في الرحم بعد Electroporation للثقافة متعلق بالخلايا العصبية الأولية لدراسة وظائف الجينات في مجموعة فرعية من العصبونات القشرية

الهدف العام من التجربة التالية هو فحص التأثيرات التنموية للضربة القاضية أو الإفراط في التعبير عن الجينات في مجموعات فرعية محددة من الخلايا السلفية العصبية في القشرة المخية الحديثة. يتم تحقيق ذلك عن طريق التثقيب الكهربائي للحمض النووي في الجسم الحي إلى أجنة الفئران لنقل الخلايا السلفية القشرية الحديثة. كخطوة ثانية ، يتم تشريح المنطقة المثقلة بالكهرباء من أجل إثراء الخلايا المنقولة.

بعد ذلك ، يتم فصل هذه الخلايا وطلاءها في شرائح الغرفة وزراعتها. من أجل فحص آثار كل من التغيير الجيني الجوهري وتطبيق العوامل الخارجية ، تم الحصول على نتائج تظهر التأثيرات على نمو العصبات والتفرع بناء على القياسات الكمية باستخدام برنامج avision. الميزة الرئيسية لهذه التقنية على غيرها ، مثل تعداء الدهون للثقافات العصبية الأولية ، هي أنه يمكننا استهداف مجموعات فرعية محددة من الخلايا السلفية العصبية.

على سبيل المثال ، سيتم نقل الخلايا العصبية الجلوتاميتية فقط باستخدام هذه الطريقة. بالإضافة إلى ذلك ، يمكننا الصلاة الكهربائية في المراحل الجنينية المبكرة واستهداف الخلايا العصبية ذات الطبقة العميقة المولودة في وقت مبكر ، أو يمكننا الإلكتروليت في مراحل لاحقة من التطور واستهداف الخلايا العصبية المولودة لاحقا والتي تكون متجهة إلى طبقات أكثر سطحية من القشرة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في مجال النمو العصبي.

على سبيل المثال ، كيف تتفاعل العوامل الجوهرية والخارجية للتأثير على النمو العصبي والتفرع؟ على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر نظرة ثاقبة لنمو العملية العصبية ، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضا على عمليات النمو العصبي الأخرى مثل تكوين التشابك العصبي وتكاثر الخلايا وتحديد الكبريتات. قم بإعداد إبرة حقن كما هو موضح في النص المصاحب.

تجنب الفقاعات ردم الإبرة بالحمض النووي الذي يعبر عن GFP والجين محل الاهتمام يشمل اللون الأخضر السريع لتصور الحقن ، قم بتحميل المساحة المتبقية في الإبرة بزيت الذرة. قم بتوصيل رذاذ بيكو بالإبرة المحملة للتحكم في الحقن. كشف قرون الرحم لفأر رذاذ الحامل المخدر كما هو موضح سابقا.

وفي النص المصاحب لهذا الفيديو ، يظهر حقن أجنة E 15 هنا. حدد موقع الحقن عن طريق إضاءة الأجنة بمصباح معقوفة. قم بمعالجة جنين واحد برفق للعثور على مكان الرأس وتحديد موقع خياطة خط الوسط.

استخدم هذا كمعلم للعثور على البطين الجانبي. حقن الحمض النووي من خلال جدار الرحم وفي البطين الجانبي. حقن نبضات متعددة في البطين حتى تمتلئ بالحمض النووي.

يعد المتجه الذي يحدده وضع الأقطاب الكهربائية أمرا بالغ الأهمية لتحديد أي منطقة من القشرة المخية الحديثة يتم تثقيبها بالكهرباء. هنا يتم وضع القطب الموجب بالقرب من المواضع الإنسية الظهرية عبر المخ لاستهداف هذه المنطقة من الدماغ الأمامي. سيستهدف الوضع البديل للأقطاب الكهربائية مناطق أخرى من القشرة ، بما في ذلك التيار القشري الجانبي.

حقن كل جنين وتغذيه بالكهرباء. في المقابل ، أعد قرون الرحم إلى تجويف الجسم وأغلق الشق. راقب أثناء تعافيها من التخدير.

هنا يتم حصاد للاستزراع بعد 24 ساعة من التثقيب الكهربائي ، بحيث يمكن اكتشاف GFP. قم بإزالة الأجنة من رحم الجرذ القتل رحيم وضعه في طبق بتري مليء ب HBSS المثلج البارد مع كاتيون ثنائي التكافؤ في غطاء تدفق الصفيحة. وتحت مجهر تشريح الفلورسنت ، استخدم ملقط دومون رقم خمسة.

لتشريح القشرية. استخدم ملقط مقاس دومون رقم ثلاثة لإزالة السحايا ، وقم بتشغيل التألق باستخدام زوج من مقص الفال. قطع المناطق الإيجابية GFP من الأنسجة.

انقل هذه القطع إلى أنبوب مخروطي سعة 50 مليلتر مملوء ب HBSS المثلج البارد بدون كاتيون ثنائي التكافؤ. اجمع كل القطع الإيجابية ل GFP في الأنبوب. قم بإزالة HBSS من الأنبوب واستبدله بمليلتر واحد من محلول EDTA 0.25٪ تريبسون ممزوج برفق بواسطة حاضنة انعكاس 37 درجة مئوية لمدة خمس دقائق.

قم بإزالة محلول التريبسين. استبدله بما بين واحد وخمسة ملليلتر من وسط الطلاء اعتمادا على كمية الأنسجة الإيجابية GFP. باستخدام ماصة شريطية سعة ملليلترين ، أكلت خمس إلى سبع مرات لفصل الخلايا.

عد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي المخفف بوسط الطلاء بتركيز اثنين إلى 3.5 مرات 10 إلى الخلايا الخمس لكل 1.5 مليلتر من الصفيحة المتوسطة 1.5 ملليلتر في كل غرفة من غرفة CC اثنين من المغلفة. تزحلق. احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية لمدة أربع ساعات للسماح للخلايا بالالتصاق بالشرائح. استنشق وسط الطلاء يحتوي على 1.5 مل من الوسط العصبي لكل ثقافة غرفة.

الخلايا عند 37 درجة مئوية إلى المرحلة المرغوبة قبل الشروع في تلطيخ المناعة. لقياسات العملية العصبية. تتراوح ثقافة توقيت النمو بين 24 ساعة وسبعة أيام.

في غطاء الدخان ، استنشق الوسيط من كل غرفة ثقافة. ثبت الخلايا باستخدام 4٪ فورمالديهايد لمدة 15 دقيقة. اغسل مرتين بسرعة مع مرة واحدة PBS قبل الحظر والمناعة التي شوهدت في الثقافات كما هو مفصل في النص المصاحب ، قم بتركيب الثقافات بوسط تركيب الفلورسنت وزلة غطاء.

تصور الثقافات عند 20 × تحت المجهر الفلوري. سجل صورا للخلايا العصبية الإيجابية ل GFP لتحليلها. لقد وجدنا أنه باستخدام هذه التقنية ، يتم استهداف ما يقرب من 75٪ من الأدمغة الكهربائية المنطقة المرغوبة من القشرة ، سواء كانت القشرة الإنسية الظهرية أو القشرة الجانبية البطنية.

لقد وجدنا التثقيب الكهربائي المبكر في E 13 إلى 14 ، وتستهدف الخلايا العصبية ذات الطبقة العميقة مثل TBR ، وطبقة موجبة واحدة ، وستة خلايا عصبية ، بينما تستهدف التثقيب الكهربائي في وقت لاحق ، CT IP ، اثنان إيجابيان ، TBR ، طبقة واحدة سالبة ، خمس خلايا لاحقة ، هدف التثقيب الكهربائي BRN ، طبقتان موجبة ، اثنتان ، ثلاث خلايا. نعرض هنا الأقسام الإكليلية من الأدمغة التي تم تكوينها كهربائيا إما في اليوم الجنيني 15.5 أو 17.5 وتم حصادها في اليوم الخامس بعد الولادة. في الثقافة ، يمكن أن تتراوح النسبة المئوية للخلايا التي تكون إيجابية GFP على نطاق واسع اعتمادا على مدى تحفظك عند تشريح المنطقة الإيجابية ل GFP.

ومع ذلك ، حتى عندما نكون متحفظين للغاية ونقوم بتشريح رقعة الخلايا الموجبة ل GFP فقط ، فإن أعلى نسبة نلاحظها هي من خمسة إلى 10٪ ، فإن كفاءة التعداء المنخفضة هذه مفيدة في تحديد العمليات التي تنتمي إلى الخلية المثقبة بالكهرباء التي تقوم بتحليلها. تساهم خلايا الطلاء بهذه الكثافة العالية في الحصول على ثقافات أكثر صحة. ومع ذلك ، من الصعب تمييز العملية التي تنتمي إلى جسم الخلية في الخلايا السالبة GFP.

بعد هذا الإجراء ، يمكن إجراء تلطيخ مناعي للعديد من العلامات المختلفة من أجل الإجابة على الأسئلة المتعلقة بالتكاثر وتكوين التشابك العصبي وتحديد الكبريتات. أثناء محاولة هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر استخدام الكواشف والأدوات المعقمة لمنع التلوث والعدوى بمجرد إتقانها. يمكن تنفيذ كل جانب من جوانب هذه التقنية في غضون ساعتين إلى ثلاث ساعات إذا تم إجراؤه بشكل صحيح.

هذا كل شيء. شكرا للمشاهدة. حظا سعيدا في تجاربك.