التصوير الفرق البنيات البيولوجية مع المضاعفة - الرنانة نثر المضادة للستوكس المتماسك رامان (سيارات)

يوضح هذا الفيديو إجراءً لإجراء التصوير التفاضلي لرنينين من رنين رامان المرتبطين بتراكيب بيولوجية ذات إشارات تشتت رامان متماسكة. أولاً، يتم دمج ثلاثة ليزرات ذات نبضات قصيرة متزامنة في الزمان والمكان. ثم تُرسل النبضات المدمجة إلى مجهر مقلوب قياسي، مما يسمح بتوليد إشارات رامان متماسكة من أجسام مجهرية.

يتم تحويل الإشارات إلى صور باستخدام برامج تجارية من أجل مقارنة إشارات رامان المختلفة الناتجة. وتشير النتائج إلى أن الفرق بين الصور التي تم الحصول عليها من إشارات رامان ذات الرنين المزدوج وتلك ذات الرنين الأحادي يوفر حساسية محسنة لإشارات رامان الضعيفة. مرحباً، أنا تايلر ويكس من مركز الفوتونيات الحيوية في جامعة كاليفورنيا ديفيس.

أنا توماس إي آر من مركز الفوتونيات الحيوية وقسم الطب الباطني في جامعة كاليفورنيا ديفيس. سنعرض لكم اليوم إجراءً لاستخدام تشتت رامان المترابط مضاعف الرنين لإنتاج صور ذات خصوصية كيميائية للخلايا. نحن نستخدم هذا الإجراء للكشف عن إشارات الجزيئات التي تكون ضعيفة جداً بحيث لا يمكن اكتشافها مباشرة باستخدام مطيافية رامان المترابطة وحدها.

لنبدأ الآن؛ فمن أجل توليد إشارات CARS و Dr CARS بشكل متزامن، يلزم وجود ثلاثة مصادر ليزر ذات نبضات قصيرة، تكون قابلة للضبط ومتزامنة. ابدأ بليزر نبضات قصيرة واحد بقدرة خرج تبلغ 10 watts، وطول موجي ثابت قدره 1064 nanometers، وطول نبضة ثابت قدره 7 picoseconds، ومعدل تكرار ثابت يبلغ 76 megahertz.

باستخدام سلسلة من صفائح نصف الموجة ومكعبات مقسم الشعاع المستقطبة، يتم تقسيم الشعاع إلى ثلاثة أجزاء. تتيح صفيحة نصف موجة مدمجة مع مكعب مقسم الشعاع المستقطب ضبط مقدار القدرة في كل مكون من مكونات الشعاع دون تغيير اتجاهه. وعادةً ما يتم ضبط شعاعين ليكون كل منهما حوالي 4.5 watts، بينما يحتوي الشعاع الثالث على الواط الواحد المتبقي.

يتم توجيه شعاعي الطاقة العالية بعد ذلك إلى مذبذبات بارامترية بصرية مستقلة أو OPOs. تستخدم الـ OPOs توليد ترددات مختلفة لتحويل فوتون عالي الطاقة إلى فوتونين أقل طاقة وبأطوال موجية مختلفة. ومن خلال التحكم في درجة حرارة البلورة المستخدمة لتحقيق هذا التأثير، يمكن التحكم في الأطوال الموجية للفوتونات الناتجة بدقة تصل إلى 0.1 nanometers.

عبر مضاعفة تردد هذه الإشارات، يمكن الآن تحويل ليزر ذو طول موجي ثابت قدره 1064 nanometers إلى شعاع ليزر يمكن ضبطه في أي قيمة بين 780 nanometers و 910 nanometers عن طريق ضخ اثنين من المذبذبات البارامترية البصرية (OPOs) المنفصلة باستخدام نفس مصدر 1064 nanometer. وبهذا يتم الحصول على مصدرين ليزر قابلين للضبط بشكل مستقل ومتزامنين تلقائيًا مع ليزر الضخ الأصلي. أما الشعاع الثالث من ليزر الضخ 1064 nanometer فيتم توجيهه حول الـ OPOs بواسطة مجموعة من المرايا العازلة بحيث يمكن إعادة دمج الأشعة الثلاثة لاحقًا.

من أجل إنتاج فوتونات إشارة رامان متماسكة بكفاءة، يجب أن تتداخل النبضات المعاد دمجها زمانياً ومكانياً؛ وذلك لأن المذبذبات البارامترية الضوئية (OPOs) تحتوي على تجاويف حلقية تسمح لكل نبضة ليزر بالمرور عبر البلورة عدة مرات، مما يجعل الحزمة المرسلة عبر الـ OPOs تقطع مسافة إضافية تؤدي إلى تأخير ملحوظ بالنسبة لحزمة الضخ الأصلية. يجب تعويض هذه المسافة باستخدام حزمة ثالثة عن طريق إدخال مرايا إضافية تجبر هذه الحزمة على قطع نفس المسافة التي تقطعها الحزمتان الأخريان قبل إعادة دمجهما باستخدام مرايا ثنائية اللون من أجل توفير ضبط دقيق لطول المسار. يتم إرسال كل حزمة عبر مراحل تأخير قابلة للتعديل، مما يسمح بضبط التداخل الزماني لنبضات الليزر المختلفة.

تُضاف مجموعة أخرى من الصفائح نصف الموجية ومكعبات مقسم الحزمة المستقطبة إلى كل حزمة للسماح بضبط قدرة الليزر لكل حزمة بشكل مستقل. تُستخدم المرايا ثنائية اللون لدمج الحزم الصادرة من الـ OPOs الاثنين أولاً، ثم دمج حزمة 1064 nanometer، ويجب توخي الحذر لضمان تداخل الحزم بدقة في الفضاء. يمكن التحقق من ذلك من خلال مقارنة تداخل الحزم على بعد سنتيمترات قليلة من المرآة ثنائية اللون مع تداخلها على مسافة متر واحد تقريباً من المرآة ثنائية اللون.

نظراً لأن التعرض لحزم الليزر ذات متوسط القدرة العالي يمكن أن يتلف العينة، يتم إرسال الحزم الثلاث المدمجة عبر مُعدل بصري كهربائي يعمل كمنتقٍ للنبضات، مما يسمح بضبط معدل تكرار النبضات التي تصل إلى العينة، وبالتالي التحكم في متوسط القدرة. بعد ذلك، يتم إقران حزم الليزر المدمجة بمجهر مقلوب مزود بعدسة شيئية ذات فتحة عددية عالية أو na. ويسمح التركيز الدقيق الناتج عن العدسة الشيئية ذات الـ NA العالية بتوليد إشارات ramen متماسكة بأكبر قدر من الكفاءة على المقاييس المجهرية.

تُثبَّت العدسة الشيئية للمجهر على منصة بيزو (pizo) ثلاثية المحاور X و Y و Z، مما يتيح الحصول على الصور عن طريق المسح النقطي (raster scanning) للحزم عبر العينة، بشكل مشابه للمجاهر البؤرية (confocal microscopes) التجارية التي تعتمد على مسح الحزم. لنلقِ نظرة الآن على كيفية توليد إشارات CARS و DRFWM؛ حيث يؤدي تداخل ثلاث حزم ليزر ذات نبضات قصيرة عند العينة إلى توليد عدة إشارات لخلط الموجات الرباعية، مثل إشارات CARS الناتجة عن مجموعات مختلفة من ليزرين، بالإضافة إلى إشارات CARS ثلاثية الألوان وإشارات DR CARS الناتجة عن دمج الليزرات الثلاثة جميعاً. وعندما تكون الإشارات متقاربة نسبياً في الطول الموجي، فقد يكون من الصعب فصلها من أجل التحليل.

لهذا السبب، يتم تمرير الإشارات إلى مطياف تصوير يعمل أيضاً كموحد لون أو مرشح تمرير نطاق لفصل الإشارات مكانياً عند أطوال موجية مختلفة. وتقوم مرآة قلابة يتم تشغيلها إلكترونياً داخل المطياف في وضعها المنخفض بإرسال الإشارة إلى كاميرا ذات جهاز اقتران شحني (CCD) ذات استنزاف عميق وإضاءة خلفية، والتي توفر معلومات طيفية عبر نطاق الإشارة بالكامل، وتسمح لنا بتحديد وتحسين إشارات robin المترابطة المختلفة لاختيار الإشارة المراد تصويرها. ما عليك سوى تدوير المحزز داخل المطياف باستخدام برنامج التحكم واقتناص البيانات المرفق من المورد لتمركز القمة المطلوبة على كاميرا CCD.

بعد ذلك، قم بتغيير وضع المرآة القلابة لإعادة توجيه الإشارة إلى منفذ خروج ثانٍ متصل بكاشف ضوئي صاعق لعدّ الفوتونات المنفردة (single photon counting avalanche photo DDE) أو كاشف ضوئي (PD). قم بإجراء مسح خطي (Raster scan) للعدسة الشيئية، ثم استخدم الإشارات المسجلة على الـ A PD لإنشاء صورة من خلال عرض معدل عد الفوتونات لكل بكسل باستخدام برنامج الحصول على البيانات. كرر إجراء التصوير هذا لكل إشارة رامان متماسكة مطلوبة حتى يمكن مقارنة الإشارات أثناء عملية المعالجة اللاحقة.

لننتقل الآن إلى كيفية تحضير العينة بشكل صحيح من أجل الحصول على صور واضحة وقابلة للتكرار. يجب توخي بعض العناية عند تحضير العينات؛ حيث تُحضّر العينات عادةً على شرائح غطائية زجاجية يبلغ سمكها 150 micron تقريباً.

هذه الأغطية الزجاجية رقيقة بما يكفي للسماح بالتصوير عالي الدقة باستخدام عدسات الشيئية ذات الفتحة العددية (NA) العالية المغمورة بالماء أو الزيت المستخدمة في هذه التجارب. ولتوضيح كيفية تحضير عينة نموذجية، نقوم بتحضير مقاطع من نسيج عضلة الفأر بسمك 20 ميكرون تقريباً وتثبيتها على شريحة مجهرية. ثم تُضاف قطرة بحجم 20 µL من محلول جلوكوز مديتر (deuterated glucose) بتركيز 5 مولار إلى العينة.

يوفر محلول الجلوكوز المديتريوم توقيعًا خلفيًا قويًا وفريدًا لرامان. توضع شريحة غطاء زجاجية فوق العينة وتُثبت في مكانها باستخدام طلاء الأظافر للخلايا والمزارع الخلوية. ويمكن استخدام أطباق زراعة ذات قاع زجاجي تسمح بالتصوير دون الحاجة إلى فصل الخلايا عن أطباق نمو المزرعة الخلوية.

دعونا نرى الآن كيفية تحديد أرقام الموجة والقمم المناسبة لـ Dr cars. من أجل الاستفادة بشكل صحيح من تأثير التعزيز الرنيني المزدوج، يجب معرفة أطياف رامان لكل من المواد الرنينية. عادةً ما تكون هذه القيم 2,845 cm⁻¹ المرتبطة بالدهون و 2,121 cm⁻¹ لنمط تمدد CD المرتبط بالجلوكوز المديترون.

يتحقق تشتت رامان المتسق عندما يتطابق فرق التردد بين ليزرين مع تردد اهتزاز جزيئي. ومن خلال ضبط أحد المذبذبات البارامترية البصرية (OPO) على 817 نانومتر، فإنه سيكشف عن نمط C عند 2,845 سنتيمتر⁻¹ عند دمجه مع شعاع ليزر 1064 نانومتر، ومن خلال ضبط المذبذب البارامتري البصري الآخر على 868 نانومتر، فإنه سيكشف عن 2,121 سنتيمتر⁻¹ عند دمجه مع شعاع 1064 نانومتر. وفي وضع التحليل الطيفي، يتيح لنا المجهر رصد ثلاث إشارات رامان متسقة ذات أهمية: إشارة CAR تستكشف اهتزاز تمدد CH، وإشارة CAR تستكشف نمط تمدد CD، وإشارة DR CAR تستكشف كليهما. في المخطط الموضح هنا، تشير الأسهم المتقطعة إلى الفوتونات القادمة من الليزر في المذبذبات البارامترية البصرية، وتشير الأسهم المتصلة إلى الإشارة الناتجة.

تشير الخطوط الأفقية المتصلة إلى طاقة اهتزاز رامان وتوفر تمثيلاً بصرياً يوضح أن سيارات DR في حالة خلط نفس الفوتونات الثلاثة المدخلة تقوم بسبر اهتزازين مختلفين لرامان في آن واحد. سيتطلب تحسين قوة الإشارة لكل ذروة الضبط بخطوات دقيقة حول مواقع هذه الذروات. هنا نختار كل ذروة ونلتقط صوراً لديدان sea elgan في محلول من الجلوكوز المخفض، ويتطلب استخراج معلومات إضافية بناءً على هذه الصور الثلاث التي تم الحصول عليها بشكل فردي بعض معالجة الصور البسيطة إلى حد ما.

أولاً، يجب تسوية الصور. تعتمد إحدى الطرق العملية للتسوية على حقيقة أن الدهون كارهة للماء. وهذا يعني أنه في المناطق ذات الكثافة العالية للدهوث، يجب أن تساهم رنين CD للجلوكوز بنسبة ضئيلة جداً في إشارة الرنين المزدوج.

وعلى العكس من ذلك، في مناطق محلول الجلوكوز النقي، يجب أن تساهم رنينات CH الناتجة عن الدهون بشكل ضئيل جداً. ومع وضع ذلك في الاعتبار، قم بتطبيع صورة DR car وصورة car التي تم الحصول عليها عند رنين CD لمحلول الجلوكوز المديتر، وذلك بالنسبة لمنطقة تقع خارج دودة CL egan تماماً والتي لا يُفترض أن تظهر فيها رنينات CH. بعد ذلك، حدد منطقة داخل الدودة في صورة car ذات رنين CH تكون غنية بالدهون، وقم بتطبيعها بالنسبة للمنطقة المقابلة لها داخل صورة DR car المطبّعة.

لكي تعمل هذه الطريقة بشكل صحيح، يُفترض عدم وجود جلوكوز مدتر (deuterated glucose) في عمق هذه المنطقة. وهذا افتراض سليم لأن الليبيدات كارهة للماء ولن تختلط بالمحلول. والآن، من خلال طرح صورة رنين CH المعيرة من صورة رنين DR المعيرة، تتبقى فقط إشارة رنين CD المضخمة؛ وبالمثل، يتم ذلك عن طريق طرح صورة رنين CD المعيرة من صورة Dr.FWM المعيرة.

يظهر هنا فقط إشارة رنين CH المضخمة؛ هذا هو طيف رامان لحمض أوليك معدل يتضمن تعديلاً ألكينياً. إن رنينات CH القوية عند 2,845 inverse centimeters ورنين الألكين عند 2,121 inverse centimeters معزولتان جيداً عن منطقة بصمة الإصبع، وهي المنطقة المزدحمة بالقمم، مما يجعلهما علامتين مثاليتين للتصوير برامان المترابط. هذا طيف نموذجي لإشارات رامان المترابطة الناتجة عند تداخل ثلاثة ليزرات ذات نبضات قصيرة داخل العينة. تشير الأسهم إلى العمليات المسؤولة عن كل إشارة كما هي ممثلة في مخططات الطاقة.

هذه نتائج نموذجية لتصوير ديدان C Elgin باستخدام DR CARS و CARS. استخدم الصف العلوي الإشارات الثلاث التي عُرضت للتو لتصوير دودة في محلول جلوكوز مخفف. وفي الصف الثاني، تم تطبيع الصور بشكل مناسب، وفي الصف الثالث تم إنتاج صور الفرق عن طريق طرح كل من صور CARS من صورة DR CARS. لقد عرضنا لكم الآن كيفية إجراء تصوير رامان التفريقي بناءً على مجهر تشتت رامان المضاد المتسق مزدوج الرنين.

عند تنفيذ هذا الإجراء، تذكر أنه من المهم التأكد من تداخل الحزم ومزامنتها بشكل صحيح. كما يجب الحرص، عند التبديل بين الإشارات المترابطة المختلفة، على عدم صدم العينة أو تحريكها لأن ذلك سيؤثر على التحليل. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.