التصوير الفرق البنيات البيولوجية مع المضاعفة - الرنانة نثر المضادة للستوكس المتماسك رامان (سيارات)

يوضح هذا الفيديو إجراء لإجراء تصوير تفاضلي لرنين رامين مرتبطين بالهياكل البيولوجية مع إشارات تشتت رامين متماسكة. تتداخل أول ثلاثة ليزر نبضي قصير متزامن في الزمان والمكان. ثم يتم إرسال النبضات المتداخلة إلى مجهر مقلوب قياسي ، مما يسمح بتوليد إشارات رامين متماسكة من الأجسام المجهرية.

يتم تحويل الإشارات إلى صور باستخدام برامج تجارية من أجل مقارنة إشارات الرامين المختلفة التي يتم إنتاجها. تشير النتائج إلى أن الفرق بين الصور التي تم الحصول عليها من إشارات الرامين الرنانة المزدوجة والمفردة يوفر حساسية معززة لإشارات الرامين الضعيفة. مرحبا ، أنا تايلر ويكس من مركز الضوئيات الحيوية في جامعة كاليفورنيا ديفيس.

أنا توماس إي آر من مركز الضوئيات الحيوية وقسم الطب الباطني بجامعة كاليفورنيا ديفيس. سنعرض لك اليوم إجراء لاستخدام الرنين المزدوج المتماسك المضاد المضاد لإثارة الرامين لإنتاج صور محددة كيميائيا للخلايا. نستخدم هذا الإجراء للكشف عن الإشارات من الجزيئات الأضعف من أن يتم اكتشافها مباشرة عن طريق التحليل الطيفي المتماسك المضاد ستوكس رامون وحده.

لذلك دعونا نبدأ: من أجل توليد السيارات وإشارة سيارات Dr في وقت واحد ، يلزم وجود ثلاثة مصادر ليزر قصيرة النبض قابلة للضبط ومتزامنة للحصول على هذه النبضات المتزامنة. ابدأ بليزر نبض قصير واحد بقدرة خرج 10 واط. طول موجي ثابت يبلغ 1064 نانومتر ، وطول نبضة ثابت يساوي بيكو ثانية ، ومعدل تكرار ثابت يبلغ 76 ميغا هرتز.

باستخدام سلسلة من لوحات نصف الموجة ومكعبات تقسيم الشعاع المستقطب ، يتم تقسيم الشعاع إلى ثلاثة أجزاء. تسمح لوحة منتصف الطريق جنبا إلى جنب مع مكعب مقسم شعاع الاستقطاب بتعديل مقدار الطاقة في كل مكون من مكونات الحزمة دون تغيير اتجاهها. عادة ، يتم ضبط حزمتين إلى حوالي 4.5 واط لكل منهما ، وتحتوي الحزمة الثالثة على الواط المتبقي.

ثم يتم توجيه الحزمتين عالية الطاقة إلى اثنين من المذبذبات البارامترية البصرية المستقلة أو OPOs. تستخدم OPOs توليد تردد مختلف لتحويل فوتون عالي الطاقة إلى فوتونين منخفضي الطاقة بأطوال موجية مختلفة. من خلال التحكم في درجة حرارة البلورة المستخدمة لتحقيق هذا التأثير ، يمكن التحكم في الأطوال الموجية للفوتونات الناتجة في حدود 0.1 نانومتر.

من خلال مضاعفة هذه الإشارات بالتردد ، يمكن الآن تحويل ليزر بطول موجي ثابت يبلغ 1064 نانومتر إلى شعاع ليزر يمكن ضبطه في أي مكان بين 780 نانومتر و 910 نانومتر عن طريق ضخ اثنين من OPOs منفصلين بنفس المصدر 1064 نانومتر. يتم الحصول على مصدرين لليزر قابلين للضبط بشكل مستقل يتم مزامنتهما تلقائيا مع ليزر المضخة الأصلي الخاص بنا. يتم توجيه الشعاع الثالث من ليزر المضخة 1064 نانومتر حول OPOs بواسطة مجموعة من المرايا العازلة بحيث يمكن إعادة تجميع جميع الحزم الثلاثة لاحقا.

من أجل إنتاج فوتونات إشارة رامين متماسكة بكفاءة ، يجب أن تتداخل النبضات المعاد تجميعها زمانيا ومكانيا لأن OPOs تحتوي على تجاويف حلقية تسمح لكل نبضة ليزر بالمرور عبر البلورة عدة مرات ، حيث يسافر الشعاع المرسل عبر OPOs مسافة إضافية مما يؤدي إلى تأخير كبير بالنسبة لحزمة المضخة الأصلية. يجب تعويض هذه المسافة بحزمة ثالثة عن طريق إدخال مرايا إضافية تجبر هذه الحزمة على السفر بنفس المسافة مثل المرايا الأخرى قبل إعادة تجميعها باستخدام مرايا ثنائية اللون من أجل توفير ضبط دقيق لطول المسار. يتم إرسال كل شعاع من خلال مراحل تأخير قابلة للتعديل ، والتي تسمح بتعديل التداخل الزمني لنبضات الليزر المختلفة.

تتم إضافة مجموعة أخرى من الألواح في منتصف الطريق ومكعبات تقسيم الشعاع المستقطب إلى كل شعاع للسماح بتعديل قوة الليزر لكل شعاع بشكل مستقل. تستخدم المرايا ثنائية اللون لدمج الحزم من OPOs أولا ، ثم يجب توخي الحذر في شعاع 1064 نانومتر لضمان تداخل الحزم بدقة في الفضاء. يمكن التحقق من ذلك من خلال مقارنة تداخل الحزم في غضون بضعة سنتيمترات من المرآة ثنائية اللون مع تلك التي تبعد حوالي متر واحد عن المرآة ثنائية اللون.

نظرا لأن التعرض لأشعة الليزر ذات المتوسط العالي الطاقة يمكن أن يتلف العينة ، يتم إرسال الحزم الثلاثة المدمجة من خلال معدل بصري كهربائي يعمل كمتقي نبضات ، مما يسمح بتعديل معدل تكرار النبضات التي تصل إلى العينة ، وبالتالي متوسط الطاقة. ثم يتم إقران أشعة الليزر المدمجة بمجهر مقلوب بعدسة موضوعية ذات فتحة عددية عالية أو na. يسمح التركيز البؤري المحكم الناتج عن العدسة الموضوعية عالية NA بالتوليد الأكثر كفاءة لإشارات الرامين المتماسكة على مقاييس الطول المجهرية.

يتم تثبيت العدسة الموضوعية للمجهر على مرحلة بيزو X و Y و Z ، مما يسمح بالحصول على الصور عن طريق مسح الحزم النقطية عبر العينة على غرار مسح الحزمة التجارية والمجاهر متحدة البؤر. الآن دعونا نرى كيفية توليد السيارات وإشارات D-R-F-W-M يؤدي تفاعل ثلاث حزم ليزر نبضية قصيرة في العينة إلى توليد عدة إشارات خلط رباعية الموجات مثل السيارات من مجموعات مختلفة من ليزرين ، بالإضافة إلى ثلاث سيارات ملونة وإشارات سيارات DR من مزيج من جميع أنواع الليزر الثلاثة. عندما تكون الإشارات قريبة نسبيا في الطول الموجي ، قد يكون من الصعب فصلها للتحليل.

لهذا السبب ، يتم تمرير الإشارات إلى مطياف التصوير الذي يعمل أيضا كمرشح أحادي اللون أو مرشح تمرير النطاق لفصل الإشارات مكانيا بأطوال موجية مختلفة. ترسل مرآة الوجه التي يتم تشغيلها إلكترونيا داخل مقياس الطيف في الوضع المنخفض الإشارة إلى جهاز مقترن بشحنة استنفاد عميق مضاءة في الخلف أو كاميرا CCD ، والتي توفر معلومات طيفية عبر نطاق الإشارة بأكمله ، وتسمح لنا بتحديد وتحسين إشارات روبن المتماسكة المختلفة لتحديد الإشارة إلى الصورة. ما عليك سوى تدوير التسوية داخل مقياس الطيف باستخدام برنامج التحكم والحصول على البيانات المقدم من البائع لتركيز ذروة الاهتمام على كاميرا CCD.

ثم قم بتغيير موضع المرآة القابلة لإعادة توجيه الإشارة إلى منفذ خروج ثان يتم إرفاق صورة DDE أو PD بفوتون واحد لعد الانهيار الجليدي أو PD. النقطيه. امسح العدسة الموضوعية ضوئيا ثم استخدم الإشارات المسجلة على A PD لإنشاء صورة عن طريق عرض معدل عدد الفوتون لكل بكسل باستخدام برنامج الحصول على البيانات. كرر إجراء التصوير هذا لكل إشارة رامين متماسكة مطلوبة بحيث يمكن مقارنة الإشارات أثناء المعالجة اللاحقة.

الآن دعونا نرى كيفية إعداد عينة بشكل صحيح من أجل الحصول على صور واضحة قابلة للتكرار. يجب توخي بعض الحذر في تحضير العينات. عادة ما يتم تحضير العينات على زلات غطاء زجاجي بسمك 150 ميكرون تقريبا.

زلات الغطاء هذه رقيقة بما يكفي للسماح بتصوير عالي الدقة باستخدام العدسات الموضوعية عالية الغمر في الماء أو الزيت التي تستخدم في هذه التجارب. لإثبات تحضير عينة نموذجية ، نقوم بإعداد أقسام بسمك 20 ميكرون تقريبا من أنسجة عضلات الفأر مثبتة على شريحة مجهرية. تضاف قطرة 20 ميكرولتر من محلول الجلوكوز المنزوع خمسة مولار إلى العينة.

يوفر محلول الجلوكوز المنزوع توقيعا فريدا وقويا لخلفية الرامين. يتم وضع زلة غطاء زجاجي أعلى العينة وتثبيتها في مكانها باستخدام طلاء الأظافر للخلايا والثقافة. يمكن استخدام أطباق الثقافة ذات القاع الزجاجي التي تسمح بالتصوير دون الحاجة إلى فصل الخلايا عن أطباق نمو زراعة الخلايا.

الآن دعونا نرى كيفية تحديد الروم والقمم المناسبة لسيارات Dr. من أجل الاستفادة بشكل صحيح من تأثير تعزيز الرنين المزدوج ، يجب معرفة أطياف الرامين لكل من مواد رنين الرامين. عادة ما تكون هذه 2،845 سنتيمترا عكسيا مرتبطا بالدهون و 2،121 سنتيمترا عكسيا لوضع تمدد القرص المضغوط المرتبط بالجلوكوز المنزوع للدهون.

يتم تحقيق تشتت رامين متماسك عندما يتطابق فرق التردد بين ليزرين مع تردد الاهتزاز الجزيئي. من خلال ضبط OPO واحد على 817 نانومتر ، سيقوم بفحص الوضع العكسي 2 ، 845 سنتيمترا C عند دمجه مع شعاع الليزر 1064 نانومتر ، ومن خلال ضبط OPO الآخر على 868 نانومتر ، سيقوم بفحص 2 ، 121 سنتيمترا عكسيا عند دمجه مع شعاع 1064 نانومتر. في الوضع الطيفي ، يسمح لنا مجهر السيارة بمراقبة ثلاث إشارات رامين متماسكة ذات أهمية ، وإشارة سيارة تحقق من اهتزاز تمدد CH ، وإشارة سيارة تحقق في وضع تمدد القرص المضغوط ، وإشارة سيارة DR تحقق في كل من الرسم البياني الموضح هنا ، تشير الأسهم المتقطعة إلى الفوتونات من الليزر في OPOs والأسهم الصلبة تشير إلى الإشارة الناتجة.

تشير الخطوط الأفقية الصلبة إلى طاقة اهتزاز الرامين وتعطي تمثيلا مرئيا أنه في سيارات DR ، فإن خلط نفس فوتونات الإدخال الثلاثة يبحث في وقت واحد عن اهتزازين مختلفين من الرامين. يجب تحسين قوة الإشارة لكل ذروة عن طريق ضبط الخطوات الدقيقة حول مواقع الذروة هذه. هنا نختار كل ذروة ونلتقط صورا لديدان elgan البحرية في محلول من الجلوكوز المخفض ، ويتطلب استخراج معلومات إضافية بناء على هذه الصور الثلاث التي تم الحصول عليها بشكل فردي بعض معالجة الصور البسيطة إلى حد ما.

أولا ، يجب تطبيع الصور. تعتمد الطريقة العملية للتطبيع على حقيقة أن الدهون كارهة للماء. هذا يعني أنه في مناطق الدهون عالية الكثافة ، يجب أن يساهم رنين القرص المضغوط من الجلوكوز بشكل ضئيل جدا في إشارة الرنين المزدوج.

على العكس من ذلك ، في مناطق محلول الجلوكوز النقي ، يجب أن تساهم رنين CH من الدهون أيضا بشكل ضئيل جدا. مع وضع ذلك في الاعتبار ، قم بتطبيع صورة السيارة DR وصورة السيارة التي تم الحصول عليها على رنين القرص المضغوط لمحلول الجلوكوز المنزوع إلى منطقة خارج دودة CL egan التي يجب ألا تظهر صدى CH. بعد ذلك ، حدد منطقة داخل الدودة في صورة السيارة الرنانة CH الغنية بالدهون وقم بتطبيعها إلى المنطقة المقابلة داخل صورة السيارة DR الطبيعية.

لكي تعمل هذه الطريقة بشكل صحيح ، افترض أنه في أعماق هذه المنطقة لا يوجد جلوكوز مزيل للجلوكوز. هذا افتراض آمن لأن الدهون كارهة للماء ولن تختلط بالمحلول. الآن من خلال طرح صورة السيارة الرنانة CH الطبيعية من صورة سيارة DR الطبيعية ، تظل إشارة رنين القرص المضغوط المضخمة فقط بالمثل عن طريق طرح صورة السيارة الرنانة للقرص المضغوط الطبيعي من صورة Dr.FWM الطبيعية.

فقط إشارة رنين ch المضخمة المتبقية الموضحة هنا هي طيف الرامين لحمض الأوليك المعدل الذي يتضمن تعديلا للألكين ، ورنين CH القوي عند 2 ، 845 سنتيمترا عكسيا ، ورنين جبال الألب عند 2 ، 121 سنتيمترا عكسيا كلاهما معزول جيدا عن منطقة بصمات الأصابع ، وهي منطقة القمم المكتظة بكثافة ، مما يجعلها علامات مثالية لتصوير الرامين المتماسك. هذا طيف نموذجي من إشارات الرامين المتماسكة التي يتم إنشاؤها عندما تتداخل ثلاثة ليزر نبضي قصير داخل العينة. تشير الأسهم إلى العمليات المسؤولة عن كل إشارة كما تمثلها مخططات الطاقة.

هذه نتائج نموذجية من تصوير ديدان C Elgin باستخدام سيارات وسيارات DR. استخدم الصف العلوي الإشارات الثلاث الموضحة للتو لتصوير دودة في محلول من الجلوكوز المخفض في الصف الثاني ، تم تطبيع الصور بشكل مناسب وفي الصف الثالث تم إنتاج صور الفرق عن طريق طرح كل صورة من صور السيارة من صورة السيارة DR ، لقد أوضحنا لك للتو كيفية إجراء تصوير فرق رامان بناء على الفحص المجهري المتماسك المضاد لرامان بالرنين المزدوج.

عند القيام بهذا الإجراء ، تذكر أنه من المهم التأكد من تداخل الحزم ومزامنتها بشكل صحيح. أيضا ، عند التبديل بين الإشارات المتماسكة المختلفة ، تأكد من عدم ارتطام العينة أو تحريكها لأن ذلك سيؤثر على التحليل. هذا كل شيء.

شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.