Name: IP - FCM : مناعي التي كشفتها التدفق الخلوي (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-02T10:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 17 s
Description: تعلم تقنية IP-FCM لدراسة تفاعلات البروتين-البروتين الأصلية باستخدام الخرز المغطى بالأجسام المضادة وتحليل الخلايا التدفقي. تتيح هذه الطريقة الكشف الحساس بدون هندسة وراثية أو عينات كبيرة.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل على جائزة الابتكار النسور (ترتيب الشقيق النسور) ، ومؤسسة مايو كلينيك.

** يعتمد هذا البروتوكول على نشر الفيديو المرتبطين بها 1 : حساسية عالية الكشف والتحليل الكمي للتفاعلات البروتينات والبروتين والمجمعات multiprotein الأصلية بواسطة التدفق الخلوي. آدم زاي Schrum ، ديانا جيل ، P. Dopfer الين ، ديفيد ويست إل ، لورانس ألف Turka ، وولفغانغ WA Schamel ، إد بالمر. STKE العلم في 2007 (389) : PL2 ، 5 حزيران 2007 ، [DOI : 10.1126/stke.3892007pl2]. <a href="http://stke.sciencemag.org/cgi/content/abstract/2007/389/pl2">الرجاء النقر هنا لرؤية هذا المنشور</a> . قبل البدء ، وبعد تحضير ألبوم الحلول المائية : <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> MES توصيلات الاحتياطي : </td><td> تخزين في درجة حرارة 25 مئوية </td></tr><tr><td> MES ، ودرجة الحموضة 6.0 </td><td> 50 ملي </td></tr><tr><td> EDTA </td><td> 1 ملم </td></tr><tr><td> تبريد / حظر / التخزين (QBS) العازلة : </td><td> المحل في 4 درجات مئوية </td></tr><tr><td> BSA </td><td> 1 ٪ </td></tr><tr><td> أزيد الصوديوم </td><td> 0.02 ٪ </td></tr><tr><td> برنامج تلفزيوني ، ودرجة الحموضة 7.4 </td><td> 1X </td></tr><tr><td> FCM الاحتياطي : </td><td> المحل في 4 درجات مئوية </td></tr><tr><td> تريس ، ودرجة الحموضة 7.4 </td><td> 50 ملي </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 100 ملي </td></tr><tr><td> أزيد الصوديوم </td><td> 0.02 ٪ </td></tr><tr><td> FBS </td><td> 5 ٪ </td></tr><tr><td> برنامج تلفزيوني ، ودرجة الحموضة 7.4 </td><td> 1X </td></tr></tbody></table> إعداد مباشرة قبل الاستعمال : <table style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> EDAC - MES : </td><td> حل 50 ملغ / مل مسحوق EDAC في مخزن توصيلات MES </td></tr><tr><td> ديجيتونين حل (2 ٪ وزن / V) : </td><td> مسحوق يذوب في ديجيتونين درهم 2 O عن طريق التسخين إلى 95 درجة مئوية لمدة 5min التبريد ثم على الجليد </td></tr><tr><td> تحلل الاحتياطي : </td><td></td></tr><tr><td> تريس ، ودرجة الحموضة 7.4 </td><td> 50 ملي </td></tr><tr><td> كلوريد الصوديوم </td><td> 150 ملم </td></tr><tr><td> ديجيتونين الحل </td><td> 1 ٪ </td></tr><tr><td> مثبطات الأنزيم البروتيني </td><td> 1X </td></tr><tr><td> تبقي على الجليد </td><td></td></tr></tbody></table> 1. اقتران خريطة موقع لالخرز <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحديد تركيز حبات من الأسهم المشتراة من قبل تمييع في برنامج تلفزيوني والفرز مع عدادة الكريات. تبدأ 1:10000 التخفيف من الخرز لفرزها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ماصة 18 × 10 6 حبات في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات 2 إلى 3 مرات في 0،5-1،0 مل الاحتياطي توصيلات زارة التربية والعلم ، الطرد المركزي في 20000 ز لمدة 3 دقائق عند 25 درجة مئوية بعد كل غسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخرز في 50 ميكرولتر الاحتياطي توصيلات زارة التربية والعلم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تنشيط مجموعات الكربوكسيل على الخرز بإضافة 20 ميكرولتر من الطازجة MES - EDAC. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المزيج برفق لمدة 15 دقيقة عند درجة حرارة 25 مئوية بحلول pipetting يدويا صعودا وهبوطا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات تنشيط 2 إلى 3 مرات في برنامج تلفزيوني مل 0،5-1،0 ، الطرد المركزي في 20000 ز لمدة 3 دقائق عند 25 درجة مئوية بعد كل غسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend حبات تنشيط برنامج تلفزيوني في 50 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 50 ميكرولتر من خريطة موقع IP (0،2-1،0 في تركيز الأسهم ملغ / مل) إلى الحل حبة تفعيلها. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المزيج لمدة 3 إلى 4 ساعات عند درجة 25 عن طريق وضع أنبوب على شاكر تهتز. بما فيه الكفاية لمنع زعزعة الاستقرار من الخرز على الجزء السفلي من الأنبوب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات خريطة موقع ، إضافة 2 إلى 3 مرات في برنامج تلفزيوني مل 0،5-1،0 ، الطرد المركزي في 20000 ز لمدة 3 دقائق عند 25 درجة مئوية بعد كل غسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخرز في 100 مخزن QBS ميكرولتر. ويمكن تخزين هذه في 4 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تعليق الخرز جيدا ، وتمييع 1:200-1:10،000 في برنامج تلفزيوني والعد مع عدادة الكريات. يجب أن يكون قياس تركيز كل دفعة إعدادي ، بحيث يمكن لعدد من الخرز المستخدمة في كل تجربة أو IP المنسدلة التي تسيطر عليها بدقة. </li></ol> 2. آخر الحائزة إعداد Lysate والملكية الفكرية والأسلوب وتحلل الأوضاع تحلل الأمثل تعتمد على نوع من الخلايا والبروتين البروتين التفاعلات يجري فحصها. وهناك عدد من البروتوكولات موجودة ويمكن تعديلها لطلبك. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ليز 20 × 10 6 'الصغيرة' الخلايا ، مثل الخلايا اللمفية ، أو 5 × 10 6 'كبيرة' الخلايا ، مثل الخلايا البلعمية الكبيرة أو الخلايا السرطانية ، في 100 ميكرولتر تحلل عازلة جديدة في أنبوب microcentrifuge 1.5 مل ل20min على الجليد. مقياس حجم تحلل حسب الحاجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لإزالة النوى والحطام الخلوية غير قابلة للذوبان ، وأجهزة الطرد المركزي في lysate ز 20000 لمدة 10 دقيقة على 4 درجات مئوية. وطاف الاحتفاظ تجاهل بيليه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 0.5 × 10 5-2،5 X - 10 5 خريطة موقع يقترن الخرز lysate إلى توضيح ، pipetting برفق لالمزيج. حجم الحد الأدنى الذي نستخدمه لأداء IP واحد هو 5 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان على رأسي 4 ساعات بالتناوب العجلة ليلة وضحاها في غرفة باردة. لتعيين سرعة كافية للحيلولة دون تسوية من الخرز. فمن المقبول بالنسبة للسيولة منخفضة حجم الشرطة العراقية أن تبقى في قاع الأنبوب أثناء الدوران. </li></ol> 3. تحقق من الخرزة التي تم الاستيلاء عليها ملون تألقي مع البروتين ، مترافق الأضداد <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تغسل حبات IP مرتين في 0،2-1،0 مل الجليد الباردة الاحتياطي FCM ، الطرد المركزي في 20000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق بعد كل غسل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخرز في 100 ميكرولتر FCM 20 ميكرولتر العازلة وقسامة في كل من خمسة أو أكثر أنابيب microcentrifuge 1.5 مل أو الآبار لوحة مدخنة القاع. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة ملون تألقي ، مترافق MABS للعينات. نفذ FCM صمة عار وفقا لتعليمات للبائع أو وفقا لتركيزات تحدد تجريبيا. كنقطة انطلاق ، إضافة 0،2-1 ميكرولتر من محلول الأجسام المضادة الأسهم (في 0،2-1،0 ملغ / مل) في أنبوب أو جيدا ، واحتضان لمدة 40 دقيقة على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بحث تغسل حبات في 1.5 مل مرتين في أنابيب 1.0 مل الاحتياطي FCM الجليد الباردة ، الطرد المركزي في 20000 ز عند 4 درجة مئوية لمدة 3 دقائق بعد كل غسل. طاف إزالة بلطف بعد كل غسل ، مع الحرص على عدم تعكير صفو الخرز. لوحة مدخنة القاع ، ويغسل مرتين مع 0.2 مل من الجليد الباردة الاحتياطي FCM ، الطرد المركزي في 1000g لمدة 5 دقائق حتى 4 بعد كل غسل درجة مئوية. A pipettor الأقنية مفيد لهذه الخطوة. لإزالة طاف من الخرز في صفيحة مدخنة القاع ، 'نفض الغبار" لوحة واحدة ، ثم ، في حين لا تزال مقلوبة ، أي لطخة تقطر من حواف الآبار. حجم المتبقية في كل بئر ، الذي يحتوي على حبات ، وسوف تكون حوالي 20 ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend الخرز في 200 مخزن FCM ميكرولتر لكل عينة. لأنابيب نقل FACS المسمى. نماذج جاهزة الآن لFCM. </li></ol> 4. FCM اقتناء حبات CML الموصوفة في هذا البروتوكول 3 إلى 5 ميكرون في القطر ، ما يقرب من نصف قطرها من اللمفاويات الماوس هادئة. لذلك ، قد يكون من الضروري زيادة يدويا مبعثر إلى الأمام (FSC) أمبير وكسب مبعثر الجانبية (SSC) الجهد من أجل سكان حبة لتسجيل الأحداث على نطاق واسع. ينبغي الخرز IP فردية تشكل احد سكان مجمع بإحكام. وينبغي تعديل الإعدادات وبوابة لاستبعاد doublets حبة والحطام. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قبل تشغيل أو معايير الخرز حبة ، إزالة الأكمام الاحتواء الحبرية التي تحيط مدخل عينة على بعض cytometers. تسمح السائل إلى غمد بالتنقيط بين العينات ، لأن هذا سيؤدي إلى مسح المدخل ، ومنع من الخرز يجري ترحيلها من عينة واحدة إلى أخرى. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الخرز غير المسماة ، والسيطرة السلبية لمضان ، والجسيمات معايرة قوس قزح (عمليات التشاور الإقليمي) ، والسيطرة الإيجابية لمضان ، لضبط الإعدادات بحيث أن كلا من النهايات السلبية والإيجابية مضان تظهر في نفس الوقت على محور س تسجيل النطاق. هذا يضمن أن مضان من العينات التجريبية ستكون أيضا على نطاق واسع. علما بأن عمليات التشاور الإقليمي هي أصغر من حبات CML ، لذا FSC والمعلمات محكمة أمن الدولة ، فضلا عن موقف البوابة ، قد تحتاج إلى تغيير مؤقت لتلك العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عودة إلى غير المسماة ، حبة الإعدادات مرة واحدة مع المعايرة اكتمال عمليات التشاور الإقليمي. إذا تم استخدام واحد فقط لكل عينة الفلورسنت التحقيق ، أي تعويض مضان ضروري. بشكل عام ، ونحن التحقيق مع المجمعات multiprotein خريطة موقع ملون تألقي ، مترافق عينة واحدة لكل FCM ، ونحن شركاء دراسة التفاعل تلطيخ عينات متعددة بواسطة حبة بالتوازي مع MABS محددة لمفارز مختلفة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اكتساب وحفظ ملفات البيانات مضان. ثم يمكن أن يؤديها باستخدام تحليل التدفق الخلوي البرمجيات مثل CellQuest ، FlowJo ، أو CFlow. </li></ol> 5. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2066/2066fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1. IP - FCM لمجمع multiprotein TCR/CD3. خلايا تي من سلالة الماوس وlysed BALB / ج في ديجيتونين 1 ٪ ، وتعرضت لlysate FCM - IP استخدام الألغام المضادة للCD3ε الخرز. الواردة في المجمعات استولت على كميات كبيرة من TCR - β (المنطقة الأرجواني) ، وشارك المرتبطة CD3 - ε (الأخضر) ، ولكن ، على مقربة من المستويات الخلفية (التي حددتها لجنة التحقيق المناعي لا صلة لها بالموضوع ، والوردي التتبع) من البروتينات الأخرى مثل Thy1.2 CD45 ، أو H - 2K (د) (البني والبرتقالي والأزرق وآثار ، على التوالي). انظر نتائج مماثلة نشرت سابقا 1-6.

<ol><li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-sensitivity+detection+and+quantitative+analysis+of+native+protein-protein+interactions+and+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+STKE%22%5BJournal%5D)">High-sensitivity detection and quantitative analysis of native protein-protein interactions and multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Sci STKE. , pl2-pl2 (2007).</li>
<li>Schrum, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Visualization+of+multiprotein+complexes+by+flow+cytometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Protoc+Immunol%22%5BJournal%5D)">Visualization of multiprotein complexes by flow cytometry.</a> Curr Protoc Immunol. Chapter 5, 9-9 (2009).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+division+and+death+are+segregated+by+mutation+of+TCRbeta+chain+constant+domains%5BTitle%5D)+AND+%22Immunity%22%5BJournal%5D)">T cell division and death are segregated by mutation of TCRbeta chain constant domains.</a> Immunity. 21, 515-526 (2004).</li>
<li>Teixeiro, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Different+T+Cell+receptor+signals+determine+CD8%2B+memory+versus+effector+development%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Different T Cell receptor signals determine CD8+ memory versus effector development.</a> Science. 323, 502-505 (2009).</li>
<li>Treves, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Junctate+is+a+key+element+in+calcium+entry+induced+by+activation+of+InsP3+receptors+and%2For+calcium+store+depletion%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Junctate is a key element in calcium entry induced by activation of InsP3 receptors and/or calcium store depletion.</a> J Cell Biol. 166, 537-548 (2004).</li>
<li>Gil, D., Schrum, A. G., Alarcon, B., Palmer, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((T+cell+receptor+engagement+by+peptide-MHC+ligands+induces+a+conformational+change+in+the+CD3+complex+of+thymocytes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Med%22%5BJournal%5D)">T cell receptor engagement by peptide-MHC ligands induces a conformational change in the CD3 complex of thymocytes.</a> J Exp Med. 201, 517-522 (2005).</li>
</ol>

معلومات عن البروتين البروتين التفاعلات ذات الصلة للغاية لتحليل العديد من العمليات الخلوية مثل نقل الإشارة ، والنضج النسب ، تقدم دورة الخلية ، وشلالات موت الخلايا المبرمج. IP - FCM يوفر طريقة سريعة ، والكمية ، وحساسة لدراسة التفاعل بين البروتينات وتحديد أعضاء المجمعات multiprotein التشكل في وطنهم. ويمكن أن يترافق مع الخرز والمحتضنة lysates الخلية في يوم واحد ، ويمكن بحثها وتحليلها في اليوم التالي. تنسيق لوحة 96 - جيدا يسمح لأعداد كبيرة من عينات لتحليلها في وقت واحد لتوفير كفاءة جمع البيانات لأغراض إحصائية أو الفرز. باستخدام معايير حبة فلوري ، يمكن تقدير عدد من البروتينات التي استولت عليها في كل حبة. وهناك حاجة مادية ضئيلة للغاية من أجل القبض على مصدر والكشف ، وبالتالي لا تزال محدودة ، وعينات نادرة analytes يتم تحليلها لتفاعلات متعددة. على الرغم من أن الملكية الفكرية لا يتطلب FCM الهندسة الوراثية ، ووضع علامات حاتمة ، تمسخ ، أو في المختبر ، مزج البروتينات في بيئة غير فسيولوجية ، ويمكن أن يترافق مع هذه التقنيات وغيرها ، مما يجعلها أداة قيمة والوصول إلى تطبيق مع كثير من النظم البيولوجية. المشاكل : العديد من التجارب IP - FCM توليد بيانات مفيدة التفاعل البروتين المرة الأولى التي حاول فيها. ومع ذلك ، يمكن الاستفادة المثلى من FCM - IP تحسين تصريف الأجسام المضادة لالخرز ، والقبض على بروتين معقد ، والتحقيق الفلورسنت ملزمة. ويمكن تحديد كفاءة الاقتران الضد الملكية الفكرية من خلال التحقيق الخرز يقترن مباشرة مع الأضداد المضادة للالمناعي. إذا كان هذا هو الكفاءة المنخفضة ، ويمكن زيادة تركيز الأجسام المضادة خلال تفاعل الأضداد اقتران تسمح IP أكثر لنعلق على كل حبة. وهذا يمكن أن يزيد من قدرة ربط الدفعة حبة الملكية الفكرية ، مما أدى إلى القبض على تعزيز والكشف من analytes. ينبغي الأولية الأخرى التي تحتوي على جزيئات الأمينات (على سبيل المثال تريس ، ألبومين المصل البقري) لن يكون حاضرا أثناء اقتران رد فعل ، وهذه يمكن أن تتنافس مع خريطة موقع لمرفق حبة ويؤدي إلى اقتران خريطة موقع منخفض. إذا اقتران خريطة موقع ليثبت الخرز إشكالية لأسباب أخرى ، يمكن بدلا من ذلك إلى أن يقترن الخرز أفيدين / streptavidin ، والأجسام المضادة biotinylated يمكن في وقت لاحق غير محدد وتساهميا المستخدمة لimmunprecipitation. على الرغم من اقتران الأضداد جيدة ، قد كشف الأولي للحبة المرتبطة مضان تكون منخفضة. أولى ، قد تكون هي نفسها معقدة التقاط منخفضة. وذلك لأن IP - FCM يعتمد على تركيز من analytes ، وزيادة عدد الخلايا في حجم lysed تحلل زيادة حدة التقاط تحليلها والكشف. بالإضافة إلى ذلك ، قد يتم القبض على تعزيز من خلال خفض عدد من الخرز IP المحتضنة مع lysate ، التي توزع عبر المجمعات أسر أقل الخرز ، والنتائج في مضان زاد متوسط ​​لكل حبة عند بحثها. الثانية ، فمن الممكن أن يعرقل وصول sterically الضد التحقيق الى المجمعات التي استولت عليها immunoprecipitating الأضداد. في هذه الحالة ، يمكن أن تعالج المشكلة عن طريق استخدام أجسام مضادة مختلفة لالتقاط و / أو التحقيق.

<table><tbody><tr><td>خرزات لاتكس البوليستيرين المعدلة بالكربوكسيلات (CML) (5mm خالية من المواد الخافضة للتوتر السطحي)</td><td>كاشف</td><td>Interfacial Dynamics</td><td>2-5000</td><td>تُحفظ في درجة حرارة 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>جزيئات معايرة قوس قزح (Rainbow Calibration Particles)</td><td>كاشف</td><td>Spherotech, Inc.</td><td>RCP-30-5A</td><td>تُحفظ في درجة حرارة 4&amp;#x00B0;C.</td></tr><tr><td>حمض 2-[N-مورفولينو] إيثان سلفونيك (MES)</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M-5287</td><td></td></tr><tr><td>1-إيثيل-3-(3-ثنائي ميثيل أمينو بروبيل) كاربودييميد HCl (EDAC)</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>22980 E-6383</td><td>يُحفظ في درجة حرارة -20&amp;#x00B0;C تحت ظروف تجفيف.</td></tr><tr><td>مزيج مثبطات البروتياز للاستخدام العام، يحتوي على AEBSF وBestatin وAprotinin وEDTA وE-64 وLeupeptin</td><td>كاشف</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P-2714</td><td>يُحضّر محلول مخزون بتركيز 100x في H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O. يُقسم إلى حصص ويُحفظ في درجة حرارة -20&amp;#x00B0;C. يُتعامل معه باستخدام القفازات.</td></tr><tr><td>أطباق PCR، 96 بئراً، 0.2mL، طبيعية، ذات مدخنة طويلة</td><td>كاشف</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-408-230</td><td>تُستخدم بدلاً من أنابيب جهاز الطرد المركزي الدقيق أثناء صبغ FCM</td></tr></tbody></table>

ip - fcm : مناعي التي كشفتها التدفق الخلوي

IP-FCM:  Immunoprecipitation Detected by Flow Cytometry

مناعي الكشف عنها بواسطة التدفق الخلوي (IP - FCM) هو وسيلة فعالة لكشف وقياس البروتين البروتين التفاعلات. المبدأ الأساسي الذي يمتد من شطيرة ELISA ، حيث يمكن الكشف عن القبض على الحليلة الابتدائية مع الجزيئات الأخرى المرتبطة بدنيا داخل المجمعات multiprotein. الإجراء ينطوي على اقتران التساهمية من اللاتكس microbeads البوليسترين immunoprecipitating مع الاجسام المضادة (ماب) معينة للحصول على البروتين من الفائدة ، واحتضان هذه الخرز مع lysates الخلية ، وسبر مجمعات البروتين ملون تألقي مع أسر ، مترافق تحقيقات وتحليل حبة المرتبطة مضان بواسطة التدفق الخلوي. IP - FCM حساس للغاية ، يتيح تحليل البروتينات في الدولة الأم (غير المعطل) ، وإما قابلة للتحليل الكمي أو شبه كمي. ومزايا إضافية ، IP - FCM لا يتطلب أي معدات أو الهندسة الوراثية المتخصصة وغيرها من تدفق عداد الكريات ، ويمكن تكييفها بسهولة للتطبيقات عالية الإنتاجية.

ويقدم الأسلوب IP - FCM ، الذي يسمح للقوي وحساسة ، وتقييم من التفاعلات الكيميائية الحيوية البروتين البروتين الأصلي ، دون الحاجة إلى الهندسة الوراثية أو أحجام عينة كبيرة.

IP - FCM : مناعي التي كشفتها التدفق الخلوي

يعد الترسيب المناعي الذي يتم الكشف عنه بواسطة قياس التدفق الخلوي (IP-FCM) طريقة فعالة للكشف عن التفاعلات بين البروتينات وتقديرها كمياً. إن الأساس...

في تجارب IP FCM، يتم التقاط المعقدات البروتينية على حبيبات من أجل تحديد ودراسة البروتينات المختلفة التي تتفاعل مع بعضها البعض. أولاً، يتم ربط جسم مضاد للترسيب المناعي، يكون متخصصاً بالبروتين المستهدف، تساهمياً بحبيبات لاتكس من البوليسترين. وفي الخطوة الثانية، يتم تحضين هذه الحبيبات مع نواتج تحلل الخلايا، مما يسمح للبروتين المتخصص والبروتينات المتفاعلة بالارتباط بالحبيبات.تُغسل الخرزات مع البروتينات المُلتقطة، ثم تُفحص باستخدام أجسام مضادة موسومة فلورياً ومحددة لجزيئات مختلفة قد تكون مرتبطة بالبروتين الذي تم ترسيبه مناعياً. وأخيراً، يتم تحليل الخرزات الموسومة فلورياً بواسطة قياس التدفق الخلوي لتحديد البروتينات الموجودة أو الغائبة في المعقدات المُلتقطة. وتتمثل مزايا هذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى، مثل الترسيب المناعي المتبوع باللطخة الغربية، في قدرة تقنية I-P-F-C-M على السماح بتقييم تفاعلات البروتين-بروتين الأصلية دون الحاجة إلى هندسة وراثية أو أحجام عينات كبيرة.يمكن لتقنية I-P-F-C-M أن توفر نسبة إشارة إلى ضجيج عالية حتى عند توفر كمية ضئيلة جداً من المادة الحيوية للتحليل، حيث يمكن إجراؤها باستخدام أحجام صغيرة وتركيزات منخفضة من المواد التحليلية. لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير المحاليل المنظمة التالية: محلول MES للربط، ومحلول تخزين الحجب وإخماد المنظم (المشار إليه اختصاراً بـ QBS)، ومحلول قياس التدفق الخلوي أو محلول FCM. حدد تركيز حبيبات اللاتكس من البولystyrene المعدلة بمجموعات الكربوكسيل أو حبيبات CML عن طريق التخفيف في PBS والعد باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer).بمجرد تحديد تركيز الخرزات، قم بسحب 18 × 10⁶ من الخرزات باستخدام الماصة وضعها في أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter. اغسل الخرزات من مرتين إلى ثلاث مرات في 0.5 إلى 1 milliliter من منظم الربط MES، مع إجراء عملية الطرد المركزي بسرعة 20,000 ×g لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد كل عملية غسيل وأثناء دوران الخرزات في جهاز الطرد المركزي.قم بتحضير محلول MES المنظم الطازج الذي يحتوي على EDC وNHS لاستخدامه في تنشيط الخرزات. وبمجرد اكتمال عمليات الغسيل، احفظ المحلول المنظم إما في درجة حرارة الغرفة أو على الثلج. وبعد الغسلة الأخيرة، أعد تعليق الخرزات في 50 µL من محلول MES المنظم للربط.أضف بعد ذلك 20 µL من EEC MES إلى معلق الخرز. ولتنشيط مجموعات الكربوكسيل الموجودة على الخرز، اخلط بلطف في درجة حرارة الغرفة عن طريق السحب والطرد اليدوي المستمر باستخدام الماصة لمدة 15 دقيقة. ورغم أن هذه الخطوة تتطلب جهداً بدنياً، إلا أن هذه الطريقة في الخلط تعطي أفضل النتائج بعد الخلط.اغسل الخرزات المنشطة مرتين إلى ثلاث مرات في 0.5 إلى 1 مل من PBS باستخدام جهاز Centrifusion عند 20,000 ×g لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة. بعد كل غسلة، وبعد الغسلة النهائية، أعد تعليق الخرزات المنشطة في 50 µL من PBS لربط الجسم المضاد IP بالخرزات. أضف 50 µL من الجسم المضاد أحادي النسيلة IP من تركيز مخزون يتراوح بين 0.2 إلى 1 mg/mL.تأكد من عدم وجود أي جزيئات تحتوي على أمين أولي غير الأجسام المضادة. هذه الجزيئات التي تحتوي على الأمين، مثل tris أو ألبومين المصل البقري، تتنافس مع الأجسام المضادة في الارتباط بالخرزات. اخلط معلق الأجسام المضادة والخرزات على هزاز اهتزازي لمدة تتراوح بين ثلاث إلى أربع ساعات في درجة حرارة الغرفة.رُجّ الأنبوب جيداً لمنع ترسب الخرزات في قاعه. بعد عملية الربط، اغسل خرزات antibody cod من مرتين إلى ثلاث مرات في 0.5 إلى 1 mL من PBS مع إجراء الطرد المركزي عند 20,000 ×g.تُترك الجسيمات لتترسب بفعل الجاذبية لمدة ثلاث دقائق في درجة حرارة الغرفة بعد كل عملية غسيل. وأخيراً، يتم إعادة تعليق الجسيمات في 100 µL من محلول QBS المنظم. ويمكن التحقق من ربط الأجسام المضادة أحادية النسيلة بالجسيمات CML عن طريق صبغ الجسيمات باستخدام أجسام مضادة مقترنة بفلوروفور ضد IgG.بعد تحليل FCM، يمكن تخزين الخرزات المغلفة بالأجسام المضادة أحادية النسيلة عند درجة حرارة 4 °C حتى يحين موعد استخدامها في تجربة IP. أولاً، قم بتعليق الخرزات جيداً مع تخفيفها بنسبة من 1:200 إلى 1:10,000 في محلول PBS وعدّها باستخدام مقياس كرات الدم (hemocytometer). يجب قياس التركيز لكل دفعة تحضيرية لضمان إمكانية التحكم بدقة في عدد الخرزات المستخدمة في كل تجربة IP.بعد ذلك، قم بتحضير محلول dig طازج في الماء بتركيز 2% وزن/حجم. يتم التسخين حتى 95 °C لمدة خمس دقائق، ثم يُبرد على الثلج.قم بالتخفيف، ثم أضف إلى محلول تحلل (lysis buffer) مُحضّر حديثاً بتركيز 1% وزن/حجم، واحفظه على الثلج. حدد عدد الخلايا المراد تحللها باستخدام الجدول الموضح كدليل إرشادي. ومع ذلك، فإن عدد الخلايا المطلوب يعتمد على البروتين المستهدف ويجب تحديده تجريبياً.هنا، تُستخدم 30 × 10⁶ خلية من خط خلوي لورم لمفاوي صغير. انقل حجم معلق الخلايا المطلوب إلى أنبوب طرد مركزي سعة 1.5 ملل. قم بترسيب الخلايا عند 20,000 ×g.يُترك للترسيب بالجاذبية لمدة 30 ثانية عند درجة حرارة 4 °C ثم يُسحب الوسط. تُضاف الكمية المناسبة من محلول تحلل الـ Dig المُعد حديثاً إلى الراسب ويُخلط برفق عن طريق السحب والدفع باستخدام الماصة.بعد ذلك، اترك الخلايا لتتحلل لمدة 20 دقيقة على الثلج. لاحظ أنه بناءً على نوع الخلايا وتفاعلات البروتين-بروتين المدروسة، يمكن أن تختلف ظروف تحلل الخلايا ويجب تحديدها تجريبياً للتأكد من اكتمال التحلل. قم بإزالة النوى والحطام الخلوي غير القابل للذوبان عن طريق طرد المستخلص مركزياً عند 20,000 ×g.اترك العينة لتترسب بفعل الجاذبية لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C. احتفظ بالمادة الطافية (SNA) وتخلص من الراسب لربط البروتين المستهدف بالخرزات المغلفة بالأجسام المضادة. أضف من 50,000 إلى 250,000 خرزة مقترنة بأجسام مضادة أحادية النسيلة إلى المستخلص الرائق باستخدام الماصة بلطف.يبلغ الحد الأدنى لحجم المستخلص الخلوي المستخدم لعملية تصفية مناعية واحدة 5 µL. يُوضع المزيج المكون من المستخلص الخلوي المصفى والخرزات على عجلة دوارة عمودية لمدة تتراوح من أربع ساعات إلى ليلة كاملة في غرفة باردة، مع ضبط سرعة كافية لمنع ترسب الخرزات في قاع الأنابيب، مع العلم أن السائل يمكن أن يبقى في أسفل الأنبوب أثناء الدوران. ويلي ذلك ارتباط البروتين المستهدف بجسم المضاد المستخدم في التصفية المناعية.انتقل الآن إلى وسم المعقد المناعي فلوروسنتياً. اغسل حبيبات الترسيب المناعي (IP beads) مرتين في 1 مل من منظم FCM البارد، مع استخدام جهاز الطرد المركزي عند 20,000 ×g لمدة ثلاث دقائق عند درجة حرارة 4 °C. بعد كل عملية غسل، أعد تعليق الحبيبات في 100 µL من منظم FCM ووزع 20 µL في كل أنبوب من خمسة أنابيب أو أكثر.أنابيب طرد مركزي دقيقة سعة 1.5 milliliter أو آبار في لوحة ذات قاع مخروطي. كلاهما موضح هنا. أضف الأجسام المضادة أحادية النسيلة المقترنة بصبغات فلورية إلى العينات.قم بإجراء صبغ FCM وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة أو بناءً على التركيزات المحددة تجريبياً كنقطة بداية. أضف من 0.2 إلى 1 µL من محلول الجسم المضاد المخزون بتركيز 0.1 mg/mL على الأقل لكل أنبوب أو بئر، ثم حضنه لمدة 40 دقيقة على الثلج. اغسل الخرزات التي تم فحصها في أنابيب سعة 1.5 mL مرتين باستخدام 1 mL من المحلول المبرد بالثلج.منظم FCM، مع التدوير بسرعة 20,000 ×g عند درجة حرارة 4 °C لمدة ثلاث دقائق. بعد كل غسلة، قم بإزالة السائل الطافي بلطف، مع الحرص على عدم تعكير الخرزات.بدلاً من ذلك، وبالنسبة للمدخنة، يتم غسل اللوحة السفلية مرتين باستخدام 0.2 milliliters من منظم FCM البارد جداً، مع إجراء عملية الطرد المركزي عند 1000 ×g لمدة خمس دقائق في درجة حرارة 4 °C. يتم تكرار هذه العملية بعد كل غسلة. ولإزالة الراشح من الخرز، يتم هز اللوحة مرة واحدة، ثم أثناء بقائها مقلوبة، تُمسح أي قطرات من حواف الآبار.سيكون الحجم المتبقي في كل بئر يحتوي على الخرزات حوالي 20 µL. قم بتعليق الخرزات في 200 µL من FCM buffer لكل عينة، ثم انقلها إلى أنابيب fax المسمىّة. العينات الآن جاهزة للتدفق الخلوي أو FCM على أجهزة Becton Dickens وflow cytometers.قم بإزالة غطاء احتواء القطرات الذي قد يحيط بمدخل العينة أو أنبوب السحب. اترك أنبوب السحب ليقطر بين العينات، حيث سيمنع ذلك انتقال الخرزات من عينة إلى أخرى. يبلغ قطر خرزات CML المستخدمة هنا من ثلاثة إلى خمسة ميكرومتر، وهو ما يعادل تقريباً نصف قطر اللمفاوية الساكنة لدى الفأر.لذلك، قد يكون من الضروري زيادة كسب مضخم التشتت الأمامي وجهد التشتت الجانبي يدويًا لضمان تسجيل مجموعة أحداث الخرزات على جهاز قياس التدفق الخلوي؛ ويتم ذلك هنا باستخدام خرزات غير معلمة أو فارغة. كما يتم ضبط إعدادات البوابات (gait) لاستبعاد الخرزات، والمزدوجات، والحطام قبل البدء في القراءة.تضمن العينات التجريبية أن يكون التألق ضمن المقياس المطلوب. وتعمل الخرزات غير الموصومة كضابط سلبي للتألق، بينما يمكن استخدام جزيئات معايرة قوس قزح (RCPs) كضابط إيجابي للتألق. ونظرًا لأن RCPs أصغر حجمًا من خرزات CML، فقد يلزم تعديل معلمات التشتت الأمامي والتشتت الجانبي، بالإضافة إلى موضع البوابة (gate position)، مؤقتًا لتلك العينة.بعد هذه المعايرات، يتم تصور القيم القصوى للفلورة السلبية والإيجابية على محور لوغاريتمي. وبمجرد اكتمال المعايرة باستخدام خرزات التحكم في المعايرة (RCPs)، يتم الرجوع إلى إعدادات الخرزات غير الموصومة للتشتت الأمامي والجانبي. وطالما يتم استخدام مسبار فلوري واحد فقط لكل عينة، كما هو موضح في التجربة هنا، فلا داعي لإجراء تعويض للفلورة.الآن قم بالحصول على ملفات بيانات الفلورة وحفظها، حيث يتم إجراء التحليل لاحقاً باستخدام برمجيات قياس التدفق الخلوي مثل cell Quest أو FlowJo. تظهر هنا نتيجة تحليل IP FCM لخلايا T في الفئران (LY) في 1% digit toin. وقد تم سحب معقد TCR CD three غير البروتيني باستخدام حبيبات anti CD three epsilon.تحتوي المعقدات التي تم التقاطها على كميات كبيرة من TCR beta و CD three epsilon المرتبط بها. وقد تم اكتشاف مستويات قريبة من مستويات الخلفية للبروتينات الأخرى، كما تم تحديده باستخدام مسبار غلوبولين مناعي غير ذي صلة أو أجسام مضادة ضد البروتينات TH 1.2 أو CD 45 أو H two KD. وتتمثل مزايا هذه التقنية مقارنة بالطرق الأخرى، مثل الترسيب المناعي المتبوع بلطخة وسترن، في قدرة I-P-F-C-M على السماح بتقييم التفاعلات الطبيعية بين البروتينات دون الحاجة إلى الهندسة الوراثية أو أحجام عينات كبيرة. ويمكن لـ I-P-F-C-M أن تعطي نسب إشارة إلى ضوضاء عالية حتى عند توفر كمية قليلة جداً من المواد الحيوية للتحليل، حيث يمكن تنفيذها بأحجام صغيرة وتركيزات منخفضة من المواد المراد تحليلها.

ip-fcm-immunoprecipitation-detected-by-flow-cytometry

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

في هذا الفيديو ، نوضح تقنية قائمة على قياس التدفق الخلوي لتحديد نسبة الخلايا التائية القاتلة التي يسببها السيتوكين ، خلايا CIK ، التي توسعت من ثقافة الخلايا أحادية النواة في الدم المحيطي.

التعرف على علامة القرص المضغوط للخلايا القاتلة التي يسببها السيتوكينات البشرية عن طريق قياس التدفق الخلوي

تحليل تدفق cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء يوفر طريقة الكمية الإنتاجية العالية لدراسة التفاعل البروتين البروتين. ويمكن تطبيق هذه المنهجية لرسم الخرائط مواقع الربط البروتين ولفحص العوامل التي تنظم التفاعل البروتين البروتين.

تدفق تحليل Cytometric من التكملة الإسفار ثنائي الجزيء: عالية الإنتاجية الأسلوب الكمي لدراسة التفاعل البروتين البروتين

تحليل التفاعل جسيمات متناهية الصغر مع مجموعات سكانية فرعية محددة من الخلايا المناعية بواسطة التدفق الخلوي.

الكشف عن جسيمات متناهية الصغر نيون التفاعل مع مجموعات سكانية فرعية خلية المناعة الأولية من قبل التدفق الخلوي

يلعب الالتهاب دورا مركزيا في التسبب في السكتة الدماغية الإقفارية. تشير الأدلة المتزايدة إلى أنه يعمل كسيف ذو حدين يؤدي إلى تفاقم إصابة الدماغ المبكرة ، ولكنه يساهم أيضا في الإصلاح لاحقا. يصف هذا البروتوكول عزل الخلايا المناعية عن الدماغ الإقفاري والتنميط الظاهري الخلوي للتدفق اللاحق.

العزلة وتحليل تدفق Cytometric من الخلايا المناعية من الدماغ الدماغية ماوس

تدفق ويرد التحليل القائم على الخلوي الخلوي ملزم يستخدم أساسا كأداة لفحص لتحديد المركبات التي تحول دون ربط يجند chemokine للامتحانات المسمى فلوريسسينتلي 12 (CXCL12) لمستقبلات تشيموكيني الامتحانات 4 (CXCR4).

مقايسة المستندة إلى الخلوي تدفق التعرف على المركبات التي تعطل ملزمة للامتحانات المسمى فلوريسسينتلي تشيموكيني يجند 12 لمستقبلات تشيموكيني الامتحانات 4

توضح هذه المقالة طريقة لتحليل محتوى الخلية المناعية من الأنسجة الدهنية بعزل الخلايا المناعية من الأنسجة الدهنية وتحليله باستخدام التدفق الخلوي.

تحديد خصائص الخلايا المناعية في الأنسجة الدهنية البشرية باستخدام التدفق الخلوي

ويوفر نهج مثالي للكشف عن تغيير الخصائص المورفولوجية والوظيفية للخلايا على الصعيدين الفردي وسكاني التصوير التدفق الخلوي. قد تجلى تعطل وظيفة اندوسيتيك لعرض مستضد الدهن في الخلايا الجذعية البشرية المعرضة للملوثات مع ترانسكريبتوميك مجتمعة التنميط التعبير الجيني ومظاهره المورفولوجية للاتجار بالبروتين.

دمج تصوير التدفق الخلوي والتنميط لتقييم الاتجار بتغيير CD1d اندوسيتيك ترانسكريبتوميك

يمكن أن يساهم عزل الخلايا من الغرسات المشرحة وتوصيفها عن طريق قياس التدفق الخلوي بشكل كبير في فهم نمط الاستجابة المناعية ضد الغرسات. يصف هذا البحث طريقة دقيقة لعزل الخلايا من الغرسات المشرحة وتلطيخها لتحليل التدفق الخلوي.

قياس التدفق الخلوي عالي الأبعاد لتحليل الوظيفة المناعية لأنسجة الزرع المشرحة

يصف هذا البروتوكول طريقة فحص عالية الإنتاجية قائمة على قياس التدفق الخلوي لتحديد الأدوية ذات الجزيئات الصغيرة التي تمنع تنشيط β2 integrin على العدلات البشرية.

تقنية عالية الإنتاجية قائمة على قياس التدفق الخلوي لفحص الأدوية المثبطة للإنتغرين

يصف هذا العمل بروتوكولا للقياس الكمي لتعديلات الهستون العالمية باستخدام قياس التدفق الخلوي داخل النواة في الخلايا الدبقية الصغيرة المعزولة في الدماغ. يحتوي العمل أيضا على بروتوكول عزل الخلايا الدبقية الصغيرة الذي تم استخدامه لجمع البيانات.

القياس الكمي لتعديلات هيستون العالمية بعد الترجمة باستخدام قياس التدفق الخلوي داخل النواة في الخلايا الدبقية الصغيرة لدماغ الفأر المعزول

من الصعب تحديد الخلايا الدبقية الصغيرة (MG) والضامة المتسللة المحيطية (Mø) في الحبال الشوكية المصابة. في هذا البروتوكول ، تم استخدام قياس التدفق الخلوي (FCM) لتحديد MG الشبيه ب M1 ، و M2 مثل MG ، و M1 مثل Mø ، و Mø الشبيه ب M2 ، على التوالي. يمكن أيضا تطبيق هذه التقنية على أمراض الجهاز العصبي المركزي الأخرى لفهم دور MG و Mø.

التعرف على الخلايا الدبقية الصغيرة والضامة المتسللة للمحيط في الحبل الشوكي المصاب باستخدام قياس التدفق الخلوي

تعلم تقنية IP-FCM لدراسة تفاعلات البروتين-البروتين الأصلية باستخدام الخرز المغطى بالأجسام المضادة وتحليل الخلايا التدفقي. تتيح هذه الطريقة الكشف الحساس بدون هندسة وراثية أو عينات كبيرة.

IP - FCM : مناعي التي كشفتها التدفق الخلوي

استكشف المزيد من الفيديوهات