أبريل 13, 2011
وقد اقترح زرع الجزر المعزولة لتكون المعاملة المحتملة للاصابة بداء السكري من النوع 1. نحن هنا وصف الأسلوب لعزل الجزر من بنكرياسات الماوس وزرع لهم في الفضاء تحت المحفظة في الكلى.
تم اقتراح زراعة العيينة كعلاج محتمل لمرض السكري من النوع الأول. ومع ذلك ، هناك قيدان رئيسيان يمنعانها من أن تكون حقيقة سريرية واسعة الانتشار. أولا ، هناك حاجة إلى عدد كبير من الثقوب لكل مستلم.
نظرا لأنه يتم الحصول على الثقوب من المتبرعين بالأعضاء ، فإن عدد المتلقين المحتملين محدود للغاية. تتطلب عملية الزرع الثانية علاجا مدى الحياة باستخدام مثبطات مناعية قوية ، مما يعرض المريض ، وخاصة الأطفال لخطر الإصابة بالأورام الخبيثة والعدوى والفشل الكلوي. يتم إجراء زراعة العيينة تحت كبسولة الكلى الفأرية للتحقيق في استراتيجيات تحسين نتائج الزرع السريري.
ثقوب معزولة من الفئران المانحة السليمة متنوعة إلى مجموعات وأعدت للزراعة. ثم يتم زرع الثقوب في المساحة تحت المحفظة للكلى. في الفئران المتلقية لمرض السكري ، يتم تقييم وظيفة تطعيم العيينة من خلال مراقبة مستويات الجلوكوز في الدم ، والتي تكشف أن ما يقرب من 250 إلى 350 ثقبا ستعيد نسبة السكر في الدم في فأر متلقي يبلغ وزنه 20 جراما في غضون 24 ساعة من الزرع.
يعدالعرض المرئي لهذه الطريقة أمرا بالغ الأهمية فيما يتعلق بخطوات التقميم. يصعب تعلم القناة الصفراوية المشتركة ونقل الثقوب إلى الفضاء تحت المحفظة للكلى. تتطلب هذه الخطوات تحديد هياكل الأنسجة والأيدي الثابتة واستخدام تقنية تقلل من تلف الأنسجة.
ضع فأر القتل الرحيم في وضع ضعيف على منشفة ورقية في نطاق التشريح ورش البطن بنسبة 70٪ من الإيثانول. استخدم المقص لفتح البطن بشق V من منطقة العانة إلى كلتا الساقين الأماميتين. الماوس أسفل نطاق التشريح.
ضعه مع توجيه الرأس نحو المراقب. حدد موقع مدخل الاثني عشر للقناة الصفراوية المشتركة باستخدام مشبك مرقئ ، فتحة الاثني عشر للقناة الصفراوية المشتركة. يجب وضع الإرقاء بحيث يمتد بالضبط عند ضغطه على طول حدود أمعاء البنكرياس.
هنا سيتم عرض طريقتين لقنية القناة الصفراوية. طريقة اليد الحرة وطريقة مساعدة الملقط على قنية القناة الصفراوية. باستخدام طريقة اليد الحرة ، اسحب الإرقاء المثبت على الاثني عشر بعيدا عن رأس الفأر باتجاه الذيل بحيث تصبح القناة الصفراوية المشتركة مشدودة.
يوجد التقاء في القناة الصفراوية بالقرب من الكبد حيث يجتمع تصريف الصفراء من المرارة والإنزيمات من الكبد قبل دخول الأمعاء ، اسحب القناة الصفراوية بإحكام لكشف الجزء الداخلي من الموضع V. إبرة مثنية قياس 27 متصلة بحقنة سعة خمسة ملليلتر بحيث تنزلق الإبرة مباشرة عبر V وتقلب الجزء السفلي من القناة مباشرة. حرك الإبرة عدة ملليمترات خلف نهاية الشطبة لمنع التدفق العكسي إلى الكبد والمرارة.
بمجرد نجاح القنية ، قم ببث البنكرياس عن طريق توزيع ملليلترين من الليزة من المحقنة. راقب تمدد البنكرياس فوق المعدة كمؤشر على القنية المثلى. بدلا من ذلك ، يمكن قنية القناة الصفراوية.
باستخدام طريقة كيس الملقط. اسحب الإرقاء C المثبت على الاثني عشر بعيدا عن رأس الفأر باتجاه الذيل بحيث تصبح القناة الصفراوية المشتركة تورت. ثم باستخدام إبرة مثنية قياس 27 متصلة بحقنة سعة خمسة ملليلتر ، قم بثقب اللفافة أسفل القناة الصفراوية المشتركة بالقرب من الكبد.
استخدم الإبرة لإزالة اللفافة من القناة مع بقاء الإبرة في مكانها. ضع الإرقاء لأسفل والتقط زوجا من الملقط. استخدم ذراعا واحدا من الملقط المفتوح لدعم القناة الصفراوية حيث قامت الإبرة بإزالة اللفافة أثناء سحب القناة والملقط للأمام.
حرك الإبرة في القناة باستخدام الملقط كدعامة. يشار إلى القنية الناجحة من خلال التوسع المتساوي لمنطقة البنكرياس أعلى المعدة. بمجرد أن يتم نفخ البنكرياس ، قم بإزالة الإرقاء من الاثني عشر.
ثم استخدم الملقط لرفع الاثني عشر واستخدم زوجا ثانيا من الملقط لفصل البنكرياس عن الأمعاء. بعد ذلك ، اسحب البنكرياس من أعلى المعدة والطحال. أخيرا ، ارفع البنكرياس من البطن واقطعه من وصلات اللفافة المتبقية إلى الأمعاء والمعدة والطحال.
ضع البنكرياس في أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر وضعه على الثلج. احتضان البنكرياس عند 37 درجة مئوية وفقا للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب المصاحب. بعد الحضانة ، أضف 20 مل من الوسائط إلى الأنابيب وفصل الأنسجة عن طريق هز الأنابيب بقوة 40 مرة في 10 ثوان.
هذه الخطوة ضرورية للتعافي الأمثل من البنفسج. خلايا الدوران هي 800 دورة في الدقيقة. تنفق Resus في 15 مل من الوسائط وتكثيف العينات.
صب الملاط المعلق من خلال شبكة سلكية 0.419 ملم وقم بتوجيهه إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل. شطف الأنبوب الأول مع إضافية 10 ملليلتر من الوسائط التي تحتوي على 10٪ مصل الأبقار الجنين وصبه من خلال شبكة سلكية بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي ريوس, ثني الحبيبات في خمسة ملليلتر من درجة حرارة الغرفة له معتم 10 77. ثم دوامة برفق لعدة ثوان, إضافة خمسة ملليلتر إضافية من معتمه حول داخل الأنبوب لغسل الثقوب من جدار الأنبوب ماصة ببطء لتراكب 10 ملليلتر من مصل خالية من RPMI أسفل جانب الأنبوب بمعدل واحد مليلتر كل 10 ثوان.
يجب أن تكون الواجهة الحادة واضحة. ثم قم بتدوير العينات في جهاز طرد مركزي دلو متأرجح عند 20 درجة مئوية و 900 ضعف الجاذبية لمدة 20 دقيقة مع تسارع بطيء جدا وبدون فرملة بعد الطرد المركزي ، سيتم فصل الجزر عن الخلايا الخارجية باستخدام ماصة مصلية يمكن التخلص منها 10 ملليلتر. انقل الثقوب من واجهة وسائط histo Paque إلى أنبوب مخروطي جديد سعة 50 مل.
يمكن تجميع العديد من الأنابيب في هذه المرحلة لإزالة الثقوب المتبقية ، وأنابيب التعبئة غير الشفافة الخاصة به مع المصل الذي يحتوي على وسائط وحبيبات الجزر الصغيرة عن طريق الطرد المركزي للأنابيب لمدة دقيقتين بمعدل 800 دورة في الدقيقة. ثم قم بتعليق الجزر الصغيرة في وسائط جديدة. كرر هذه الخطوة مرتين على الأقل. ريوس.
قم بتعليق البليت في خمسة ملليلتر من الوسائط. ضع مصفاة خلية نايلون مقلوبة مقلوبة على أنبوب مخروطي سعة 15 مل. ماصة ملاط الخلية المعلقة من خلاله لجمع الثقوب.
ثم اشطف الأنبوب سعة 50 مليلتر بستة ملليلتر إضافية من الوسائط وقم بتمريره عبر المصفاة. ضع قطرة ثلاثة ملليلتر من المتوسط في طبق بتري 10 سم. اقلب مصفاة الخلية واغمسها في قطرة الوسائط لجمع ماصة الثقوب من خمسة إلى سبعة ملليلتر إضافية من وسط الاستزراع من خلال المصفاة في طبق بتري.
لجمع أي ثقوب متبقية من المصفاة تحت هدف أربع مرات ، اختر الثقوب بشكل فردي باستخدام ماصة P 200 وانقلها إلى أنبوب فوج دقيق سعة 1.5 ملليلتر. تظهر هذه الصور ثقوبا معزولة من ستة فئران سوداء يبلغ عمرها 12 أسبوعا. يمكن تقدير نقاء وجودة الثقوب مجهريا عند الانتهاء من إجراء العزل.
على سبيل المثال ، تظهر الصورتان المظهرتان هنا حقلا تمثيليا حيث يوجد تلوث الحطام والخلايا الخارجية. عند اختيار الثقوب لإجراء تجربة ، تجنب اختيار أي خلايا خارجية ملوثة أو ثقوب تبدو غير صحية. الثقوب ذات المراكز النخرية غير صحية كما هو موضح في هذا الشكل الذي تم التأخير بعد 24 ساعة من العزل ، ولن تكون المراكز النخرية مرئية مباشرة بعد العزل.
لامفر من الثقوب التي تتكاثر الخلايا ويمكن استخدامها في زراعة العيينة في هذا الفيديو بفاصل زمني مدته 24 ساعة للثقوب. مباشرة بعد العزلة ، تتطور المراكز النخرية داخل العديد من الثقوب. يبدو أن هذه المراكز النخرية قد طردت من الثقب بالقرب من نهاية التسجيل أثناء التقاط الثقوب.
قم بتجميعها بحيث يكون لكل أنبوب توزيع متساو لجودة العيينة وحجمها. على سبيل المثال ، قد تحتوي كل مجموعة من 15 ثقبا على أربع ثقوب كبيرة الحجم ، وست ثقوب متوسطة ، وخمس ثقوب صغيرة. مكان. يمكن استخدام الأنبوب الموجود على ثقوب الجليد على الفور للزرع أو التلاعب به.
قبل الاستخدام. ضع طرف تحميل هلام معقم في فتحة أنبوب صغير مدمج سعة 1.5 مليلتر بحيث يكون هناك انحناء لطيف ، مما يجعل شكل U في الطرف الضيق من الحافة. يجب أن تكون فتحتا الطرف متجهتين مباشرة إلى أعلى أنبوب النفايات الصغير.
قم بإزالة أنبوب الثقوب برفق من الجليد. تأكد من أن جميع الثقوب قد استقرت في قاع الأنبوب. باستخدام ماصة P 200 ، اجمع الثقوب برفق بحجم صغير من أسفل الأنبوب وانقلها إلى الطرف المنحني المعد.
بعد ترسيب الثقوب ، قم بإزالة أكبر قدر ممكن من الوسائط من الطرف عن طريق شفط الوسائط من خلال الفتحة الكبيرة لطرف تحميل الجل المحمل للعيينة باستخدام طرف تحميل هلام جديد متصل بماصة P 200. قم بتوصيل الطرف غير المشطوف للأنبوب بالفتحة الضيقة لطرف تحميل هلام محمل الجزيرة. ثم قم بتوصيل الطرف بماصة P 200 وادفع الجزر برفق إلى الأنبوب.
بعد ذلك ، قم بتوصيل الحافة غير المشطوفة لأنبوب PE 50 بإبرة حقنة هاميلتون سعة 25 ميكرولتر. مع سحب المكبس للضغط على مكبس المحقنة حتى تكون الثقوب على بعد 0.5 سم تقريبا من الفتحة المشطوفة. ضع المحقنة جانبا بحيث تستقر الثقوب في كتلة واحدة بالقرب من الفتحة المشطوفة للأنبوب أثناء تحضير الكلية لاستقبال الثقوب.
جهز موقع الجراحة عن طريق قص الشعر وفرك الجلد باستخدام البيتادين بالتناوب مع 70٪ كحول الأيزوبروبيل ثلاث مرات. ابدأ إجراء زراعة العيينة عن طريق إجراء قرصة إصبع القدم لتأكيد التخدير في الفأر المتلقي. ضع عمود قضيب زجاجي أسفل الفأر مباشرة وأسفل الكلية عموديا على الحبل الشوكي.
ثم حدد موقع الكلية من خلال الجلد وضع ستارة جراحية معقمة. بمجرد تحديد موقع الكلية ، استخدم مقص McFerson banis لعمل شق بطول سنتيمترين عبر الأدمة فوقها مباشرة بشكل عمودي على الحبل الشوكي. سيكشف هذا الشق الجدار البريتوني بالمقص.
قم بعمل شق بطول سنتيمتر واحد عبر الجدار البريتوني في نفس اتجاه القطع من خلال الطبقة الجلدية باستخدام عمود القضيب الزجاجي كدعم ، وأجبر الكلى على المرور عبر الفتحة البريتونية عن طريق الضغط لأسفل على السطح المجاور. بلل سطح الكلية المكشوفة باستخدام PBS المثلج والمعقم باستخدام قضيب قطني مبلل. كرر الخطوة كل بضع دقائق حسب الحاجة لمنع كبسولة الكلى من الجفاف.
باستخدام إبرة قياس 27 ، قم بعمل شق 0.2 سم عبر كبسولة الكلى عبر السطح الأمامي للكلى. بالانتقال من الجانب الجانبي الأيسر باتجاه الجانب الجانبي الأيمن ، أدخل أنبوبا شعريا زجاجيا مسحوبا باللهب. افحص من خلال الشق الذي تم إجراؤه في وقت سابق وحركه في الاتجاه الخلفي على طول السطح الجانبي الظهري للكلى.
لإنشاء كيس بين كبسولة الكلى وحمة الكلى ، انقل الثقوب الموجودة في حقنة هاميلتون المحضرة سعة 25 مليلتر إلى حافة الفتحة المشطوفة للأنبوب المرن. ثم أدخل الحافة المشطوفة المتجهة لأعلى في الحقيبة تحت المحفظة. الحافة الطويلة على اتصال مع حمة الكلى.
حرك الأنبوب إلى أقصى الطرف الخلفي من الكبسولة. ثم انقل الثقوب ببطء من أنبوب PE 50 إلى الحقيبة تحت المحفظة عن طريق الضغط على مكبس المحقنة. عندما تملأ الثقوب الحقيبة ، قم بإعادة الأنبوب المرن ببطء لإفساح المجال أكثر.
بعد إزالة الأنبوب من الكيس ، حرك المسبار الزجاجي على طول السطح الخارجي للكلية من الأمام إلى الخلفي لتعبئة الثقوب برفق في الطرف القريب من الحقيبة. باستخدام ملقط الذراع المثني ، ارفع البطانة البريتونية المجاورة للفتحة المصنوعة للكلى. ثم استخدم قضيب قطني مبلل برائحة PBS لدفع الكلية برفق إلى التجويف البريتوني.
أغلق الماوس عن طريق وضع خيوط جراحية على الجدار البريتوني ومشابك الجرح على الطبقة الجلدية. أعد الماوس إلى قفصه وشاشته. للتعافي ، يجب توفير ماء أسيتو مين لأمعاء الفأر.
C ثقوب الفأر معزولة. باستخدام الطرق الموضحة في هذا الفيديو ، تم زرع جرعة علاجية في ستة فئران سوداء C 57 خيفية. تمت مراقبة مستويات الجلوكوز في الدم غير الصائم بدءا من اليوم الأول بعد الجراحة.
يجب رؤية الرفض في حوالي اليوم 17 في 20 جراما من الفئران المتلقية التي تلقت 300 ثقوب من متبرع خيفي هنا. تمت مراقبة الشفاء في الفئران التي تلقت إما 150 ثقوبا أو 300 ثقوبة من متبرعين متزابقين. لا يظهر أي رفض في عمليات الزرع هذه لأن الثقوب من متبرعين متزاكين.
تقيس جرعة العيينة التي يتم إعطاؤها الوظيفة الأساسية للثقوب مباشرة بعد الزرع. بينما شوهد الانتعاش الهامشي مع 150 ثقوب ، شوهد الشفاء التام عندما تم زرع 300 ثقب. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تنفيذ الخطوات الحاسمة المطلوبة لعزل ثقوب الفئران وزرع تلك الثقوب تحت المساحة تحت المحفظة للكلى.
من خلال الممارسة، ستقوم بتطوير القدرة على قنية القناة الصفراوية المشتركة بسرعة، وهي أصعب خطوة في هذا البروتوكول.
تقدم هذه الدراسة طريقة لعزل الجزر من البنكرياس الفأري وزرعها في الفضاء تحت الكبسولة للكلية. يهدف الزرع لاستكشاف العلاجات المحتملة لمرض السكري من النوع الأول.
Islet transplantation remains constrained by donor scarcity and immunosuppression burden, limiting therapeutic scalability in type 1 diabetes. This murine model enables preclinical evaluation of islet quality, dose-response relationships, and graft function under controlled conditions. By standardizing isolation and subcapsular transplantation, the method supports mechanistic de-risking of islet-based therapies prior to IND-enabling studies.
The method integrates into the discovery continuum from islet isolation (lead identification) to functional assessment in diabetic models (preclinical validation), enabling iterative optimization of isolation protocols and transplantation techniques.