وهناك طريقة لعزل جزيرة الفئران تحت المحفظة وزراعة الكلى

تم اقتراح زراعة الجُزيرات كعلاج محتمل لمرض السكري من النوع الأول. ومع ذلك، هناك قيدان رئيسيان يمنعان تحويل هذا الإجراء إلى واقع سريري واسع النطاق؛ أولاً، هناك حاجة إلى عدد كبير من الجُزيرات لكل متلقٍ.

بما أن الجزر يتم الحصول عليها من متبرعين بالأعضاء، فإن عدد المتلقين المحتملين محدود للغاية. وتتطلب عملية الزرع الثانية علاجاً مدى الحياة بمثسبطات مناعة قوية، مما يعرض المريض، وخاصة الأطفال، لخطر الإصابة بالأورام الخبيثة والعدوى والفشل الكلوي. لذا، يتم إجراء عملية زرع الجزر تحت كبسولة كلية الفأر لاستقصاء استراتيجيات تحسين نتائج الزرع السريري.

تم عزل جزر لانجرهانز من فئران مانحة سليمة وتوزيعها إلى مجموعات وتجهيزها للزراعة. ثم تُزرع هذه الجزر في الحيز تحت المحفظة للكلية. وفي الفئران المستقبلة المصابة بالسكري، يتم تقييم وظيفة طعم الجزر عن طريق مراقبة مستويات جلوكوز الدم، والتي تظهر أن زراعة ما يقرب من 250 إلى 350 جزيرة ستؤدي إلى استعادة حالة سكر الدم الطبيعي في فأر مستقبل يزن 20 gram خلال 24 ساعة من عملية الزراعة.

يعد العرض المرئي لهذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية فيما يتعلق بخطوات قسطرة القناة الصفراوية الشائعة ونقل العروات إلى الحيز تحت المحفظي للكلية، حيث يصعب تعلم هذه الخطوات. وتتطلب هذه الإجراءات تحديداً دقيقاً لبنيات الأنسجة، وثباتاً في اليدين، واستخدام تقنية تقلل من تلف الأنسجة إلى أدنى حد.

ضع فأراً تم قتله رحيمًا في وضعية الاستلقاء الظهري على منشفة ورقية تحت مجهر التشريح، ورش منطقة البطن بـ 70% ethanol. استخدم المقص لفتح البطن عن طريق إجراء شق على شكل حرف V من المنطقة العانية وصولاً إلى كلتا الساقين الأماميتين. يظهر الفأر تحت مجهر التشريح.

قم بتوضيعه بحيث يكون الرأس موجهاً نحو المراقب. حدد مدخل القناة الصفراوية المشتركة في الاثني عشر باستخدام ملقط 혈ط (hemostat)، وهي الفتحة الاثني عشرية للقناة الصفراوية المشتركة. يجب وضع الملقط بحيث يمتد عند ضغطه بالضبط على طول الحدود الفاصلة بين البنكرياس والأمعاء.

سيتم هنا استعراض طريقتين لقثطرة القناة الصفراوية: طريقة اليد الحرة وطريقة المساعدة بالملقط لقثطرة القناة الصفراوية. عند استخدام طريقة اليد الحرة، اسحب الملقط الشرياني المثبت على الاثني عشر بعيداً عن رأس الفأر باتجاه الذيل حتى تصبح القناة الصفراوية المشتركة مشدودة.

يوجد ملتقى في القناة الصفراوية بالقرب من الكبد حيث تلتقي الصفراء المتدفقة من المرارة والإنزيمات القادمة من الكبد. قبل الدخول إلى الأمعاء، قم بشد القناة الصفراوية لإظهار الجزء الداخلي من موضع شكل V. استخدم إبرة منحنية عيار 27 متصلة بمحقنة سعة خمسة ملليلتر بحيث تنزلق الإبرة مباشرة عبر شكل V وتُقنطر الجزء السفلي من القناة. قم بتمرير الإبرة عدة ملليمترات إلى ما بعد نهاية الشطب لمنع التدفق العكسي إلى الكبد والمرارة.

بمجرد نجاح عملية القسطرة، يتم تروية البنكرياس عن طريق صرف 2 mL من مادة liase من المحقنة. راقب تمدد البنكرياس فوق المعدة كدليل على نجاح القسطرة بشكل مثالي. بدلاً من ذلك، يمكن إجراء القسطرة للقناة الصفراوية.

باستخدام طريقة ملقط الكيس. اسحب الملقط الشرياني C المثبت على الاثني عشر بعيداً عن رأس الفأر باتجاه الذيل بحيث يصبح القناة الصفراوية المشتركة ملتوية. ثم باستخدام إبرة مقوسة عيار 27 مثبتة بمحقنة سعة 5 ml، قم بثقب اللفافة أسفل القناة الصفراوية المشتركة بالقرب من الكبد.

استخدم الإبرة لإزالة اللفافة عن القناة مع إبقاء الإبرة في مكانها. ضع الملقط الشرياني جانبًا والتقط زوجًا من الملاقط. استخدم أحد ذراعي الملقط المفتوح لدعم القناة الصفراوية في الموضع الذي أزالت فيه الإبرة اللفافة، مع سحب القناة والملقط إلى الأمام.

قم بتمرير الإبرة داخل القناة باستخدام الملقط كمسند خلفي. يُستدل على نجاح عملية القسطرة من خلال التوسع المتساوي لمنطقة البنكرياس فوق المعدة. وبمجرد إتمام تروية البنكرياس، قم بإزالة الملقط الشرياني من الاثني عشر.

بعد ذلك، استخدم الملقط لرفع الاثني عشر واستخدم زوجاً ثانياً من الملاقط لفصل البنكرياس عن الأمعاء. ثم اسحب البنكرياس لتحريره من الجزء العلوي للمعدة والطحال. وأخيراً، ارفع البنكرياس خارج تجويف البطن واقطعه لتحريره من بقايا الروابط اللفافية المتصلة بالأمعاء والمعدة والطحال.

ضع البنكرياس في أنبوبة مخروطية سعة 50 milliliter وضعها على الثلج. قم بتحضين البنكرياس عند 37 degrees Celsius وفقاً للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب المرفق. بعد التحضين، أضف 20 milliliters من الوسط الغذائي إلى الأنابيب وقم بتفكيك النسيج عن طريق رج الأنابيب بقوة 40 مرة خلال 10 seconds.

تعد هذه الخطوة حاسمة لاستعادة البنفسج بشكل مثالي. يتم تدوير الخلايا بسرعة 800 rotations per minute. يتم تعليق الراسب في 15 milliliters من الوسط الغذائي وتكثيف العينات.

صب الملاط الذي تمت إعادة تعليقه عبر شبكة سلكية بقطر 0.419 millimeter وقم بتصفيته في أنبوب مخروطي جديد سعة 50 milliliter. اشطف الأنبوب الأول بـ 10 milliliters إضافية من الوسط الذي يحتوي على 10% fetal bovine serum وصبها عبر الشبكة السلكية، ثم قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي، وأعد تعليق الراسب في خمسة milliliters من his opaque في درجة حرارة الغرفة. بعد ذلك، قم بالرج باستخدام جهاز vortex بلطف لعدة ثوانٍ، وأضف خمسة milliliters إضافية من his opaque حول الجدار الداخلي للأنبوب لغسل الخلايا العالقة بجدار الأنبوب، ثم اسحب ببطء بواسطة الماصة لترك طبقة من 10 milliliters من RPMI الخالي من المصل على جانب الأنبوب بمعدل 1 milliliter كل 10 ثوانٍ.

يجب أن يكون هناك فاصل حاد واضح. بعد ذلك، يتم تدوير العينات في جهاز طرد مركزي ذو دلاء متأرجحة عند درجة حرارة 20 °C وبقوة 900 ×g لمدة 20 دقيقة مع تسريع بطيء جداً وبدون كبح؛ وبعد عملية الطرد المركزي، سيتم فصل الجزر عن الخلايا القنوية باستخدام ماصة سيرولوجية Disposable سعة 10 mL. انقُل الجزر من واجهة وسط histo Paque إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 mL.

يمكن تجميع عدة أنابيب في هذه المرحلة للتخلص من بقايا الجُزيرات، حيث تملأ الأنابيب المعتمة بوسط يحتوي على مصل، ثم يتم ترسيب الجُزيرات عن طريق طرد مركزي للأنابيب لمدة دقيقتين بسرعة 800 دورة في الدقيقة. بعد ذلك، يتم إعادة تعليق الجُزيرات في وسط طازج. تكرر هذه الخطوة مرتين على الأقل.

قم بتعليق الراسب في خمسة ملليلترات من الوسط الغذائي. ضع مصفاة خلايا نايلونية بمسام 0.1 مليمتر بشكل مقلوب على أنبوب مخروطي سعة 15 ملليلتر. ثم انقل ملاط الخلايا المعاد تعليقه باستخدام الماصة عبر المصفاة لجمع العيينات.

ثم اشطف الأنبوب سعة 50 milliliter بستة milliliter إضافية من الوسط المزارع ومررها عبر المصفاة. ضع قطرة بحجم ثلاثة milliliter من الوسط المزارع في أطباق بتري قطرها 10 centimeter. اقلب مصفاة الخلايا واغمسها في قطرة الوسط لجمع العروات، ثم استخدم الماصة لنقل من خمسة إلى سبعة milliliter إضافية من الوسط المزارع عبر المصفاة إلى طبق بتري.

لجمع أي حلقات قزحية متبقية من المصفاة تحت عدسة شيئية بقوة تكبير 4x، يتم التقاط الحلقات بشكل فردي باستخدام ماصة P 200 ونقلها إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1.5 milliliter. تُظهر هذه الصور حلقات قزحية تم عزلها من فئران C 57 black six بعمر 12 أسبوعًا. ويمكن تقدير نقاء وجودة الحلقات مجهريًا عند الانتهاء من إجراء العزل.

على سبيل المثال، تُظهر الصورتان المعروضتان هنا مجالاً تمثيلياً تظهر فيه الشوائب وتلوث الخلايا الإفرازية. عند اختيار العوينات (eyelets) لإجراء تجربة ما، يجب تجنب اختيار أي خلايا إفرازية ملوثة أو عوينات تبدو غير صحية. تُعد العوينات ذات المراكز النخرية غير صحية كما هو موضح في هذا الشكل المأخوذ بعد 24 ساعة من العزل، علماً بأن المراكز النخرية لن تكون مرئية فوراً بعد عملية العزل.

لا يمكن تجنب وجود جُزيرات تفرز خلايا، ويمكن استخدامها في عمليات زراعة الجُزيرات كما يظهر في هذا المقطع المرئي بنظام الفاصل الزمني لمدة 24 ساعة للجُزيرات. فبعد العزل مباشرة، تتكون مراكز تنخرية داخل العديد من الجُزيرات. ويبدو أن هذه المراكز التنخرية تُطرد من الجُزيرة قرب نهاية التسجيل أثناء عملية التقاط الجُزيرات.

قم بتجميعها بحيث يحتوي كل أنبوب على توزيع متساوٍ من حيث جودة وحجم الفتحات. على سبيل المثال، قد تحتوي كل مجموعة مكونة من 15 فتحة على أربع فتحات كبيرة الحجم، وست فتحات متوسطة، وخمس فتحات صغيرة. ضع الأنبوب على الثلج، ويمكن استخدام الفتحات فوراً في عملية الزرع أو معالجتها.

قبل الاستخدام، ضع طرف تحميل الهلام المعقم في فتحة أنبوب دقيق سعة 1.5 milliliter بحيث يكون هناك انحناء بسيط يشكل حرف U في الطرف الضيق من الرأس. يجب أن تكون كلتا فتحتي الطرف موجهتين للأعلى مباشرة خارج الأنبوب الدقيق.

أخرج أنبوباً من العيينات (eyelets) بلطف من الثلج. تأكد من استقرار جميع العيينات في قاع الأنبوب. باستخدام ماصة P 200، اجمع العيينات بلطف بأقل حجم ممكن من قاع الأنبوب وانقلها إلى الطرف المنحني المجهز.

بعد ترسب الجزر، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسط من الطرف عن طريق سحب الوسط عبر الفتحة الكبيرة لطرف تحميل الهلام الذي يحتوي على الجزر باستخدام طرف تحميل هلام جديد مثبت على ماصة P 200. قم بتوصيل الطرف غير المشطوف من الأنبوب بالفتحة الضيقة لطرف تحميل الهلام الذي يحتوي على الجزر. ثم قم بتثبيت الطرف في ماصة P 200 وادفع الجزر برفق إلى داخل الأنبوب.

بعد ذلك، قم بتوصيل الحافة غير المشطوفة لأنبوب PE 50 بإبرة حقنة Hamilton سعة 25 microliter. اسحب المكبس ثم اضغط على مكبس الحقنة حتى تصبح العوينات على بُعد 0.5 centimeters تقريبًا من الفتحة المشطوفة. ضع الحقنة جانبًا حتى تستقر العوينات في كتلة واحدة بالقرب من الفتحة المشطوفة للأنبوب أثناء تحضير الكلية لاستقبال العوينات.

قم بتجهيز موقع الجراحة عن طريق قص الشعر وفرك الجلد بـ Betadine بالتناوب مع كحول isopropyl بتركيز 70% ثلاث مرات. ابدأ إجراء زراعة العروة عن طريق القيام بقرصة لإصبع القدم للتأكد من التخدير في الفأر المستقبل. ضع ساق قضيب زجاجي مباشرة تحت الفأر وأسفل الكلية بشكل عمودي على الحبل الشوكي.

بعد ذلك، حدد موقع الكلى عبر الجلد وضع غطاءً جراحياً معقماً. وبمجرد تحديد موقع الكلية، استخدم مقصات McFerson banis لإجراء شق بطول سنتيمترين عبر الأدمة مباشرة فوقها وبشكل عمودي على الحبل الشوكي. سيكشف هذا الشق باستخدام المقصات عن الجدار البريتوني.

قم بإجراء شق بطول واحد سنتيمتر عبر الجدار البريتوني في نفس اتجاه الشق الذي تم في الطبقة الجلدية، مع استخدام ساق القضيب الزجاجي كمسند خلفي، ثم ادفع الكلية عبر الفتحة البريتونية عن طريق الضغط على السطح المجاور. بلل سطح الكلية المكشوفة باستخدام PBS معقم ومبرد بالثلج بواسطة مسحة قطنية مبللة. كرر هذه الخطوة كل بضع دقائق حسب الحاجة لمنع جفاف كبسولة الكلية.

باستخدام إبرة بقياس 27 gauge، قم بعمل شق بطول 0.2 centimeter عبر كبسولة الكلية على السطح الأمامي للكلية. وبالانتقال من الجانب الوحشي الأيسر نحو الجانب الوحشي الأيمن، أدخل أنبوبة شعرية زجاجية مسحوبة باللهب. قم بالسبر عبر الشق الذي تم عمله سابقاً وحركه في اتجاه خلفي على طول السطح الوحشي الظهري للكلية.

لإنشاء جيب بين محفظة الكلية ونسيج الكلية الحشوي، حرك الحلقات في سرنجة هاميلتون سعة 25 milliliter المجهزة إلى الحافة القصوى للفتحة المائلة للأنبوب المرن. بعد ذلك، أدخل الحافة المائلة بحيث تكون متجهة للأعلى داخل الجيب تحت المحفظة. وتكون الحافة الطويلة ملامسة لنسيج الكلية الحشوي.

حرك الأنبوب إلى النهاية الخلفية من المحفظة. ثم انقل الحلقات ببطء من أنبوب PE 50 إلى الجيب تحت المحفظة عن طريق الضغط على مكبس المحقنة. ومع امتلاء الجيب بالحلقات، اسحب الأنبوب المرن للخلف ببطء لإفساح المزيد من المجال.

بعد إخراج الأنبوب من الكيس، قم بتمرير المسبار الزجاجي على طول السطح الخارجي للكلية من الجهة الأمامية إلى الخلفية لضغط الفتحات برفق في الطرف القريب من الكيس. وباستخدام ملاقط ذات ذراع منحنية، ارفع بطانة الصفاق المجاورة للفتحة التي تم إجراؤها للكلية. ثم استخدم مسحة قطنية مبللة بمحلول PBS لدفع الكلية برفق إلى داخل التجويف الصفاقي.

أغلق جرح الفأر عن طريق وضع غرز جراحية في جدار الصفاق ومشابك جراحية في الطبقة الجلدية. أعد الفأر إلى قفصه وراقبه. وللمساعدة في التعافي، يجب توفير مياه تحتوي على أسيتات الميئين لأمعاء الفأر.

تم عزل عينات من عيون الفئران C. وباستخدام الطرق الموضحة في هذا الفيديو، تم زرع جرعة علاجية في فئران C 57 black six خيفية. وتمت مراقبة مستويات جلوكوز الدم في حالة عدم الصيام بدءاً من اليوم الأول بعد الجراحة.

يُلاحظ حدوث الرفض في اليوم 17 تقريباً في الفئران المستقبلة التي تزن 20 جراماً والتي تلقت 300 من العوينات (eyelets) من مانح خيفي (allogeneic) هنا. تم رصد التعافي في الفئران التي تلقت إما 150 عوينة أو 300 عوينة من مانحين متماثلي الجينات (syngeneic). ولم يُلاحظ أي رفض في هذه الطعوم لأن العوينات مأخوذة من مانحين متماثلي الجينات.

تقيس جرعة الجزرِيّات (eyelets) التي يتم إعطاؤها الوظيفة الأساسية للجزرِيّات مباشرة بعد عملية الزرع. وبينما لوحظ تعافٍ جزئي عند زرع 150 جزرِيّة، فقد لوحظ تعافٍ كامل عند زرع 300 جزرِيّة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يتكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ الخطوات الحرجة المطلوبة لعزل الجزرِيّات من الفئران وزرع هذه الجزرِيّات تحت الحيز تحت المحفظي للكلية.

مع الممارسة، ستطور القدرة على قسطرة القناة الصفراوية المشتركة بسرعة، وهي الخطوة الأكثر صعوبة في هذا البروتوكول.