التصور الجهاز العصبي الجنينية في جبل لالجامع ذبابة الفاكهة الأجنة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحضير أجنة oph و melanogaster للتصوير الكامل للجهاز العصبي. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق جمع الأجنة من سلالة الذباب المستهدفة. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في إزالة الغشاء الكوريومي باستخدام المبيض.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في استخدام الهبتان والميثانول لإزالة غشاء الـ vilin. والخطوة النهائية من الإجراء هي تطبيق الأجسام المضادة على الأجنة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح بنية الجهاز العصبي لجنين drosophila من خلال مجهر التألق المناعي.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال العلوم العصبية، مثل الدور الذي يمكن أن تلعبه الطفرات في الجهاز العصبي النامي. وبشكل عام، قد يواجه المبتدئون في هذه الطريقة صعوبة لأنهم قد يتسببون عن غير قصد في خروج الأجنة من القارورة. ابدأ هذا البروتوكول بتجهيز الكواشف المطلوبة، بما في ذلك P-E-M-F-A، والمحلول المنظم PBC 5%BSA مع 0.01% sodium azide saline solution ومثبت الفورمالديهايد.

قم بتجهيز قفص لسلالة Drosophila المستهدفة عن طريق تخدير الذباب باستخدام ثاني أكسيد الكربون، ثم نقل 100 ذبابة على الأقل إلى زجاجة بلاستيكية تحتوي على محول بداخلها طبق تغذية من أغار عصير التفاح. ضع قفص الذباب في الظلام في درجة حرارة الغرفة لمدة 72 ساعة. استبدل أطباق تغذية أغار عصير التفاح كل ثماني إلى 12 ساعة لضمان تأقلم الذباب مع القفص وعدم احتجاز البويضات من أجل التجربة.

بعد فترة التأقلم التي تستمر لمدة 72 hour، اجمع الأجنّة بعد مرور 12 hours من آخر تغيير لطبق تغذية agar عصير التفاح. قم بإزالة طبق تغذية agar عصير التفاح من قفص وضع البيض واستبدله باستخدام محلول saline. اشطف طبق تغذية agar عصير التفاح.

اجمع الأجنة في منخل دقيق. استخدم فرشاة رسم نظيفة لإزاحة أي أجنة تظل عالقة بالصفيحة. اشطف الأجنة الموجودة في المنخل بمحلول ملحي لإزالة أي فائض من الخميرة، ثم استخدم ملعقة مسطحة لالتقاط الأجنة برفق ووضعها في قارورة زجاجية صغيرة.

أضف حوالي 1 mL من المحلول الملحي. ثم أغلق القارورة بإحكام واحضنها لمدة خمس دقائق لغسل الأجنة. وذلك عقب عملية جمع الأجنة.

قم بتحضير محلول التثبيت بالهيبتان عن طريق خلط 50% heptane و 50% مثبّت. سيتكون المحلول من طبقتين، حيث يكون الهيبتان في الأعلى والمثبّت في الأسفل. بعد مرور خمس دقائق، استخدم ماصة باستا لإزالة المحلول الملحي الزائد من القارورة الزجاجية التي تحتوي على الأجنة.

اغسل الأجنة بالماء منزوع الأيونات عن طريق إضافة حوالي 1 milliliter من الماء منزوع الأيونات إلى القارورة الزجاجية التي تحتوي على الأجنة. اترك الأجنة لمدة دقيقة واحدة قبل إزالة الماء وإضافة محلول مبيض بتركيز 50%. رج القارورة يدوياً لبضع مرات، ثم حضنها لمدة ثلاث دقائق من أجل تغطية الأجنة.

ستغوص الأجنة المعالجة إلى قاع القارورة، بينما ستطفو بقايا الأغشية الكورونية (CORs) الجنينية. قم بإزالة المبيّض وبقايا الأغشية الكورونية بعد فترة حضانة مدتها ثلاث دقائق.

بعد عملية التزيين، اشطف الأجنّة جيداً بالماء منزوع الأيونات عن طريق إضافة حوالي 1 mL من الماء منزوع الأيونات إلى القارورة الزجاجية التي تحتوي على الأجنّة. اترك الأجنّة لمدة دقيقة واحدة قبل إزالة الماء؛ ستطفو بقايا CORs ويجب إزالتها. أضف محلول تثبيت الهيبتان إلى الأجنّة واحضنها لمدة 30 دقيقة مع الرج اللطيف لتثبيتها، وذلك بعد انتهاء عملية التثبيت.

استخدم ماصة باستير لإزالة المثبت، وهو الطبقة السفلية، مع ترك الهبتان في الأنبوب. بعد ذلك، أضف الميثانول مرة أخرى إلى قاع الأنبوب بدلاً من المثبت، وأغلق الأنبوب ورجّه بقوة يدوياً لإزالة الغشاء المحي. بعد هذه الخطوة، ستغوص الأجنة في قاع الأنبوب.

باستخدام ماصة باستور، قم بإزالة الميثانول والبيوض من القارورة مع ترك الأجنة منزوعة الأيونات. بعد ذلك، اغسل الأجنة خمس مرات بالميثانول، مع إزالة الميثانول باستخدام ماصة باستور بين كل عملية غسيل. وفي كل غسلة، قم بحضن الأجنة لمدة خمس دقائق.

ضع الأجنة في مزيج من محلول PBT بنسبة 50% والميثانول بنسبة 50% لمدة خمس دقائق لإعادة ترطيبها. ثم استكمل عملية إعادة الترطيب بنقلها إلى محلول PBT بنسبة 100% لمدة خمس دقائق. بعد ذلك، قم بحجب الأجنة عن طريق تحضينها في محلول BSA بنسبة 5% مع أزيد الصوديوم بنسبة 0.01% لمدة ساعة واحدة عند درجة حرارة 4 °C.

بعد ذلك، قم بتحضير الجسم المضاد الأولي لصبغ الأجنة عن طريق تخفيفه للوصول إلى التركيز المناسب باستخدام محلول 5%BSA مع 0.01%Sodium azide. الأجسام المضادة المستخدمة هنا موجهة ضد vesicular cysteine string protein والجسم المضاد anti HRP. حيث يتعرف Anti HRP على شق كربوهيدراتي محدد عصبيًا يوجد في البروتينات السكرية السطحية، مما يؤدي إلى وسم جميع العصبونات.

يتم تحضين الأجنة طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C في محلول الجسم المضاد الأولي. تُغسل الأجنة 10 مرات باستخدام PBT على مدار ساعة واحدة. من خلال إضافة حوالي 1 mL من PBT إلى القارورة الزجاجية التي تحتوي على الأجنة، تُترك الأجنة لمدة ست دقائق قبل إزالة PBT.

كرر هذه العملية من تطبيق PBT، والتحضين، وإزالة PBT لـ 10 مرات. قم بتحضير محلول الجسم المضاد الثانوي في الظلام لأنه حساس للضوء عن طريق التخفيف إلى التركيز المناسب. نستخدم الأجسام المضادة الثانوية من نوع Alexa بتركيز 1 إلى 200.

يتم تحضين الأجنة لمدة ساعتين عند درجة حرارة 4 °C في محلول الجسم المضاد الثانوي. تُلف القارورة الزجاجية التي تحتوي على الأجنة ومحلول الجسم المضاد الثانوي بورق ألومنيوم لتجنب التعرض للضوء. تُغسل الأجنة 10 مرات باستخدام PBT على مدار ساعة واحدة.

أضف وسط التثبيت Vector Shield إلى الأجنة واتركها تحضن طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C للتثبيت. استخدم ماصة باستيل لسحب الأجنة مع جزء من وسط التثبيت، ثم ضع الأجنة والوسط على شريحة زجاجية.

ضع غطاءً زجاجياً فوق الأجنة وقم بإحكام إغلاقه باستخدام طلاء الأظافر. قم بفحص الأجنة باستخدام مجهر فلوري هنا. يظهر الجهاز العصبي المركزي الجنيني في المرحلة 16 إلى 17.

يظهر بروتين سلسلة السيستين باللون الأحمر، وتظهر عصبونات HRP باللون الأخضر. لاحظ الصبغ المتميز للموصل في هذه الصورة التمثيلية.

يظهر الجهاز العصبي المحيطي (PNS) الجنيني في المرحلة 16 إلى 17. ومرة أخرى، يظهر بروتين cystine string باللون الأحمر، بينما تظهر العصبونات باللون الأخضر. لاحظ الأنماط المتكررة للعصبونات المحيطية.

عند محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم توخي الحذر مع الأجنة لتجنب إخراجها من القارورة عن طريق الخطأ. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحضير أجنة oph fla للتصور الكامل للجهاز العصبي.