تسجيلات المشبك التصحيح من الخلايا العصبية في الشبكية ماوس إعداد غامق تكييفها شريحة

تبدأ تجربتنا البصرية عندما تمتص الصبغة البصرية في المستقبلات الضوئية لشبكية العين فوتونات الطاقة الضوئية ، مما يؤدي في النهاية إلى إغلاق القنوات الحلقية ذات البوابات النيوكليوتيدات في غشاء الخلية. هذا يمنع إطلاق الغلوتامات العصبي من كل من القضبان والأقماع. يتم استشعار الغلوتامات المنبعثة بواسطة خلايا الشبكية النهائية لدراسة إشارات المصب.

تتم إزالة العيون من فأر قتل رحيم. يتم عزل S ، وتضمينها في كتلة أجار وتقطيعها باستخدام ميكروتوم اهتزازي. بعد ذلك ، يتم وضع شرائح الشبكية تحت المجهر ويتم تحفيزها بإضاءة LED.

بينما يتم أخذ تسجيلات مشبك التصحيح لقياس التيارات المشبكية أو الإمكانات المتولدة. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الطريقة بسبب التعقيدات الإضافية للعمل في الظلام. لذا فإن القدرة على تصور العملية برمتها ستوفر إحساسا يصعب وصفه.

ابدأ هذا الإجراء بطلاء أقطاب التسجيل والأسلاك المرجعية التي سيتم استخدامها مع طبقة من كلوريد الفضة. اغمس الأقطاب الكهربائية في كلوريد الصوديوم المولي واحد. ثم باستخدام مصدر طاقة 15 فولت مع محرك موجة جيبية واحدة هرتز 15 فولت بينهما لمدة 20 ثانية تقريبا.

باستخدام مجتذب الماصة الصغيرة، قم بإعداد ماصات التصحيح من زجاج السيليكا المصقول بالحريق، واختيار مقاومة طرف الماصة بناء على حجم الخلايا المستهدفة لأجسام الخلايا التي يبلغ قطرها حوالي 20 ميكرون. استخدم أنبوب PET بمقاومة طرف من خمسة إلى 10 ميجا أوم لأجسام الخلايا. بعد حوالي خمسة ميكرون في القطر ، استخدم مقاومة طرف من 12 إلى 15 ميجا أوم.

لتحضير الأقطاب الكهربائية المرجعية الأرضية ، استخدم حقنة لملء أنابيب البولي إيثيلين بمحلول أجار 3.5٪ محضر في كلوريد الصوديوم المليمولي واحد. بعد ذلك ، قم بإعداد الحلول التالية وفقا للتعليمات الواردة في البروتوكول المكتوب المصاحب. محلول تقطيع محلول الحمام الخارجي ، والمحلول الداخلي لماصة أسبارتات البوتاسيوم ، ودعامة أجار.

قم بتخزين جميع المحاليل على أربع درجات مئوية حتى الحاجة إليها. في يوم التجربة ، ثور حوالي 1.5 مل من البوتاسيوم أسبارتات المحلول الداخلي. ثم يضاف الفلور المخفف.

صب حوالي 50 مل من وسائط الأهداف التي تحتوي على بيكربونات الصوديوم في حاوية التخزين الخفيفة الضيقة. قم بتوصيل الأنبوب البلاستيكي بخزان غاز يحتوي على 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ أكسجين لموازنة وسائط الأهداف مع الغاز ، ثم ضع الحاوية في حمام مائي من 30 إلى 32 درجة مئوية. بعد ذلك ، املأ زجاجة ب 110 مل من الأهداف ، متوسطة تحتوي على البازلاء وضعها على الثلج.

مساواة الوسط عن طريق فقاعات المحلول بغاز الأكسجين بنسبة 100٪. ضع وسط الأهداف المتبقي الذي يحتوي على بيكربونات الصوديوم في خزان ساخن فوق قفص فاراداي. لف الشكل حول الأنبوب وأعلى الزجاجة لاحتجاز الغاز في الفراغ فوق المحلول والتوازن مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون و 95٪ غاز الأكسجين.

باستخدام أنبوب تشتت الهواء الزجاجي ، قم بإعداد 3٪ درجة حرارة تبلور منخفضة عن طريق إضافة 0.75 جرام إلى 25 مل من وسط الأهداف مع أكوام الحرارة. المحلول حوالي 115 درجة مئوية أثناء التحريك. عندما يصبح المحلول صافيا بدون فقاعات ، ضع محلول الأجار المذاب في حمام مائي 42 درجة مئوية.

قم بإعداد غرفة التسجيل على المجهر المقلوب. حرك جسر أجار بطول خمسة سنتيمترات فوق القطب المرجعي الفضي وكلوريد الفضة وضعه في غرفة التسجيل. يمكن قياس مقاومة طرف الماصة عن طريق ملء ماصة بمحلول داخلي، ووضعها على حامل الماصة، ووضع حامل الماصة في مرحلة رأس مكبر الصوت، وخفض الماصة في محلول للحفاظ على الصبغة البصرية للتسجيلات الفسيولوجية، يجب تنفيذ جميع الإجراءات تحت ضوء الأشعة تحت الحمراء باستخدام نظارات الأشعة تحت الحمراء، ولكن سيتم عرض جميع الإجراءات هنا في ضوء الغرفة.

بعد القتل الرحيم للماوس ، استخدم مقصا منحنيا لإزالة العينين بسرعة. ضع العينين على قطعة من ورق الترشيح لمنعهما من التدحرج. ثم امسك العين في مكانها باستخدام ملقط واستخدم شفرة رفيعة على الوجهين لعمل شق في القرنية.

بمجرد ثقب مقلة العين. انقل العين إلى طبق بتري 60 ملم مليء بالأهداف المتوسطة. باستخدام الشق الموجود في القرنية كنقطة دخول ، استخدم مقصا صغيرا لقطع الأجزاء المتبقية من القرنية.

ثم قم بإزالة العدسة والخلط الزجاجي ، مع التأكد من بقاء شبكية العين متصلة بكوب العين. ضعه في وعاء خفيف محكم مليء بالأهداف. متوسط متوازن مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون في 95٪ أكسجين عند 32 درجة مئوية.

ثانية التماميس. أحد أكواب العين باستخدام شفرة مشرط رقم 10. افصل الشبكية عن ظهارة الشبكية الصباغية.

قم بإزالة حواف شبكية العين للسماح للأنسجة بالحياة بشكل مسطح. استخدم ماصات معكرونة زجاجية صغيرة مع لمبة لاتكس لملء طبق بتري 35 ملم بأجار ذائب بدرجة حرارة منخفضة التخصيص واسحب الملقط عبر الأجار لاختبار قوامه. بمجرد أن يبدأ الأجار في التصلب ، انقل شبكية العين إلى أعلى أجار.

ثم دون لمس شبكية العين ، استخدم قطعة ملتوية من مناديل كيم لامتصاص المحلول الزائد حولها. ضع قطرتين إلى ثلاث قطرات إضافية من الأجار مباشرة على شبكية العين وضع أسطوانة بلاستيكية بسرعة لتشكيل جدار حولها مع الحفاظ على شبكية العين بالقرب من مركز الأسطوانة بالتنقيط في أجار ذائب إضافي ، انقل طبق بتري إلى حمام ماء مثلج ليبرد. بعد 30 ثانية ، قم بإزالة الأنسجة واستخدم مكبس لبثق كتلة أجار ، وادفع من الجانب الأبعد عن شبكية العين.

استخدم شفرة حلاقة من جانب واحد لقطع كتلة صغيرة من الأجار تحتوي على شبكية العين ولصق الكتلة في مكانها مقابل مسند أجار على قرص العينة. انقل قرص العينة إلى شجرة الميكروتوم الاهتزازية واسكب أكوام الأهداف المثلجة في الشجرة ، مما يسمح بغمر الكتلة مع شبكية العين بالكامل. قطع شرائح الشبكية بسمك حوالي 200 ميكرون باستخدام الحد الأقصى لمعدل اهتزاز الشفرة مع ضبط سرعة الشفرة الأمامية بحيث يستغرق قطع شبكية العين من أربع إلى خمس ثوان. مرة.

استخدم شفرة مشرط رقم 11 لقطع كل شريحة قابلة للاستخدام من الكتلة واحدة تلو الأخرى. ضع الشرائح التي تحتوي على شبكية العين في غرف التسجيل واضغط عليها لأسفل. باستخدام مثبتات الشريحة ، تعبر خيوط النايلون مرساة الشريحة.

اضغط باستمرار على الأجار المحيط بشبكية العين ، مع ترك الشبكية دون عائق. للتسجيلات. انقل غرفة التسجيل إلى مرحلة المجهر المستقيم.

أغلق الستارة وقم بتشغيل مصدر ضوء الأشعة تحت الحمراء لعرض الشريحة على كاميرا حساسة للأشعة تحت الحمراء. تحت المجهر ، حدد شريحة الشبكية مع مستقبلات ضوئية سليمة بزاوية القطع المناسبة. قد يكون بعض التلف السطحي واضحا بسبب عملية التقطيع.

باستخدام ماصة ذات طرف مكسور ، امتصاص أجسام الخلايا الميتة برفق لإزالة هذه الطبقة الرقيقة من الخلايا ، بمجرد الكشف عن طبقة صحية من الخلايا الحية ، حدد جسم الخلية الذي يقع موقعه في الطبقات ذات الاهتمام. حرك طرف الماصة بحيث يغمر غشاء الخلية وقم بالضغط اللطيف أو السلبي أو الداخلي لعمل ختم عالي المقاومة. يمكن تحقيق وضع الخلية بأكملها عن طريق تطبيق ضغط سلبي على القطب الكهربائي لاقتحام الخلية.

بعد ذلك ، قم بتحفيز أنسجة الشبكية بالضوء باستخدام مصابيح LED لإثارة الاستجابات. في نهاية التسجيل، التقط صورة باستخدام ضوء الإثارة المناسب للفلور الذي تم تحويله إلى الخلية من المحلول الداخلي للماصة. هنا ، يتم عرض إمكانات الضوء العصبية الشبكية المتكيفة المظلمة مع ومضات من الضوء ذات القوة المتزايدة.

هذا الشكل عبارة عن صورة مضان مأخوذة من شريحة شبكية العين حيث تم ملء الخلايا بفلور لوسيفر الأصفر الذي يظهر مورفولوجيا الخلايا التي تم إجراء تسجيلات التصحيح منها. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم أفضل لبعض تعقيدات عمل تسجيلات مشبك التصحيح من شرائح الشبكية الداكنة المكيفة. الهدف من هذا الإجراء هو قياس الاستجابات المستحثة بالضوء تحت الإضاءة الخاضعة للرقابة.

للقيام بذلك ، علينا أولا عزل شبكية العين ، وتضمينها في المثقاب ، ثم إعداد شرائح الشبكية التي يمكننا من خلالها إجراء تسجيلات خلية واحدة.