Name: تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الشبكية ماوس إعداد غامق تكييفها شريحة (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-09-12T19:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 38 s
Description: تعلم إعداد شرائح شبكية مظلمة من الفئران لتسجيلات المشبك الكهربائي. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة مسارات الإشارة في الخلايا الشبكية بعد التحفيز الضوئي.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

وأيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة EY17606 غرانت (APS).

1. يستعد أقطاب <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأقطاب تسجيل وغمس إشارة لهم على حد سواء في كلوريد الصوديوم 1M والقيادة 15V بينهما باستخدام شرط 1 هرتز لموجة ثانية 20 ~ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جعل أقطاب تسجيل باستخدام مجتذب micropipette (سوتر الآلات P - 97). للتصحيح ، ماصات استخدام الزجاج البورسليكات مع القطر الخارجي من 1.2 ملم وقطرها الداخلي 0.69 مم (سوتر الآلات ، القط # B120 - 69 - 10). قياس المقاومة من خلال سلسلة غيض من القطب. استنادا إلى حجم الخلايا المستهدفة اختيار القطر تلميح ماصة ؛ للهيئات الخلية ~ 20 ميكرون في القطر استخدام ~ 5 MΩ للهيئات الخلية ~ 5 ميكرون في القطر استخدام MΩ ~ 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد الأرض / أقطاب المرجعية. استخدام حقنة ملء البولي ايثيلين أنابيب قسم صغير (Intramedic ، PE205) مع كلوريد الصوديوم 1 مم يتضمن آجار 3.5 ٪ (سيغما ؛ القط # A7002) في كلوريد الصوديوم 1M. هذا الجسر المقام فوق القطب آغار المرجعية حج / AgCl. </li></ol> 2. إعداد حلول <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل حمام خارجي ، 'وسائل الإعلام التي تحتوي على كربونات (1 L) : 1 زجاجة من أميس' أميس متوسطة (سيغما ؛ القط # A1420) ، 1.9 غرام من NaHCO 3 و 7 مل من البنسلين ، الستربتوميسين (سيغما ؛ القط # P0781) لمنع البكتيريا النمو. ضبط الأسمولية لmOsm 280 ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الحل "، الذي يحتوي على وسائل الاعلام HEPES العازلة الرقم الهيدروجيني (1 L) : 1 زجاجة من أميس' أميس متوسطة ، 0.887 غرام من كلوريد الصوديوم ، 2،38 غرام من HEPES ، 7 مل من البنسلين ، الستربتوميسين. ضبط درجة الحموضة إلى ~ 7.4 1M باستخدام هيدروكسيد الصوديوم و / أو حمض الهيدروكلوريك 1M. ضبط الأسمولية لmOsm 280 ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> البوتاسيوم الأسبارتات حل ماصة (K - ASP) الداخلي (مم) : 125 K - الأسبارتات ، 10 بوكل ، 10 HEPES ، 5 - NMG HEDTA ، 0.5 CaCl 2 ، 1 ATP ملغ ، 0.2 ملغ GTP ؛ يتم ضبط درجة الحموضة في ~ 7.3 مع NMG - OH ، ويتم ضبط الأسمولية لmOsm 280 ~. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آغار مساندة لتحقيق الاستقرار في درجة حرارة منخفضة agarose التبلور تحتوي على شبكية العين (5 ٪ بالوزن) ، 7.5 غرام من آجار (سيغما ؛ القط # A7002) ذاب في 150 مل من DH 2 O. </li></ol> 3. يوم للتجربة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ذوبان الجليد ~ 1.5 مل من محلول الداخلية K - ASP وfluorophore من اختيارك من الثلاجة. تمييع fluorophore إلى تركيز المناسبة ، التي ينبغي أن تحدد تجريبيا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صب سائل الإعلام أميس "التي تحتوي على NaHCO 3 (~ 200 مليلتر) في حاوية تخزين ضوء ضيق المكان ومن ثم الى حمام الماء (30-32 درجة مئوية) ، وتتوازن مع 5 ٪ CO 2 / 95 ٪ O 2 الغاز </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء زجاجة مع مل 110 ~ وسائل الإعلام أميس "التي تحتوي على HEPES ، وضعها على الجليد ، وتتوازن مع 100 ٪ O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> المكان المتبقية أميس "التي تحتوي على وسائل الاعلام NaHCO 3 في خزان ساخنة على رأس قفص فاراداي ، وتتوازن مع 5 ٪ CO 2 / 95 ٪ O غاز 2. ويمكن استخدام Parafilm إلى اعتراض الغاز في الفضاء فوق الحل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد درجة حرارة منخفضة agarose التبلور (3 ٪) وذلك بإضافة 0.75 غرام (سيغما ؛ القط # A0701) إلى 25 مل من وسائل الاعلام أميس 'مع HEPES والحرارة في حل ~ 115 درجة مئوية لصهر agarose. يحرك حتى الحل واضحة من دون فقاعات ، وتخزينها في حمام الماء (~ 42 درجة مئوية). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء ماصة تسجيل مع الحل K - ASP الداخلية والتحقق من طرف المقاومة. </li></ol> 4. تبدأ التجربة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الموت ببطء وإزالة الماوس بسرعة العينين باستخدام مقص منحنية. وينبغي استخدام نظارات الأشعة تحت الحمراء لجميع الإجراءات لمنع تبييض صبغة بصرية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ضع عينيك على قطعة من ورق الترشيح لمنعهم من المتداول ، واستخدام رقيقة شفرة مزدوجة من جانب ، وجعل فتحة في القرنية ، بينما عقد العين مع ملقط. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في أقرب وقت ثقب مقلة العين ، ونقل أنهم العين في صحن مليء أميس وسائل الاعلام ". </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> باستخدام فتحة في القرنية كمدخل ، يتم استخدام مقص لقطع صغيرة بعيدا عن الأجزاء المتبقية من القرنية ، وبعد ذلك يمكن إزالة العدسة والجسم الزجاجي. أن نكون حذرين في الشبكية لا تزال تعلق على فنجان العين ، وتخزين فنجان العين في الظلام بنسبة 32 في وسائل الإعلام أميس 'معايرتها مع 5 ٪ CO 2 / 95 ٪ O 2 درجة مئوية. </li></ol> 5. تشريح <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Hemisect واحدة من eyecups وفصل الشبكية من الظهارة الصبغية الشبكية. إزالة حواف الشبكية للسماح للأنسجة الكذب مسطح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الزجاج الصغيرة ماصة باستور مع لمبة اللاتكس لملء طبق بيتري 35 ملم مع آغار ذاب ، واسحب عبر ملقط من خلال آغار لاختبار مدى اتساقه. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عندما يمكنك أن تبدأ في رؤية آغار يصلب : <ol class="lalpha" style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل الشبكية الى أعلى آغار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام قطعة من Kimwipe الملتوية لامتصاص فائض حل حول الشبكية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مكان 2-3 قطرات من آجار مباشرة على شبكية العين والمكان بسرعة اسطوانة من البلاستيك في الشبكية لتشكيل جدار حوله. ثم أغار بالتنقيط ذاب إضافية أسفل جانبي اسطوانة بلاستيكية في حين تتمحور الشبكية داخل آغار. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل طبق بيتري رس حمام ماء مثلج لتبرد. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ~ بعد 45 ثانية إزالة الأنسجة من الجليد حمام المياه واستخدام المكبس لبثق آغار كتلة من اسطوانة بلاستيكية ، ودفع من الجانب الأبعد من شبكية العين. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام شفرة حلاقة من جانب واحد لقطع صغيرة من كتلة أجار يحتوي على شبكية العين وsuperglue كتلة في مكانه ضد مساندة أغار على القرص العينة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل القرص العينة إلى علبة مشراح تهتز وتصب الثلج الباردة HEPES أميس في درج السماح للكتلة مع submersed الشبكية تماما. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ويمكن خفض الشرائح الشبكية مع سمك ميكرومتر 200 ~ بمعدل النصل الأقصى تهتز وسرعة شفرة قدما مجموعة من النوع الذي يأخذ 4 إلى 5 ثوان لقطع طريق شبكية العين على كل شريحة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام شفرة مشرط رقم 11 لإزالة كل شريحة واحدة قابلة للاستخدام في وقت </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> توضع شرائح جيدة تحتوي على شبكية العين في تسجيل والغرف هي المرجحة إلى أسفل مع شريحة المراسي مع خيوط النايلون عبور لهم. خيوط النايلون باستمرار آغار المحيطة شبكية العين ، وترك الشبكية دون عائق للتسجيلات. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نقل غرفة تسجيل لمرحلة المجهر تستقيم ، إغلاق الستائر وتشغيل مصدر ضوء الأشعة تحت الحمراء لعرض شريحة على كاميرا تعمل بالأشعة تحت الحمراء الحساسة. </li></ol> 6. تسجيل <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وحالما يتم التعرف على شريحة جيدة الشبكية (مع مبصرات سليمة وزاوية القطع المناسبة) تبدأ perfusing الشبكية بمعدل أكبر من 5 مل / دقيقة مع وسائل الاعلام أميس ساخنة "التي يتم تسخينها إلى 35 37 درجة مئوية ، ومعايرتها مع 5 ٪ CO 2 / 95 ٪ O 2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قد تكون بعض الأضرار السطحية تكون واضحة بسبب عملية تشريح. ويمكن إزالة هذه الطبقة رقيقة من الخلايا عادة باستخدام ماصة مع طرف مكسورة ، وامتصاص بلطف بعيدا الهيئات خلية ميتة. هذا وسوف تكشف عادة الخلايا الحية تحتها. التعرف على خلايا الجسم السليمة التي الموقف الموجود في طبقات الفائدة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء micropipette مع الحل الداخلي وتطبيق KAsp الايجابية (الخارج) من خلال الضغط غيض من ماصة ، وانخفاض غيض من ماصة الى غرفة تسجيل وصولا الى مستوى الخلية باستخدام micromanipulator. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحرك غيض ماصة مثل هذه الدمامل أن غشاء الخلية ، وتطبيق لطيف السلبية (الداخل) لضغوط لتقديم ختم مقاومة عالية. لا يمكن أن يتحقق خلية كاملة من خلال تطبيق طريقة الضغط السالب إلى القطب لكسر في الخلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يمكن تحفيز الأنسجة الشبكية باستخدام المصابيح تثير ردود ثم الى النور. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> صورة من الخلية التي تم فيها التسجيل عن طريق إثارة مضان من fluorophore في حل ماصة الداخلية. </li></ol> 7. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig1.jpg" alt="الشكل 1" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1"> الشكل 1 ، وهنا استحضر ضوء إمكانات مظلم مكيفة وأظهرت الخلايا العصبية للشبكية ومضات من الضوء على القوة المتزايدة. <img src="/files/ftp_upload/2107/2107fig2.jpg" alt="الشكل 2" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 2"> الشكل 2. صورة من الإسفار شريحة الشبكية حيث تم ملء الخلايا مع fluorophore ، وسيفر الاصفر. مضان أثار يوضح مورفولوجيا الخلايا من التسجيلات التي أدلى التصحيح.

<ol><li>Weblin, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transmission+along+and+between+rods+in+the+tiger+salamander+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Transmission along and between rods in the tiger salamander retina.</a> J Physiol. 280, 449-470 (1978).</li>
<li>Wu, S. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Synaptic+connections+among+retina+neurons+in+living+slices%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci+Methods%22%5BJournal%5D)">Synaptic connections among retina neurons in living slices.</a> J Neurosci Methods. 20, 139-149 (1987).</li>
<li>Rieke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Temporal+contrast+adaptation+in+salamander+bipolar+cell%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Temporal contrast adaptation in salamander bipolar cell.</a> J Neurosci. 21, 9445-9454 (2001).</li>
<li>Armstrong-Gold, C., &amp, R. ieke, F, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Bandpass+filtering+at+the+rod+to+second-order+cell+synapse+in+salamander+%28Ambystoma+tigrinum%29+retina%5BTitle%5D)+AND+%22J+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Bandpass filtering at the rod to second-order cell synapse in salamander (Ambystoma tigrinum) retina.</a> J Neurosci. 23, 3796-3806 (2003).</li>
<li>Masland, R. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+fundamental+plan+of+the+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Neurosci%22%5BJournal%5D)">The fundamental plan of the retina.</a> Nat Neurosci. 4, 877-886 (2001).</li>
<li>Wassle, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Parallel+processing+in+the+mammalian+retina%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Parallel processing in the mammalian retina.</a> Nat Rev Neurosci. 5, 747-757 (2004).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

وقد بذلت تسجيل شريحة من شبكية العين الفقارية لعقود 1،2 ، وكانت ناجحة جدا في توفير فهم أعمق لكيفية عمل الدوائر الشبكية بترميز ضوء الحادث. مزايا القطع مع مشراح تهتز بدلا من مباشرة مع شفرة الحلاقة هو أن تكبد الشرائح الشبكية أقل ضررا على السطح. ماصة مع شفط فمن السهل أن إزالة هذا الضرر والخلايا المستهدفة صحية فقط تحت السطح التي تحتفظ التواصل فيما بينها في الدائرة الشبكية ، حيث تم التعرف على معظم أنواع الخلايا 5،6 ، وأنه عرض ردود قوية الضوء. وبالتالي يمكن أن التسجي...

<table><tbody><tr><td>جهاز سحب الماصات الدقيقة</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>زجاج بوروسيليكات</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>B120-69-10</td><td></td></tr><tr><td>أنابيب بولي إيثيلين</td><td>Intramedic</td><td>PE205</td><td></td></tr><tr><td>آجار</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7002</td><td></td></tr><tr><td>أجاروز منخفض درجة حرارة التجلط</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A0701</td><td></td></tr><tr><td>وسط Ames&amp;rsquo;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A1420</td><td></td></tr><tr><td>بنسلين-ستريبتومايسين</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P0781</td><td></td></tr></tbody></table>

تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الشبكية ماوس إعداد غامق تكييفها شريحة

Patch Clamp Recordings from Mouse Retinal Neurons in a Dark-adapted Slice Preparation

يبدأ خبرتنا البصرية عندما الصباغ البصرية في الشبكية لدينا مبصرات تمتص فوتونات الضوء والطاقة تبدأ سلسلة من الأحداث داخل الخلية والتي تؤدي إلى إغلاق دوري - النوكليوتيدات بوابات قنوات في غشاء الخلية. التغيير المحتملة الناتجة في الغشاء يؤدي بدوره إلى انخفاض في كمية الافراج العصبي من كل قضيب ومحطات مخروط متشابك. لقياس مدى التغير في ضوء أثار احتمال غشاء مبصرة يؤدي إلى نشاط المصب في شبكية العين ، جعلت العلماء التسجيلات الكهربية من الاستعدادات لشريحة الشبكية 1،2 عقود. في الماضي قطعت هذه الشرائح يدويا بشفرة حلاقة على أنسجة الشبكية التي تعلق على ورقة فلتر ، وفي السنوات الأخيرة تم تطوير طريقة أخرى للتشريح يتم بموجبها جزءا لا يتجزأ من نسيج الشبكية في التبلور انخفاض درجة الحرارة وآغار شرائح في محلول بارد مع تهتز مشراح 3،4. هذا التحضير تنتج شرائح الشبكية مع أقل الأضرار السطحية وقوية جدا للضوء ردود أثار. نحن هنا الوثيقة كيف يمكن القيام بهذا الإجراء تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء لتفادي تبييض صبغة بصرية.

نحن هنا وصف الإجراء لتوليد داكنة تكييفها شرائح من شبكية العين الماوس للتسجيلات الكهربية.

تبدأ تجربتنا البصرية عندما تمتص الصبغة البصرية الموجودة في المستقبلات الضوئية بالشبكية فوتونات من الطاقة الضوئية، مما يؤدي إلى تحفيز سلسلة من...

تبدأ تجربتنا البصرية عندما تمتص الصبغة البصرية في المستقبلات الضوئية الشبكية فوتونات الطاقة الضوئية، مما يؤدي في النهاية إلى إغلاق القنوات المبوبة للنيوكليوتيدات الحلقية في الغشاء الخلوي. ويؤدي ذلك إلى تثبيط إطلاق الناقل العصبي glutamate من كل من العصي والمخاريط. وتستشعر الخلايا الشبكية اللاحقة الـ glutamate المنطلق لدراسة الإشارات اللاحقة.يتم استئصال العينين من فأر تم القتل الرحيم له. يتم عزل S، وتثبيتها في كتلة أغار، ثم تقطيعها باستخدام ميكروتوم اهتزازي. بعد ذلك، توضع شرائح الشبكية تحت المجهر ويتم تحفيزها باستخدام إضاءة LED.يتم إجراء تسجيلات تثبيت الرقعة (patch clamp) لقياس التيارات أو الجهود التشابكية المتولدة. وبشكل عام، يواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة بسبب التعقيدات الإضافية الناجمة عن العمل في الظلام؛ لذا فإن القدرة على تصور العملية بأكملها ستمنحهم إدراكاً حسياً يصعب وصفه بطريقة أخرى.ابدأ هذا الإجراء بطلاء أقطاب أسلاك التسجيل والمرجع التي سيتم استخدامها بطبقة من كلوريد الفضة. اغمس الأقطاب في محلول كلوريد الصوديوم بتركيز 1 molar. ثم باستخدام مصدر طاقة بقوة 15 volt وموجة جيبية بتردد 1 hertz، مرر جهدًا قدره 15 volts بينهما لمدة 20 ثانية تقريبًا.باستخدام جهاز سحب الماصات الدقيقة، قم بتجهيز ماصات الرقعة (patch pipettes) من زجاج السيليكا BO المصقول بالنار، مع اختيار مقاومة طرف الماصة بناءً على حجم الخلايا المستهدفة؛ فبالنسبة لأجسام الخلايا التي يبلغ قطرها حوالي 20 ميكرون، استخدم ماصة PET بمقاومة طرف تتراوح بين 5 إلى 10 mega ohms. أما بالنسبة لأجسام الخلايا التي يقل قطرها عن خمسة ميكرونات، فاستخدم مقاومة طرف تتراوح بين 12 إلى 15 mega ohms.لتحضير أقطاب المرجع الأرضية، استخدم محقنة لملء أنابيب البولي إيثيلين بمحلول agar بتركيز 3.5% مُحضّر في كلوريد الصوديوم بتركيز 1 millimolar. بعد ذلك، قم بتحضير المحاليل التالية وفقاً للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب المرفق: محلول الحمام الخارجي، ومحلول التقطيع، والمحلول الداخلي لماصة Aspartate potassium، وسدادة agar الخلفية.تُحفظ جميع المحاليل عند درجة حرارة 4 °C حتى وقت استخدامها. في يوم التجربة، يُسكب حوالي 1.5 mL من محلول البوتاسيوم أسبارتات الداخلي، ثم يُضاف الـ Fluor المخفف.صب حوالي 50 milliliters من وسط aims الذي يحتوي على بيكربونات الصوديوم في حاوية تخزين محكمة الإغلاق ومعتمة للضوء. قم بتوصيل الأنبوب البلاستيكي بخزان غاز يحتوي على 5% carbon dioxide و95% oxygen لموازنة وسط aims مع الغاز، ثم ضع الحاوية في حمام مائي تتراوح درجة حرارته بين 30 to 32 degrees Celsius. بعد ذلك، املأ زجاجة بـ 110 milliliters من وسط aims الذي يحتوي على he peas وضعه على الثلج.قم بموازنة الوسط عن طريق تمرير غاز oxygen بنسبة 100% في المحلول. ضع ما تبقى من وسط aimes الذي يحتوي على بيكربونات الصوديوم في خزان مسخن فوق قفص فاراداي. لف ورق البارافورم حول الأنابيب وفتحة الزجاجة لحبس الغاز في المساحة الموجودة فوق المحلول والموازنة مع 5% carbon dioxide و 95% oxygen gas.باستخدام أنبوب تشتيت هوائي زجاجي، قم بتحضير agar بنسبة 3% ومنخفض درجة حرارة الهلام عن طريق إضافة 0.75 grams إلى 25 milliliters من وسط aims مع التسخين. يتم تسخين المحلول إلى حوالي 115 درجة Celsius مع التقليب. وعندما يصبح المحلول رائقاً وخالياً من الفقاعات، ضع محلول agar المصهور في حمام مائي بدرجة حرارة 42 درجة Celsius.قم بتجهيز غرفة التسجيل على المجهر المقلوب. مرر جسراً من الآجار بطول خمسة سنتيمتر فوق قطب المرجع الفضي/كلوريد الفضة وثبته في غرفة التسجيل. يمكن قياس مقاومة طرف الماصة عن طريق ملء الماصة بالمحلول الداخلي، ووضعها على حامل الماصة، ثم وضع حامل الماصة في مرحلة رأس المضخم، وخفض الماصة داخل المحلول. وللحفاظ على الصبغة البصرية من أجل التسجيلات الفسيولوجية، يجب تنفيذ جميع الإجراءات تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء باستخدام نظارات الأشعة تحت الحمراء، ولكن سيتم عرض جميع الإجراءات هنا في ضوء الغرفة.بعد القتل الرحيم للفأر، استخدم مقصاً منحنيًا لإزالة العينين بسرعة. ضع العينين على قطعة من ورق الترشيح لمنعهما من التدحرج. بعد ذلك، ثبت إحدى العينين باستخدام ملقط واستخدم شفرة رفيعة مزدوجة الجوانب لإحداث شق في القرنية.بمجرد ثقب مقلة العين، يتم نقل العين إلى طبق بتري بقطر 60 ملليمتر مملوء بوسط aims. وباستخدام الشق الموجود في القرنية كنقطة دخول، تُستخدم مقصات صغيرة لقص الأجزاء المتبقية من القرنية.بعد ذلك، قم بإزالة العدسة والجسم الزجاجي، مع التأكد من بقاء الشبكية متصلة بكأس العين. ضعها في حاوية معتمة مملوءة بوسط aims، المتوازن مع 5% carbon dioxide في 95% oxygen عند 32 degrees celsius.بعد ذلك، قم بقطع نصف القسم العيني. قم بإزالة إحدى كؤوس العين باستخدام شفرة مشرط رقم 10. افصل الشبكية عن الظهارة الصبغية للشبكية.قم بإزالة حواف الشبكية للسماح للنسيج بالاستقرار بشكل مسطح. استخدم ماصة زجاجية صغيرة بكرة مطاطية لملء طبق بتري بقطر 35 مليمتر بآجار ذو درجة حرارة تجمد منخفضة مصهور، ثم مرر الملقط عبر الآجار لاختبار قوامه. وبمجرد أن يبدأ الآجار في التصلب، انقل الشبكية إلى سطح الآجار.بعد ذلك، ودون لمس الشبكية، استخدم قطعة ملتوية من مناديل Kim wipe لامتصاص المحلول الزائد من حولها. ضع قطرتين إلى ثلاث قطرات إضافية من الآجار مباشرة على الشبكية، ثم ضع بسرعة أسطوانة بلاستيكية لتشكيل جدار حولها مع الحفاظ على الشبكية بالقرب من مركز الأسطوانة، ثم أضف المزيد من الآجار المصهور بالتنقيط، وانقل طبق بتري إلى حمام مائي مثلج للتبريد. بعد 30 ثانية، قم بإزالة النسيج واستخدم مكبساً لإخراج كتلة الآجار، مع الدفع من الجانب الأبعد عن الشبكية.استخدم شفرة حلاقة أحادية الجانب لقص قطعة صغيرة من الآجار تحتوي على الشبكية، ثم ثبت القطعة باستخدام الغراء الفائق (super glue) مقابل مسند الآجار الخلفي الموجود على قرص العينة. انقل قرص العينة إلى حامل الميكروتوم الاهتزازي وصب محلول aims heaps المبرد بالثلج في الحامل، مع التأكد من غمر القطعة التي تحتوي على الشبكية بالكامل. قم بقطع شرائح من الشبكية بسمك يبلغ حوالي 200 ميكرون باستخدام أقصى معدل اهتزاز للشفرة، مع ضبط سرعة تقدم الشفرة بحيث يستغرق القطع عبر الشبكية من أربع إلى خمس ثوانٍ لمرة واحدة.استخدم شفرة مشرط رقم 11 لقطع كل شريحة صالحة للاستخدام من الكتلة واحدة تلو الأخرى. ضع الشرائح التي تحتوي على الشبكية في غرف التسجيل وثبتها في مكانها. وباستخدام مثبتات الشرائح، مرر خيوط النايلون عبر مثبت الشريحة.قم بتثبيت الآجار المحيط بالشبكية، مع ترك الشبكية دون عوائق. ولإجراء التسجيلات، انقل غرفة التسجيل إلى منصة المجهر الرأسي.أغلق الستارة وقم بتشغيل مصدر الضوء تحت الأحمر لعرض الشريحة عبر كاميرا حساسة للأشعة تحت الحمراء. حدد تحت المجهر شريحة شبكية ذات مستقبلات ضوئية سليمة وبزاوية قطع مناسبة. قد يظهر بعض الضرر السطحي نتيجة لعملية التقطيع.باستخدام ماصة ذات طرف مكسور، قم بسحب أجسام الخلايا الميتة برفق. ولإزالة هذه الطبقة الرقيقة من الخلايا، وبمجرد ظهور طبقة سليمة من الخلايا الحية، حدد جسم خلية يقع في الطبقات المستهدفة. حرك طرف الماصة بحيث يسبب انبعاجاً في غشاء الخلية، ثم طبق ضغطاً سلبياً أو داخلياً خفيفاً لإنشاء سدادة عالية المقاومة. يمكن تحقيق وضع الخلية الكاملة من خلال تطبيق ضغط سلبي على القطب الكهربائي لاختراق الخلية.بعد ذلك، قم بتحفيز أنسجة الشبكية بالضوء باستخدام صمامات ثنائية باعثة للضوء (LEDs) لاستثارة الاستجابات. في نهاية التسجيل، التقط صورة باستخدام ضوء الإثارة المناسب للمادة الفلورية التي انتقلت إلى الخلية عن طريق الديلزة من المحلول الداخلي للماصة. يظهر هنا جهود الاستثارة الضوئية لعصبون شبكي متكيف مع الظلام تجاه ومضات ضوئية ذات شدة متزايدة.هذا الشكل عبارة عن صورة فلورية مأخوذة من شريحة شبكية حيث تم ملء الخلايا بصبغة Lucifer yellow الفلورية، ويظهر الفلور المستحث شكل الخلايا التي أُجريت منها تسجيلات الرقعة (patch recordings). بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم أفضل لبعض التعقيدات المتعلقة بإجراء تسجيلات تثبيت الرقعة (patch clamp) من شرائح شبكية متكيفة مع الظلام. الهدف من هذا الإجراء هو قياس الاستجابات المستحثة بالضوء تحت إضاءة محكومة.وللقيام بذلك، يتعين علينا أولاً عزل الشبكية، وتضمينها في مادة الأجار (agar)، ثم تحضير شرائح شبكية يمكننا من خلالها إجراء تسجيلات للخلايا المفردة.

patch-clamp-recordings-from-mouse-retinal-neurons-dark-adapted-slice

Research

JoVE Journal

Neuroscience

علم الأعصاب

هذا الفيديو يبين عملية خلية كاملة التسجيلات المشبك الجهد في شريحة الشبكية من السمندل النمر المائية. نبدي استعدادا لشريحة وكذلك كيفية تنفيذ تسجيلات المشبك التصحيح خلال التحفيز البصري لشبكية العين.

مستدعى خلية كاملة تسجيلات الضوء التيارات متشابك مثير في شريحة الشبكية

هذا المقال يقدم وصفا لكيفية تشريح وسجل من إعداد الشبكية معزولة في الماوس. على وجه الخصوص ، ونحن تصف كيفية تسجيل الاستجابات الضوء من السكان خلية عقدية fluorescently المسمى لاحقا ، وتحديد وتحليل مورفولوجيا والخمسين.

لإعداد متفرقة الشبكية إلى سجل الاستجابة الخفيفة وراثيا من إعتبر خلايا الشبكية العقدة

نحن هنا وصف بروتوكول لإعداد آغار جزءا لا يتجزأ من شرائح الشبكية التي هي مناسبة للالكهربية وCA2 التصوير +. هذا الأسلوب يسمح احد لدراسة الشريط من نوع المشابك في شبكية العين باستخدام رقائق مباشرة التصحيح ، المشبك تسجيلات احد المحطات العصبية قبل المشبكي.

التصحيح ، المشبك قياسات السعة والكالسيوم 2 + التصوير في محطات عصب واحد في شرائح الشبكية

ونحن تصف طريقة بسيطة نسبيا من transretinal التسجيلات (ERG) مخطط كهربية الشبكية للحصول على قضيب والمخروط photoresponses من شبكية العين الماوس سليمة. هذا النهج يستفيد من كتلة من انتقال متشابك من المستقبلات الضوئية لعزل ردودهم الخفيفة وتسجيلها باستخدام أقطاب الحقل وضعت في جميع أنحاء شبكية العين المسطحة التي شنت معزولة.

Transretinal تسجيلات ERG من شبكية العين الفأر: ورود Photoresponses المخروط

يوضح هذا الفيديو تقنية مشبك التصحيح للخلية الكاملة للتسجيل الفيزيولوجي الكهربي من شبكية الفأر المسطحة. تستخدم ماصة زجاجية رفيعة مع قطب كهربائي للاقتراب من خلايا الانفجار النجمي (SACs) داخل شبكية العين. بعد تشكيل الختم ، يتم تطبيق الشفط لتمزيق الغشاء وتشكيل تكوين مشبك التصحيح للخلية بأكملها. أخيرا ، يتم قياس تدفق الأيونات عبر المستقبلات المشبكية SAC باستخدام التكوين.

إنشاء مشبك رقعة كامل الخلية للتسجيل الفيزيولوجي الكهربي من شبكية العين المسطحة

يوضح هذا الفيديو تسجيل استجابات ما بعد التشابك المبدأة بالضوء في تحضير شريحة أنسجة شبكية العين المائية المتأثرة بالظلام. يتم وضع شريحة الشبكية في غرفة التسجيل ، ويتم استخدام ماصة التسجيل لإنشاء استمرارية كهربائية مع خلية عقدية شبكية. يتم تطبيق نبضات الضوء لتوليد إمكانات ما بعد التشابك المثيرة في الخلايا العقدية ، والتي يتم تسجيلها بواسطة الماصة.

استجابات ما بعد المشبكي المضطربة بالضوء في الخلايا العصبية لشرائح شبكية الفأر

نحن تصف إعداد شرائح رقيقة من الشبكية المائية نمر السلمندر...

في وقت واحد تسجيلات خلية كاملة من المستقبلات الضوئية والخلايا العصبية الدرجة الثانية في البرمائيات إعداد شريحة الشبكية

يوضح هذا المقال فيديو مجموعة المتابعة، والإجراءات اللازمة لتصحيح أجسام الخلايا وكيفية تنفيذ تسجيلات المشبك الحيوية من خلايا العقدة في جبل لالجامع الماوس للشبكية. هذا الأسلوب يسمح التحقيق في مساهمة الدقيق للمدخلات متشابك مثير والمثبطة، وحجمها النسبي وتوقيت لالتشويك العصبية.

تنفيذ المشبك الحيوي مع المواصلة متشابك والاصطناعية في خلايا الشبكية العقدة ماوس

سنوضح كيفية تحضير شرائح الشبكية من عين الفأر وتسجيل استجابات الضوء في الخلايا العصبية في الشبكية. يتم إجراء الإجراء بأكمله في ظروف مظلمة.

تسجيل الخفيفة أثار-الردود بعد المشبكي في الخلايا العصبية في الظلام تكييفها، الاستعدادات ماوس الشبكية شريحة عن طريق تقنيات المشبك التصحيح

يوضح هذا البروتوكول كيفية تنفيذ خلية كاملة تسجيل المشبك التصحيح على الخلايا العصبية للشبكية من إعداد شقة جبل.

التصحيح المشبك تسجيل من خلايا النجمي عديم الاستطالات في جبل شقة إعداد Deafferentated شبكية العين الفأر

وضعنا إعداد شريحة الأفقي للشبكية العين الكبار الثدييات مع الطائرة من باجتزاء موازية لسطح الشبكية. لم اقتطاع الحقول الجذعية من الخلايا العصبية للشبكية موجهة nonradially، والسماح للدراسة معالجة الإشارات مع تقنيات التصحيح، المشبك والتصوير.

إعداد شرائح أفقية من الكبار شبكية العين الفأر للدراسات الكهربية

تعلم إعداد شرائح شبكية مظلمة من الفئران لتسجيلات المشبك الكهربائي. تُستخدم هذه الطريقة لدراسة مسارات الإشارة في الخلايا الشبكية بعد التحفيز الضوئي.

تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الشبكية ماوس إعداد غامق تكييفها شريحة

استكشف المزيد من الفيديوهات