جيل من الحمض النووي الريبي / الحمض النووي DNA في الجينوم الهجائن التي تحول باستخدام الحمض النووي الريبي التي تحتوي على [أليغنوكليوتيد]

يتمثل الهدف العام للتجربة التالية في توليد هجائن R-N-A-D-N-A على المستوى الكروموسومي في خلايا خميرة حية عن طريق تحويل خلايا الخميرة باستخدام قليلات نيوكليوتيد (oligos) تحتوي على RNA. ويتحقق ذلك عن طريق إدخال شريط مفرد من الـ RNA الذي يحتوي على قليلة نيوكليوتيد إلى خلايا خميرة في طور الانقسام. ستقوم قليلة النيوكليوتيد بعد ذلك بالارتباط بالمنطقة المكملة لجين علامة طافر يقع على كروموسوم الخميرة لتكوين هجين R-N-A-D-N-A، وكخطوة ثانية، يتم زرع الخلايا التي تم تحويلها بواسطة قليلة النيوكليوتيد المحتوية على RNA في أوساط انتقائية.

يسمح ذلك بنمو الخلايا التي يعمل فيها جزء الـ RNA من الأوليغو كقالب لتصحيح الجين الواسم الطافر. بعد ذلك، يتم إحصاء مستعمرات الخميرة النامية على الأوساط الانتقائية لتحديد تردد تصحيح الجين بواسطة الأوليغو المحتوي على RNA، وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها انتقال المعلومات الوراثية من مسار الـ RNA في الأوليغو إلى الجين الواسم الطافر في جينوم الخميرة. ويتضح ذلك من خلال تحليل الهضم بالإنزيمات القاطعة، وتحليل التسلسل، ومقايسة القابلية للقلوية.

مرحباً، أنا مؤسس HIN، مختبر الدكتورة Francesca في كلية الأحياء بمعهد جورجيا للتكنولوجيا. سنعرض لكم اليوم إجراءً لتوليد هجائن R-N-A-D-N-A على المستوى الكروموسومي في خلايا الخميرة الحية. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة كيفية تحمل الخلايا لوجود RNA مدمج في DNA الجينومي، ولتحديد العوامل التي تؤثر على استقرار هجين R-N-A-D-N-A في الجسم الحي (in vivo).

لنبدأ الآن. قبل البدء في هذا الإجراء، امسح جميع المواد التي ستُستخدم في التجربة، بما في ذلك أنابيب الأوليغو، والماصات، وحوامل جهاز الفورتكس، ومنطقة التجربة، والقفازات التي يرتديها الباحث، باستخدام محلول إزالة تلوث الـ RNAs. ولإزالة أي تلوث محتمل بالـ RNAs، استخدم ماءً خالياً من الـ RNAs، وكواشف كيميائية، وأنابيب، ورؤوس ماصات خالية من الـ RNAs طوال فترة الإجراء.

الحصول على قليلة نيوكليوتيد (oligo) تحتوي على RNA لنقل المعلومات الوراثية إلى DNA الجينومي لخلايا الخميرة. تحتوي سلالة الخميرة المستخدمة هنا على جين trip five طافر مع حذف لقاعدتين وطفرة واحدة غير منطقية (nonsense mutation). تُعد سلالة الخميرة هذه طافرة ضامرة للتريبتوفان ولا تشكل مستعمرات في الأوساط الخالية من التريبتوفان.

إن الأوليغو المحتوي على RNA هو 65 MER مع إدراج DNA مكون من قاعدتين مصمم لتصحيح الطفرة الحذفية. بالإضافة إلى ذلك، يحتوي الأوليغو على ريبونوكليوتيد واحد لتصحيح الطفرة غير المعبرة (nonsense mutation) للأليل trip five. بمجرد الحصول عليه، قم بتحضير الأوليغو المحتوي على RNA في محلول مخزون بتركيز 250 micromolar كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. قبل 16 ساعة من عملية التحول باستخدام الأوليغو المحتوي على RNA، قم بالتلقيح.

أضف خمسة مليليترات من وسط YPD السائل (وسط الديكستروز والببتون والخميرة الغني) إلى خلايا خميرة طافرة من سلالة trip five، ثم قم بتنمية الخلايا عند درجة حرارة 30 درجة مئوية طوال الليل. وبعد الحضانة الليلية، انقل 1.5 مليليتر من المزرعة الليلية إلى 50 مليليتر من وسط YPD السائل. قم بحضانة الخلايا في هزاز عند درجة حرارة 30 درجة مئوية وبسرعة 225 دورة في الدقيقة لمدة أربع ساعات مباشرة قبل عملية التحول.

ضع قليلات النوكليوتيد (oligos) التي تحتوي على RNA وقليلات النوكليوتيد المقابلة التي تحتوي على DNA فقط على الثلج. تُستخدم قليلات النوكليوتيد التي تحتوي على DNA فقط كضابط موجب. خفف قليلات النوكليوتيد لتصل إلى تركيز 50 micromolar باستخدام ماء خالٍ من الـ RNA في أنابيب خالية من الـ RNA.

قم بتحضير 70 µL من كل قليل نيوكليوتيد (oligo) لتوفير عينة كافية لثلاث عمليات تحول بمقدار 1 mol مع بعض الزيادة، ثم قم بمسخ القليل نيوكليوتيدات التي تحتوي على RNA وتلك التي تحتوي على DNA فقط على وحدة تسخين حرارية عند 100 °C لمدة دقيقتين للتخلص من البنى الثانوية للقليل نيوكليوتيدات مباشرة بعد عملية المسخ. ضع الأنابيب على الثلج، وأبقِها هناك حتى عملية التحول. قم بتحضير المحلول واحد والمحلول اثنين مباشرة قبل عملية التحول في أنابيب خالية من الـ RNA. انقل المزرعة الخلوية إلى أنبوب سعة 50 mL خالٍ من الـ RNA وقم بالطرد المركزي بسرعة 3000 rotations per minute ما يعادل 1,562 ×g لمدة دقيقتين.

قم بإزالة السائل الطافي واغسل الخلايا بـ 50 milliliters من الماء الخالي من RNase. قم بطرد الخلايا مركزياً مرة أخرى بسرعة 3000 rotations per minute لمدة دقيقتين. كرر هذه العملية خمس مرات للتخلص من وسط الزرع وأي RNases قد تكون موجودة بعد عملية الطرد المركزي النهائية.

قم بإزالة الطافي وأعد تعليق الخلايا في خمسة مللي لتر من المحلول. أولاً، قم بطرد العينة مركزياً بسرعة 3000 دورة في الدقيقة لمدة دقيقتين، ثم تخلص من السائل الطافي وأضف 250 ميكرولتر من المحلول 1 إلى الخلايا. هذه الكمية من الخلايا كافية لإجراء سبع إلى ثماني عمليات تحول.

قم بتوزيع 50 µL من معلق الخلايا في كل أنبوب من سبعة أنابيب طرد مركزي دقيقة خالية من الـ RNA. بعد ذلك، أضف 20 µL من الأوليغو بتركيز 50 µM المحتوي على RNA في ثلاثة أنابيب، و 20 µL من الأوليغو بتركيز 50 µM المكون من DNA فقط في ثلاثة أنابيب، و 20 µL من الماء المعقم بدون أوليغو كعينة ضابطة سلبية في أنبوب واحد.

بعد ذلك، أضف 300 µL من المحلول الثاني لكل تفاعل من تفاعلات التحول السبعة. رج العينات بقوة باستخدام جهاز Vortex لخلط المكونات. حضن تفاعلات التحول عند درجة حرارة 30 °C لمدة 30 دقيقة في جهاز هزاز بعد عملية التحضين.

عرض العينات لصدمة حرارية عند 42 °C لمدة 15 دقيقة. بعد ذلك، يتم تدوير الخلايا باستخدام جهاز الطرد المركزي بسرعة 5,000 دورة في الدقيقة، وهو ما يعادل 2,236 ×g لمدة أربع دقائق. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الخلايا في 100 µL من الماء المعقم لكل ثلاثة أنابيب.

خذ عينة من معلق الخلايا هذا وخفف كل عينة بالماء المعقم بنسبة 100,000 ضعف. أضف حوالي 15 خرزة زجاجية معقمة لكل طبق، ثم وزع 100 microliters من الخلايا المخففة بنسبة 100,000 ضعف على ثلاثة أطباق YPD. وزع 100 microliters من الخلايا المعاد تعليقها من كل تفاعل تحول على طبق بتري واحد من الوسط الصلب الاصطناعي الكامل الخالي من التربتوفان، ثم رج الأطباق بشكل متساوٍ.

بعد ذلك، قم بإزالة الخرزات. يتم تحضين الخلايا على أطباق YPD عند 30 درجة Celsius لمدة يومين، وتحضين الخلايا المزروعة على وسط تخليقي كامل صلب خالٍ من التريبتوفان عند 30 درجة Celsius لمدة تتراوح من أربعة إلى خمسة أيام. قم بعدّ ومقارنة عدد المستعمرات النامية على الوسط الانتقائي وكذلك على وسط YPD لحساب تردد تصحيح الجين لكل من الأوليغو المحتوي على RNA، والأوليغو الذي يحتوي على DNA فقط، وعينة الضابطة الخالية من الأوليغو.

من المتوقع عدم تكون أي مستعمرات على الوسط الانتقائي عند عدم إضافة الـ oligos إلى الخلايا؛ لذا يتم تخطيط عدة مستعمرات محولة مختارة عشوائياً على وسط YPD للحصول على عزلات من مستعمرات مفردة. تُحضن الخلايا لمدة يومين عند 30 degrees Celsius لنمو المستعمرات. وبعد فترة التحضين، يتم اختيار عدة مستعمرات مفردة وعمل بقع (patches) على وسط YPD وعلى الوسط الانتقائي.

يُلاحظ نمو الخلايا التي تم تحويلها باستخدام قليل النيوكليوتيدات (oligos) على الوسط الاصطناعي الصلب الكامل الخالي من التريبتوفان بعد تحضينها لمدة يوم واحد، بينما لا يظهر هذا النمو في سلالة التحكم الخالية من قليل النيوكليوتيدات على الوسط الاصطناعي الصلب الكامل الانتقائي الخالي من التريبتوفان. بعد ذلك، يتم تصميم زوج من البادئات لتضخيم المنطقة المستهدفة بواسطة قليل النيوكليوتيدات المحتوي على RNA باستخدام تقنية تفاعل البوليميراز المتسلسل للمستعمرات (colony PCR) لبدء العملية. يتم إعادة تعليق الخلايا المأخوذة من الرقع الفردية في 50 µL من الماء المحتوي على وحدة واحدة من إنزيم الليز (liase)، ثم تُحضن العينات في درجة حرارة الغرفة لمدة 10 دقائق، يلي ذلك التحضين في كتلة تسخين عند 100 °C لمدة خمس دقائق لتحليل الخلايا وتحرير DNA الجينومي في المحلول.

قم بتجهيز تفاعلات PCR في أنابيب PCR، مع إضافة 10 µL من معلق الخلايا إلى كل مجموعة أنابيب مجهزة، ثم قم بإجراء تفاعل التضخيم كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. قم بتشغيل العينات الناتجة على هلام agarose بتركيز 1% لملاحظة ناتج PCR. وبما أن المعلومات الوراثية التي نقلها الـ oligo المحتوي على RNA في هذه التجربة تولد موقع تقييد VAN 91 1 جديد في المنطقة المستهدفة من جينوم الخميرة، فمن الممكن التحقق من النقل الصحيح للمعلومات عن طريق هضم ناتج PCR باستخدام إنزيم التقييد van 91 1.

قم بإعداد تفاعل الهضم بحيث يشمل 6 µL من منظم PCR product buffer BSA، و0.5 µL من إنزيم التقييد، ومياه معقمة حتى يصل الحجم إلى 15 µL. قم بحضن العينات لمدة ساعة واحدة عند 37 °C. قم بتشغيل عينة غير مهضومة جنبًا إلى جنب مع العينات المهضومة في نفس الصف من هلام agarose بتركيز 2% لملاحظة التعديل الجيني الذي نقلته قطعة RNA في الـ oligo المحتوي على RNA.

قم بتنقية نواتج PCR باستخدام طقم تنقية PCR وتجهيزها لتسلسل DNA. أرسل العينات للتسلسل باستخدام نفس البادئات التي استُخدمت لتضخيم الناتج. وأخيراً، قم بتحليل نتائج تسلسل DNA باستخدام برنامج يسمح بمحاذاة تسلسلات متعددة مع تسلسل مرجعي مختار لإجراء المعالجة القلوية للأوليغو المحتوي على RNA لكل تفاعل عند مول واحد من الأوليغو المحتوي على RNA أو الأوليغو المحتوي على DNA فقط في أنبوب سعة 1.5 milliliter.

ثم أضف 4 µL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 1 M لإجراء التحلل المائي، أو 4 µL من الماء كعينة تحكم سلبية. احضن العينات عند 65 °C في حمام مائي لمدة ساعة واحدة بعد التحضين. انقل التفاعل إلى الثلج.

قم بمعادلة تفاعل التحلل المائي بإضافة 2 µL من حمض الهيدروكلوريك بتركيز 1.2 M، و 4 µL من tris hydrochloride بتركيز 1 M، و 4 µL من الماء لعينة الضبط السالبة. أضف 6 µL من الماء و 4 µL من tris hydrochloride بتركيز 1 M. احفظ العينات على الثلج حتى يتم إجراء عملية التحول.

كما وُصف للتو، فإن خلايا الخميرة التي لم يتم تحويلها بأي Oligo لا تُكوّن أي مستعمرات على الوسط الصلب الاصطناعي الكامل الخالي من التريبتوفان. وعلى العكس من ذلك، فإن الخلايا التي نُميت على وسط صلب اصطناعي كامل خالي من التريبتوفان بعد تحويل الخلايا بـ Oligo واحد يحتوي على RNA تُظهر الآن مستعمرات.

تنمو مستعمرات الخميرة أيضاً على وسط صلب اصطناعي كامل خالٍ من التريبتوفان بعد تحويل الخلايا باستخدام نانومول واحد فقط من أوليغو التحكم بالـ DNA المقابل؛ ويظهر الكشف عن انتقال المعلومات الوراثية من الأوليغو المحتوي على RNA إلى DNA كروموسوم الخميرة جلياً من خلال الهضم التقييدي بـ VAN 91 1 لناتج PCR الذي يضخم المنطقة الجينومية المستهدفة كما هو موضح، حيث يمكن رؤية ناتج PCR لموضع trip. Five الذي تم تضخيمه من الـ DNA الجينومي لسلالة trip. Five الطافرة.

يظهر أيضاً ناتج PCR الذي تم تضخيمه من DNA جينومي مشتق من مستعمرة trip plus مستهدفة بواسطة an oligo الخاص بـ DNA فقط. كما تم تشغيل نواتج PCR المضخمة من DNA جينومي مشتق من مستعمرات trip plus مستهدفة بواسطة an oligo المحتوي على RNA على الهلام. وتكشف نتائج الهضم التقييدي باستخدام van 91 1 لنواتج PCR نفسها عن حزمة PCR مضخمة بطول 278 base pair، وحزم نواتج الهضم بواسطة van 91 1 بطول 177 base pairs و 101 base pairs.

يكشف تسلسل DNA عن تصحيح الجين بواسطة الـ oligo المحتوي على RNA هنا. يظهر مخطط كهربائي لـ DNA للمنطقة الجينومية المستهدفة بواسطة الـ oligo المحتوي على RNA. يشتق الـ g في تسلسل DNA من الـ RG الموجود على الـ oligo المحتوي على RNA go.

كما يظهر داخل إطار إدراج تسلسلات قاعدة CG في منطقة trip five للمتحولات trip plus التي استهدفت بواسطة oligo DNA فقط وoligo يحتوي على RNA، والتي تتطابق مع التسلسل الإجماعي وتتم مقارنتها بتلك الموجودة في خلايا trip five الطافرة قبل استهدافها بواسطة oligos. يحتوي oligo الإصلاح الذي يتضمن RNA في الأسفل على إدراج DNA مكون من قاعدتين واستبدال RNA مكون من قاعدة واحدة.

توضح المنطقة المؤطرة باللون الأزرق مع التظليل الأصفر أن الأوليغو المحتوي على RNA وكذلك الأوليغو المكون من DNA فقط قد صححا بدقة طفرة الحذف والطفرة غير المعبرة في جميع العينات المختبرة، وتشير الخطوط المتقطعة إلى موضع تسلسل الأوليغو المحتوي على RNA. تمنع المعالجة القلوية تصحيح الجين بواسطة الأوليغو المحتوي على RNA، ويوضح الشكل تردد التحول بواسطة الأوليغو المحتوي على RNA والأوليغو المكون من DNA فقط. تمثل أشرطة الخطأ الخطأ المعياري للمتوسط لثلاث عمليات تحول مستقلة لكل أوليغو.

تُظهر قليلة النوكليوتيد المكونة من DNA فقط تردد تحول مماثلاً في حالتين، مع وبدون المعالجة بهيدروكسيد الصوديوم. وعلى العكس من ذلك، ينخفض تردد التحول بواسطة قليلة النوكليوتيد التي تحتوي على RNA إلى الصفر بعد المعالجة بهيدروكسيد الصوديوم. وبناءً على ذلك، فإن التحضير الذي يحتوي على قليلة النوكليوتيد التي تضم RNA غير ملوث بقليلة النوكليوتيد المكونة من DNA فقط.

وبالتالي، فإن تردد التحول الملحوظ يكون خاصاً بالأوليغو الذي يحتوي على RNA. لقد عرضنا لكم للتو كيفية تكوين هجين RNA-DNA على مستوى الكروموسوم ومراجعة انتقال المعلومات الوراثية من RNA إلى DNA الجينومي في خلايا الخميرة. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر توفير جودة ممتازة للأوليغوهات التي تحتوي على RNA والعمل في ظروف خالية من RNA.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.