التوكسوبلازما جدار الكيس الغوندية تشكيل المنشط تقوم البلاعم في نخاع العظام والمستمدة من الشروط المتباطئة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحفيز وتصوير تكوين جدار الكيس في طفيل Toxoplasma gondii مخبرياً (In vitro). ويتم تحقيق ذلك من خلال زراعة الخلايا البلعمية والخلايا الليفية أولاً.

وبعد ذلك، ومن خلال إصابة هذه الخلايا المضيفة بالطفيلي، يمكن تحفيز استجابات الإجهاد في العين من خلال صدم الخلايا الليفية بتغيير pH أو تنشيط الخلايا البلعمية، وكلاهما سيؤدي إلى تكوين جدار الكيس. وأخيراً، يُضاف اللكتين الفلوري إلى المزارع، والذي يرتبط بجدار الكيس، بحيث يمكن تصور الكيس باستخدام مجهر التألق المناعي. مرحباً، أنا كريستال توبين من مختبر الدكتورة لورا نويل في قسم الميكروبولوجيا الطبية وعلم المناعة بجامعة ويسكونسين ماديسون.

أنا أنجيلا بولارد، من مختبر No Lab أيضاً. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتكوين جدار كيس Toxoplasma Gandhi في المختبر. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة استجابات الطفيليات لظروف الإجهاد.

لنبدأ الآن. ابدأ بوضع شريحة غطاء زجاجية مستديرة ومعقمة في قاع كل بئر من أطباق زراعة الأنسجة ذات الـ 24 بئراً لتحفيز تحول Toxoplasma gondii إلى Bradyzoites في الخلايا الليفية للجلد البشري (human foreskin fibroblasts) تحت ظروف pH مرتفعة وتجويع من ثاني أكسيد الكربون. ابدأ باستخدام دورق بمساحة 150 سنتيمتر مربع يحتوي على طبقة متلاحمة (confluent) من الخلايا الليفية للجلد البشري تحت غطاء زراعة الأنسجة.

اغسل قارورة الخلايا الليفية لـقلفة الجلد البشرية الملتئمة مرتين باستخدام XPBS، ثم أضف 2.5 milliliters من trypsin EDTA بتركيز 0.025%. حضّن القارورة عند 37 degrees Celsius لمدة تتراوح من خمس إلى 10 minutes. بعد فترة التحضين التي تستمر من خمس إلى 10 minutes، انقر على القارورة عدة مرات لتحرير الخلايا من السطح البلاستيكي.

بعد ذلك، أضف 150 milliliters من وسط HFF أو وسط delcos modified eagles المضاف إليه مكملات. واستخدم الوسط لشطف الدورق وجمع الخلايا. وزع one milliliter من الخلايا في كل بئر من أطباق 24 well plate المزودة بشرائح تغطية، واترك الخلايا حتى تصل إلى مرحلة التلاقي عند 37 degrees Celsius في 5%carbon dioxide.

ستكون الخلايا بعد ذلك جاهزة للإصابة بطفيلي Toxoplasma Gandhi. تحت غطاء زراعة الأنسجة، قم بإصابة دورق بمساحة 25 square centimeter من الخلايا الليفية الجلدية البشرية الملتصقة (confluent human foreskin fibroblasts) بـ 2 × 10⁶ من الطفيليات، ثم حضنها عند 37 °C حتى تبدأ الخلايا في التحلل. بعد حوالي يومين إلى ثلاثة أيام، استخدم مكشطة الخلايا لإزالة الطبقة الأحادية من الخلايا الليفية الجلدية المصابة من دورق زراعة الأنسجة.

بعد ذلك، قم بتحرير الطفيليات من الخلايا المضيفة عن طريق تمرير الطبقة أحادية الخلية المنفصلة عبر إبرة قياس 27. استخدم مقياس كرات الدم (hemocytometer) لتحديد عدد الطفيليات في الوسط، ثم قم بإصابة كل بئر من الآبار الـ 24 التي تحتوي على أرومات ليفية جلدية بشرية متلاحمة مُحضرة مسبقاً بـ 10⁵ من الطفيليات.

قم بتحضين الخلايا لمدة ثلاث ساعات عند 37 درجة مئوية و5% ثاني أكسيد الكربون للسماح للطفيليات بغزو الخلايا المضيفة. انتقل بعد ذلك لتحفيز تحول الطفيليات إلى مرحلة Brady Zeolite. قم بإزالة DMEM من الخلايا الليفية لغلفة القضيب البشرية المصابة.

اشطفها باستخدام XPBS واحد، ثم أضف ملليلتر واحد من وسط التنمية؛ وهو وسط يعتمد على RPMI وبدون بيكربونات ومعدل إلى pH 8. قم بتحضين الخلايا لمدة ثلاثة أيام عند 37 درجة مئوية في الهواء المحيط.

أصبحت الخلايا الآن جاهزة لتحليل وجود الـ Brady zos. يتم تحديد وجود الـ Brady ZOS باستخدام ليكتين docos المسمى فلوريسنتياً بواسطة glutenin الفلوريسنتي أو DBA، والذي يرتبط بجدار الـ Toxoplasma Gandhi لتحضير الخلايا المصابة للتصوير الفلوريسنتي. اشطف الآبار ثلاث مرات باستخدام 1 XPBS.

بعد ذلك، يتم تثبيت الطبقات الأحادية من الخلايا باستخدام 200 µL من الفورمالدهيد بتركيز 3% لمدة 20 دقيقة. يتم إزالة المثبت وشطف الآبار باستخدام XPBS واحد. أضف 200 µL من الجلايسين بتركيز 0.1 molar إلى الآبار واتركها لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة الجلايسين وشطف الآبار بكمية واحدة من XPBS لحجب الخلايا ونفاذيتها. أضف 250 microliters من محلول الحجب. قم بتحضين الخلايا لمدة 30 دقيقة.

أزل محلول الحجب واشطف الآبار باستخدام XPBS واحد. أضف 50 microliters من تخفيف بنسبة 1 إلى 250 من DBA، والذي تم اقترانه بالرومين، إلى الآبار. غطِّ الطبق ورجّه في درجة حرارة الغرفة لمدة ساعة واحدة باستخدام هزاز منصي.

بعد الحضانة، يتم إزالة الـ DBA المسمى فلوريسنتياً عن طريق غسل الشرائح الغطائية ثلاث مرات باستخدام 0.2% Triton X 100 في one XPBS لمدة خمس دقائق في كل مرة على هزاز منصي، ثم يتم في النهاية تثبيت الشرائح الغطائية باستخدام وسط تثبيت beta shield المحتوي على dpi. يمكن معاينة صبغة T Gandhi باستخدام مجهر فلوريسنتي مع مرشح مناسب لـ rot domine بتكبير 100x. وكمنهج بديل لتحفيز تكوين Brady ZO، يمكن تنشيط البالعات المأكولة المشتقة من نخاع العظم المصابة باستخدام interferon, gamma والـ lipopolysaccharide أو LPS. لبدء ذلك، يتم أولاً تحضير الوسط الشرطي L 9 29 لهذه العملية.

تعتبر L 9 29 سلالة خلوية من الساركوما الليفية المطبقة التي تفرز العامل المحفز لمستعمرات البلاعم بعد فترات طويلة من الترافق. ويمكن استخدام هذا الوسط المكيف لتطوير خلايا نخاع العظم للفئران إلى بلاعم في المزرعة الخلوية. لتحضير الوسط المكيف، يتم تنمية خلايا L 9 2 9 في دورق بمساحة 150 square centimeter حتى تصل إلى حالة الترافق عند 37 degrees Celsius. ثم تُحضن لمدة إضافية تتراوح من سبعة إلى تسعة أيام حتى تظهر بشكل كروي وتبدأ في الانفصال عن سطح الدورق.

اجمع الوسط وأي خلايا منفصلة في أنبوب سعة 50 milliliter وقم بالطرد المركزي عند 420 5G لمدة 10 minutes. يمثل الرائق الناتج الوسط المكيف. سينتج عن قارورة مساحتها 150 square centimeter من خلايا L 9 29 ما يعادل 30 milliliters من الوسط المكيف، وهو الحجم المطلوب لتحضير 150 milliliters من وسط BMC. تذكر تحضير DMEM لـ BMC باستخدام L 9 29 cm لاستخدامه في تطوير BMC.

لمشاهدة بروتوكولات فيديو تفصيلية توضح طريقة عزل خلايا نخاع العظم. بالنسبة لفخذ الفأر، يرجى مشاهدة بروتوكولات الفيديو التالية بعد تحضين خلايا نخاع العظم (BMCs) التي تم حصادها لمدة خمسة أيام. في أطباق بتري البكتريولوجية، أضف 10 milliliters من وسط BMC، والذي سيحتوي على وسط مُكيَّف من خلايا L 9 2 9، إلى كل طبق وحضنها لمدة يومين إضافيين، وبعد ذلك ستكون الخلايا قد نمت بالكامل.

يمكن تمرير البلعميات المشتقة من نخاع العظم الناضجة أو BMS لمدة تتراوح من أسبوع إلى أسبوعين بعد نضجها لتقسيم الـ bms؛ قم بإزالة الوسط وإضافة خمسة ملليلتر من cold one XPBS مبرد عند 4 degrees Celsius لمدة 30 دقيقة حتى تبدأ الخلايا في الارتفاع. اشطف الخلايا من الطبق باستخدام ماصة نقل معقمة. اسحب الـ BMS في أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلتر وقم بترسيب الخلايا عند 420 5G لمدة 10 دقائق.

أعد تعليق الراسب في 10 milliliters من وسط BMC، ثم استخدم مقياس كرات الدم (hemo cytometer) لتحديد كثافة الخلايا. قم بزراعة 2 × 10⁵ من خلايا BMS في كل بئر. في طبق ذو 24 بئرًا يحتوي على شرائح تغطية دائرية في القاع، اترك الخلايا تلتصق طوال الليل قبل إصابتها بـ T Gandhi.

يمكن استزراع الخلايا الزائدة في أطباق بتري لاستخدامها لاحقاً. ولتنشيط خلايا BMS، قم بتحضير وسط التنشيط عن طريق تعريض LPS للموجات فوق الصوتية في حمام مائي لمدة دقيقتين لتفكيك أي تجمعات. ثم أضف إلى وسط BMC مقدار 100 nanograms per milliliter من LPS و 100 units per milliliter من IFN gamma.

أخيراً، قم بإزالة وسط BMC من الآبار واستبدله بوسط تنشيط. يتم التحضين عند 37 درجة مئوية، و5% ثاني أكسيد الكربون لمدة ثلاثة أيام. يمكن صبغ خلايا BMC كما تم توضيحه سابقاً مع أرومات ليفية للقلفة.

في هذه الأمثلة، تم وسم أكياس *Toxoplasma gondii* من النوع Bradyzoites باستخدام DBA الفلوري في الخلايا الليفية للقلفة البشرية تحت إجهاد pH. تم وسم جدار الكيس فلورياً كما يظهر في هذا المقطع العرضي لكيس مُستنبت في المختبر في خلايا dms التي تم تنشيطها باستخدام IFN Gamma و LPS-DVA.

يظهر التلوين أيضاً كما هو موضح هنا على سطح الفجوة. لقد عرضنا لكم للتو كيفية تلوين أكياس Toxoplasma gondii في المختبر داخل الخلايا الليفية والبلاعم المنشطة. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر التخطيط ليكون الطفيليات والخلايا المضيفة جاهزة في اليوم نفسه.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.