الاستقراء والتقييم من فئة التوحد التبديل في تنقية خلايا الفئران B

خلال الاستجابة المناعية الخلطية، تتكاثر الخلايا البائية التي تم تنشيطها بواسطة المستضد وتفرز الأجسام المضادة مع تقدم الاستجابة. ويتم استبدال النمط الإسوي الافتراضي للأجسام المضادة IgM بأنماط IgG أو IgA أو IgE الأكثر تنوعاً لتقييم التكاثر وتبديل الفئة. يتم عزل الخلايا البائية الطحالية في المختبر من فأر تجريبي باستخدام الفصل الخلوي المغناطيسي.

تُصبغ الخلايا بالصبغة الفلورية CFSE لمراقبة التكاثر، والذي يتم تحفيزه بالمعالجة بـ L-P-S البكتيرية. كما يؤدي تحفيز L-P-S أيضاً إلى تبديل الفئة إلى النمط IgG3، وهو ما يمكن مراقبته عبر قياس التدفق الخلوي جنباً إلى جنب مع التكاثر. سأعرض لكم اليوم تقنية لعزل وتنشيط خلايا B طحالية نقية. يمكن استخدام هذه التقنية لدراسة إعادة تركيب تبديل الفئة والتكاثر في المختبر (in vitro)، كما يمكن استخدامها للإجابة على أسئلة رئيسية في مجال مناعة خلايا B، بما في ذلك وظيفة وتنظيم إنزيم activation induced citing in deaminase.

ابدأ بنقع فأر تم القتل الرحيم له في ethanol بتركيز 70%. يجب أن يتراوح عمر الفأر بين 8 إلى 12 أسبوعاً لضمان النضج الكامل للجهاز المناعي. استخدم مقصاً معقماً لإجراء شق عبر الجلد والعضلات في المنطقة تحت الضلعية اليسرى من البطن. استخدم المقص أو الملاقط لإزالة الطحال من الأنسجة المجاورة.

بعد ذلك، قم بتقطيعه إلى ثلاث قطع كبيرة في محلول PBS. ثم باستخدام الطرف المطاطي لمكبس حقنة سعة 1 مل، قم بهرس الطحال برفق عبر مصفاة خلايا بمسامية 70 micron في محلول PBS. تأكد من استخدام حركة دفع بدلاً من حركة الطحن.

بما أن عملية الطحن قد تؤدي إلى تمزق الخلايا المتكاثرة الكبيرة، يتم تدوير الخلايا بسرعة لا تتجاوز 350 G لمدة خمس دقائق. ثم يتم إعادة تعليق الراسب في PBS.

قم بعدّ الخلايا المعاد تعليقها باستخدام مقياس كرات الدم (hemo cytometer) في أنبوب بوليسترين معقم سعة خمسة مللتر. حضّر معلقاً بتركيز 1 × 10⁸ خلية لكل مللتر في محلول PBS مع مصل جرذ طبيعي بنسبة 5%. يمكن إضافة ما مجموعه مللترين كحد أقصى إلى كل أنبوب.

بعد ذلك، أضف 50 µL من مزيج إثراء الخلايا البائية للفئران (Mouse B-cell enrichment cocktail) الخاص بالانتخاب السلبي (EP negative selection) لكل 1 mL من الخلايا. ثم أغلق الأنابيب وضعها في الثلاجة لمدة 15 دقيقة.

أضف 100 µL من كوكتيل اختيار البيوتين EP لكل ملليلتر من الخلايا. أغلق الأنابيب وضعها في الثلاجة لمدة 15 دقيقة، وبعد فترة الحضن مع كوكتيل اختيار البيوتين، امزج الجسيمات النانوية المغناطيسية EP وأضف 100 µL لكل ملليلتر من الخلايا. استخدم الماصة لخلط المزيج، ثم أغلق الأنابيب وضعها في الثلاجة لمدة خمس دقائق.

أكمل حجم المحلول حتى 2.5 milliliters باستخدام PBS وضعه في مغناطيس cept. وبعد خمس دقائق، اقلب المغناطيس في الأنبوب واسكب المحتوى بسرعة في أنبوب بوليسترين جديد. لا تُرُج الأنبوب لأن الخلايا التي تم اختيارها سلبياً ستكون مرتبطة مغناطيسياً بجدران الأنبوب. ولزيادة نقاء معلق الخلايا بشكل أكبر، ضع أنبوب الخلايا الجديد في المغناطيس لمدة خمس دقائق، ثم اسكبه مرة أخرى في أنبوب جديد.

قد تؤدي هذه الخطوة إلى تقليل الاسترداد الإجمالي للخلايا. ويمكن تقييم نقاء الخلايا البائية عن طريق تحليل قياس التدفق الخلوي لعلامات سطح الخلايا البائية. بعد عملية الإثراء، يجب أن تكون نسبة الخلايا الموجبة لـ B two 20 أكبر من 95%.

أعد تعليق الخلايا المعزولة في محلول PBS دافئ مضاف إليه 0.1%BSA بتركيز نهائي يبلغ مليون خلية لكل مليلتر من محلول مخزون بتركيز خمس ملي مولار من صبغة CFSE المخففة في ثنائي ميثيل سلفوكسيد معقم. أضف 2 µL لكل 1 mL من الخلايا في الأنبوب. تُستخدم صبغة CFSE لمراقبة انقسام الخلايا المحفزة.

عملية حاسمة لتبديل النمط الإسوي. يعد التركيز النهائي 10 micromolar هو الأمثل لصبغ الخلايا البائية الأولية. تُحضن عند 37 degrees Celsius لمدة 10 دقائق في الظلام.

يرجى ملاحظة أن صبغة CFSE حساسة للضوء ويجب حفظها في الظلام قدر الإمكان. بعد انتهاء فترة الحضن، قم بإيقاف تفاعل الصبغة عن طريق إضافة حجم مساوٍ من مصل عجول البقر إلى الخلايا ثم حضنها على الثلج. ولغسل الخلايا لمدة خمس دقائق، املأ الأنابيب بالوسط الزرعي بحيث يتم إضافة حجم من الوسط يعادل خمسة أضعاف حجم الخلايا على الأقل لمعادلة لزوجة مصل عجول البقر ولتمكين الخلايا من تكوين راسب، ثم قم بالطرد المركزي عند 350 G. اغسل الخلايا مرتين إضافيتين في الوسط الزرعي، وبذلك تصبح الخلايا جاهزة للتحفيز.

قم بتحضير وسط استنبات الخلايا البائية (B-cell) في المختبر عن طريق تزويد RPMI 1640 بـ 10% من مصل الجنين البقري و 50 micromolar من Beto me capita ethanol. بعد ذلك، قم بتحضير وسط التحفيز بإضافة LPS بتركيز نهائي قدره 50 micrograms per milliliter. وزع 125 microliters من وسط التحفيز في كل بئر من أطباق استنبات الأنسجة ذات القاع المسطح والمكونة من 96 بئراً.

قم بتحضير خلايا B المصبوغة بـ CFS E في وسط استزراع خالٍ من LPS بتركيز نهائي قدره 3.2 times 10 to the six cells per milliliter. أضف 125 µL من معلق الخلايا إلى الآبار التي تحتوي على وسط التحفيز، ثم اخلطها عن طريق السحب والضخ بلطف بالماصة. يحتوي كل بئر الآن على 400,000 خلية في تركيز نهائي من LPS قدره 25 µg/mL.

يوفر هذا المستويات المثلى من تكاثر الخلايا وتبديل الفئة. وبالرغم من إمكانية إجراء تعديلات على هذه القيم حسب الرغبة، يتم تحضين الخلايا عند 37 °C و5% carbon dioxide لمدة تتراوح من 72 إلى 96 ساعة. وبعد مرور 48 ساعة، ستظهر تجمعات من خلايا B التكاثرية الكبيرة بوضوح تحت المجهر لفحص تبديل الفئة.

أخرج الخلايا من الحاضنة واغسلها مرتين في 1 ml من محلول التلوين المنظم لمنع التصاق الأجسام المضادة غير النوعي. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي عند 350 G. ثم أعد تعليق الخلايا في 100 µl من محلول التلوين المنظم مع 5% من مصل الفأر الطبيعي و 1 µg من FC block لكل مليون خلية، ثم حضنها لمدة 15 دقيقة على الثلج دون غسيل. أضف جسماً مضاداً لـ IgG الثلاثي لـ US موسوم بفلورسنت بتركيز 1 µg لكل مليون خلية، وحضنها لمدة 30 دقيقة على الثلج، ثم اغسل الخلايا مرتين وأعد تعليقها في 200 إلى 300 µl من محلول التلوين المنظم.

الخلايا الآن جاهزة للتقييم بواسطة قياس التدفق الخلوي. يتم تحفيز CFSE بشكل مثالي عند 492 nanometers بواسطة ليزر أيونات الأرجون وينبعث عند 517 nanometers. يعتمد طيف التحفيز والانبعاث للأجسام المضادة IgG three على صبغة الفلورسنت المقترنة بها.

بعد الإثراء المغناطيسي، يجب أن يظهر معلق الخلايا كجمهرة متجانسة من خلايا دائرية صغيرة لا يمكن تمييزها عن بعضها البعض. وبعد 48 إلى 72 ساعة من التحفيز، ستظهر تجمعات معزولة من الخلايا المتكاثرة والمتضخمة بشكل واضح. وسيظهر جزء كبير من الخلايا غير المتكاثرة بحجم صغير ومظهر حبيبي أثناء خضوعها لعملية الموت الخلوي المبرمج (apoptosis).

يمكن عادةً الكشف عن CSR عند أعلى مستوياتها في الفترة ما بين 72 و 96 ساعة بعد التحفيز، وذلك قبل أن تبدأ معظم الخلايا في الموت. في هذه المرحلة، يجب أن تكون الخلايا قد خضعت لعدة انقسامات خلوية مع ظهور الخلايا التي حدث لها التبديل في مجموعة الخلايا الوليدة اللاحقة. باتباع هذه البروتوكولات، يمكن استخدام تقنيات أخرى مثل rna, AI mediated gene knockdown لدراسة تأثير أي جين على وظيفة ID وعملية إعادة تركيب تبديل الفئة.