تصور الأعصاب القطاعي اليرقات في 3 ^{الثالثة} طور مرحلي ذبابة الفاكهة التحضيرات اليرقات

يمكن دراسة النقل المحوري من خلال تصوير الأعصاب القطعية اليرقية. في طور instar الثالث لذبابة drosophila. يتم أولاً تشريح اليرقة للكشف عن الجهاز العصبي المركزي (CNS) دون إتلاف الفصوص البصرية، والعقدة البطنية، والأعصاب القطعية.

تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تثبيت الحمم في الفورمالدهيد قبل التحضين مع الجسم المضاد الأولي طوال الليل والجسم المضاد الثانوي لمدة ساعة واحدة في الظلام. بعد ذلك يتم تثبيت الحمم على شريحة زجاجية وفحص عيوب النقل المحوري. ويمكن فحص تموضع البروتين وتوزيع البروتين من خلال مجهر الفلورسنت المناعي.

على الرغم من أن هذه الطريقة يمكن أن توفر رؤية متعمقة حول النقل المحوري، إلا أنه يمكن تطبيقها أيضاً على أنظمة أخرى مثل مورفولوجيا المشابك العصبية والعضلات. وبشكل عام، سيواجه الأشخاص المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة في البداية لأن إجراء هذا التشريح المسموح به يكون صعباً، خاصة فيما يتعلق بالحفاظ على الأعصاب القطعية للدماغ والعضلات سليمة. لبدء هذا الإجراء، قم بتحضير محلول مثبت منظم للتشريح بتركيز 1x، ومحلول PBT بتركيز 1x، ومحلول BSA بتركيز 5%.

كما هو مفصل في الجدول المعروض قبل عملية التشريح، قم بتجهيز زوج نظيف من ملاقط رقم خمسة، وزوج نظيف من مقصات التشريح ذات الشفرة المستقيمة ودبابيس لبدء التشريح، واستخدم ملعقة دقيقة لجمع يرقات instar الثالثة ذات نمط جيني محدد ووضعها في طبق بتري. ثم اغسل اليرقات عن طريق شطفها في طبق بتري مملوء بالماء منزوع الأيونات للتخلص من جميع بقايا الطعام.

بعد ذلك، ضع اليرقة على طبق حراسة S بحيث يكون الجانب الظهري للأعلى. قم بتثبيت اليرقة بدبابيس عند طرفيها الأمامي والخلفي. ضع قطرة من محلول التفكيك لمرة واحدة على اليرقة المثبتة باستخدام مقص دقيق.

اقرص الحمم على الخط الناصفي الظهري بالقرب من الطرف الخلفي. وباستخدام المقص، قص كيوتيكل الحمم من الطرف الخلفي وصولاً إلى الطرف الأمامي. ضع قطرة من محلول التقطيع المنظم (dissection buffer) بتركيز 1x على الحمم المُشرحة.

باستخدام دبوس، ارفع حافة جانبية واحدة من القشيرة بالقرب من منتصف اليرقة وثبت القشيرة باستخدام دبوس آخر. يتم استخدام دبوسين على كل جانب جانبي كما هو موضح في المخطط. الآن، قم بإزالة الأمعاء والأجسام الدهنية والقصبيات (traia) بعناية، بحيث لا يتبقى سوى الدماغ مع الفصين البصريين والعقد البطنية.

بعد تثبيت الأعصاب القطعية، يتم إجراء التثبيت التالي وتلوين الأجسام المضادة بينما اليرقات مثبتة في طبق الحماية. تُحضن اليرقات المشرحة في 50 µL من المثبت لمدة 30 دقيقة. بعد التثبيت، وبمعدل استبدال المثبت كل 15 دقيقة، تُغسل اليرقات في PBT بتركيز 1x لمدة 30 دقيقة.

عند استبدال المحلول المنظم كل 10 دقائق، من المهم ملاحظة وجوب غمر اليرقات في المحلول المنظم باستمرار. قم بتحضير محلول الجسم المضاد الأولي عن طريق تخفيفه للوصول إلى التركيز المناسب في محلول 5%BSA. تختلف التركيزات المثلى باختلاف الأجسام المضادة.

قم بإنشاء غرفة رطبة عن طريق تبطين طبق بلاستيكي بمناديل Kim.Wipe المبللة بالماء. استبدل المناديل كل مرة PBT.

اشطف بالحلول المُحضرة من الأجسام المضادة الأولية، ثم قم بالتحضين في غرفة رطبة عند درجة حرارة 4 °C طوال الليل حتى اليوم التالي. اشطف اليرقات المُشرحة في محلول PBT بتركيز 1× لمدة 30 دقيقة، مع استبدال المحلول المنظم كل 10 دقائق. قم بتحضير الأجسام المضادة الثانوية عن طريق تخفيفها للوصول إلى التركيز المناسب في محلول 5% BSA.

ثم قم بتغطية الغرفة الرطبة بورق القصدير لأن بعض الأجسام المضادة الثانوية حساسة للضوء. حضن اليرقات مع محلول الجسم المضاد الثانوي عند 25 درجة مئوية لمدة ساعة واحدة. وعندما تنتهي عملية التحضين مع الجسم المضاد الثانوي، اغسل اليرقات بمحلول PBT لمرة واحدة لمدة 30 دقيقة مع استبدال المنظم كل 10 دقائق، ثم انتقل إلى تثبيت ومعاينة اليرقات المشرحة قبل وضع اليرقة على الشريحة.

قم بتجهيز الشريحة عن طريق وضع خطين عموديين من طلاء الأظافر في المنتصف مع ترك مسافة كافية لوضع غطاء الشريحة كما هو موضح في الرسم التخطيطي. اترك طلاء الأظافر ليجف تماماً. ضع قطرة من محلول التثبيت في المساحة الموجودة بين خطوط طلاء الأظافر العمودية على الشريحة كما هو موضح في هذه الصورة.

الشريحة الآن جاهزة للتثبيت. استعد اليرقات بعد مرور الوقت المحدد لآخر عملية PBT. اشطفها وأزل الدبابيس الجانبية من اليرقة بلطف.

احرص على عدم تمزيق القشيرة بعناية. قم بإزالة الدبوسين المتبقيين، ثم التقط اليرقة باستخدام الملقط وضعها على الشريحة المُجهزة. تأكد من أن اليرقة ليست مقلوبة وأنها موجهة من الناحية البطنية.

ضع غطاء الشريحة بلطف بحيث يكون الجانب العلوي للأعلى، ثم أحكم غلق الحواف باستخدام طلاء الأظافر كما هو موضح هنا. أصبحت اليرقات الآن جاهزة للفحص تحت المجهر الفلوري. هذه الصورة التمثيلية ليرقة من النوع البري مصبوغة بأجسام مضادة ضد بروتين الحويصلات المشبكية، cystine string protein.

تظهر الأعصاب القطعية في ذبابة lava مصبوغة بشكل متجانس. هنا، تم صبغ طفرة بروتين حركي في lava باستخدام أجسام مضادة ضد CSP. وتظهر الأعصاب القطعية تراكمات هائلة تصطبغ بشكل ساطع لـ CSP.

أثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على الأعصاب القطعية المتصلة بالدماغ وإبقاء العضلات سليمة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية التشريح. قم بتثبيت صبغة مناعية ثالثة وابدأ في فحص الأعصاب القطعية لليرقات لدراسة النقل المحوري باستخدام مجهر فلوري.