف الغراء تماما. باستخدام مثقاب أسنان مثبت بأزيز من الفولاذ المقاوم للصدأ 0.7 ملم ، ابدأ في ترقق الجمجمة في نافذة التصوير.

الحفر البديل مع التطبيق العرضي للمحلول الملحي المعقم بنسبة 0.9٪. لتجنب توليد الكثير من الحرارة على الجمجمة. قم بترقيق نافذة أربعة في أربعة ملليمترات على الجمجمة باستخدام ضربات صغيرة عبر سطح الجمجمة.

مع مثقاب الأسنان. اختبر نحافة الجمجمة باستخدام ملقط نهاية حاد. سوف ينفجر سطح الجمجمة قليلا بضغط لطيف.

يتراوح سمك الجمجمة الأمثل للتصوير بين 10 و 30 ميكرون. بمجرد ترقق الجمجمة ، نظف النافذة من جميع الحطام وضع محلول ملحي على الجمجمة. قم بتصوير نافذة التصوير بكاميرا رقمية مثبتة على نطاق تشريح.

ستساعد الأوعية الدموية الدماغية في هذه الصورة في تحديد موضع وضع لوحة التصوير لجلسات التصوير اللاحقة. انقل إلى جهازي الفوتون. يجب أن يظل على بطانية التدفئة ويجب مراقبة درجة حرارة الجسم بشكل مستمر طوال جلسة التصوير.

مجهر ثنائي الفوتون مع ليزر مي تاي. يتم استخدام مضخة الحالة الصلبة بقدرة 10 وات للحصول على أقصى طاقة ووحدة متحدة البؤر معدلة لعرض تدفق أوليمبوس. تم تحسين النظام لتصوير الأنسجة العميقة ويتم تثبيت أجهزة الكشف الخارجية بالقرب من الهدف قدر الإمكان للسماح بأقصى قدر ممكن من الكشف عن التألق من الدماغ ، وإضافة قطرة من المحلول الملحي إلى نافذة التصوير باستخدام التقريب الرقمي المنخفض.

حدد منطقة تحتوي على خلايا عصبية ذات علامات زاهية باستخدام كاميرا رقمية مثبتة على المجهر. Ips ، التقط صورة لمنطقة التصوير. هذا ضروري للعودة إلى نفس موقع التصوير في نقطة زمنية لاحقة.

الحصول على كومة تكبير منخفضة من خلال المدى المرئي الكامل للدماغ يبين مدى التشعب الشجيري. سيتم استخدام هذا لتحديد موقع منطقة التصوير في نقاط زمنية لاحقة مثل الأوعية الدموية والتشعبات. الحفاظ على هيكلها في الصغيرة والبالغة باستخدام برامج التصوير.

قم بزيادة التكبير الرقمي ثمانية أضعاف ، واضبط إحداثيات XY إذا لزم الأمر ، واجمع مكدس تكبير عالي ، والذي سيظهر مورفولوجيا تغصنية مفصلة بما في ذلك مواقع وهيكل العمود الفقري المتغصن. قم بتدوين ملاحظات مفصلة بخصوص كل مجموعة مكدس، بما في ذلك إحداثيات التحريك ونطاق المجموعة وحجم خطوة Z وعدد الخطوات في المكدس. سيتم استخدام هذه الملاحظات عند العودة إلى هذا الشجيرات أو المحور العصبي في نقطة زمنية لاحقة.

بعد التصوير ، قم بإزالة لوحة الرأس عن طريق فصلها برفق عن سطح الجمجمة. باستخدام ملقط. قم بإزالة أي غراء متبقي وامسح الجمجمة بمحلول ملحي معقم بنسبة 0.9٪.

خياطة الجلد فوق الجمجمة معا باستخدام خيط الخياطة رقم ستة. امسح المنطقة بنسبة 70٪ من الإيثانول بعد إجراء التصوير. ضع في قفص نظيف تحت مصباح حراري حتى يستيقظ ويصبح متحركا.

ثم أعد إلى قفصه الأصلي لتصوير مرة أخرى في وقت لاحق في أي مكان من يومين إلى عدة أشهر بعد ذلك ، وقم بإزالة الغرز وإعادة فتح الجلد على الرأس. باستخدام طرق معقمة ، استخدم الصورة الرقمية لالأوعية الدموية الدماغية التي تم التقاطها أثناء الجراحة الأولى لتحديد موقع التصوير الأصلي. ثم أعد إصلاح لوحة الرأس كما كان من قبل.

استخدم شفرة جراحية مجهرية لتخفيف أي عظم قد يكون قد عاد النمو بين النقاط الزمنية للتصوير إذا لزم الأمر. رقيقة باستخدام مثقاب الأسنان ، قم بتنظيف نافذة التصوير من الحطام ووضع قطرة من 0.9٪ محلول ملحي معقم. احمل إلى مجهر ثنائي الفوتون وحدد موقع منطقة التصوير الأصلية باستخدام صورة الفلورسنت الرقمية التي تم التقاطها خلال الجلسة السابقة.

ابدأ برنامج عرض التدفق. افتح الصورة الأصلية للتكبير المنخفض ، وقم بلصق ورقة شفافية على شاشة الكمبيوتر وارسم نمط الأوعية الدموية الرئيسية باستخدام قلم شفاف. بعد ذلك ، افتح الصورة الحية وأعد محاذاة الأوعية الدموية مع النمط المرسوم على فيلم الشفافية.

قم بإزالة الشفافية لإعادة تصوير الثمانية × المكبرة في الهياكل. افتح المكدس الذي تم جمعه المطلوب من جلسة التصوير السابقة. ارسم الهيكل على فيلم شفاف مثبت على شاشة الكمبيوتر.

قم بتكبير ثمانية أضعاف من الصورة الحية وقم بمحاذاة الصورة مع الشفافية. اعتمادا على دقة محاذاة موقع التكبير المنخفض ، قد يكون من الضروري أيضا ضبط زاوية الصورة قليلا لضبط إحداثيات التحريك على معلمات التصوير في اليوم الأول ، بما في ذلك حجم الخطوة وعدد الصور التي يتم جمعها يمكن إجراء إعادة تصوير Zack مرتين. يجب أن يكون عدد المرات التي يتم فيها فتح فروة الرأس محدودا لتجنب تعطيل سلامة الجمجمة ، مما سيؤدي إلى ضعف دقة التصوير في الفئران التي تعبر عن GFPM.

تم تصور مجموعة فرعية من الخلايا شبه المعدنية من الطبقة الخامسة والعمليات التغصنية المقابلة باستخدام في الجسم الحي اثنين من الفحص المجهري للمسح الضوئي بالليزر الفوتون هنا ، يتم عرض تشعبات القشرة البصرية المسماة GFP. هذه الصورة عبارة عن إسقاط لصورة واحدة تم الحصول عليها كل خمسة ميكرون من PIA إلى عمق نهائي يبلغ 175 ميكرون. تظهر المنطقة المحاصرة بتكبير أعلى هنا في اليوم صفر ، ومرة أخرى في اليوم الرابع هنا ، تمت مقارنة تكبير أعلى لصورة فرع شجيري من اليوم صفر واليوم الرابع.

توضح هذه الصور أشواكا مستقرة تشير إليها رؤوس الأسهم البيضاء المفقودة من الأشواك المتراجع ، والتي تتميز برأس سهم أحمر وأشواك جديدة يشار إليها برأس السهم الأخضر. لقد أوضحنا لك للتو كيفية إجراء تصوير الفوتونين المزمن في القشرة البصرية للفأر باستخدام مستحضر جمجمة رفيع. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر توخي الحذر بشكل خاص أثناء عملية التخفيف لتجنب تلف الجمجمة والجافية الأساسية لأن هذا سيؤدي إلى ضعف دقة التصوير وتدوين الملاحظات التفصيلية.

هذا كل شيء. شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.