إعداد مستمنع ماوس النخامية للتحريض التهاب النخامية الذاتية التجريبي

التهاب الغدة النخامية المناعي الذاتي بتضخم الغدة النخامية ونقص واحد أو أكثر من هرمونات الغدة النخامية. لا تزال المستضدات الذاتية المسببة غير معروفة. هنا ، يتم عرض بروتوكول لإعداد بروتينات الغدة النخامية للفأر لاستخدامها في دراسة هذا المرض.

يتم عزل الغدد النخامية الأولى من الفئران القتل الرحيم. ثم يتم تجانس الغدة النخامية لكسر الخلايا ميكانيكيا وإطلاق بروتينات العصارة الخلوية. يتم توضيح المتجانسة عن طريق الطرد المركزي منخفض السرعة وتقييمها للكمية عن طريق قياس الألوان ، ومقايسة BCA والجودة عن طريق الرحلان الكهربائي لهلام بولي أكريلاميد.

أخيرا ، يتم خلط البروتين المائي المتجانس مع مادة مساعدة زيتية. ثم يتم حقن هذا الخليط في الفئران لإنشاء نموذج فأر يشبه التهاب الغدة النخامية المناعي الذاتي. كما هو موضح في الفيديو المصاحب ، تم وصف أربع تقنيات للحث على التهاب الغدة النخامية في التجارب.

التقنية المقدمة في هذه المقالة وهي حقن البروتينات النخامية المختلطة الإنفلونزا المساعد هي أقدم تقنية يعود تاريخها إلى الستينيات. كانت الأساليب الأخرى هي حقن البروتينات السكرية القابلة للذوبان من فيروس الحصبة الألمانية في عام 1992 ، والحقن التجسيمي لفيروس غدي مباشرة في الغدة النخامية في عام 2002 ، وزرع الغدة النخامية من سلالة فئران واحدة تحت كبسولة الكلى لسلالة أخرى من الفئران في عام 2010. الميزة الرئيسية لنهج فلورنسا المساعد هي أنه أقل توغلا في الوقت الحاضر ، وأكثر اتساقا وقبل كل شيء ، أكثر دقة في إحداث مرض يشبه إلى حد بعيد نظيره البشري.

على الرغم من الإبلاغ عنها منذ الستينيات ، إلا أن تقنية المساعدة الأجنبية كان أداؤها ضعيفا لتحريض التهاب الغدة النخامية. عندما بدأت عملي في الدكتوراه ، لم أتمكن من الحصول إلا على حالة التهاب الغدة النخامية المتواضعة والشدة باستخدام بروتوكول المساعد الأجنبي المنشور. تتحسن الأمور بشكل ملحوظ عندما تكون لدي فكرة عن زيادة كمية بروتينات pitu التي تحتويها في عاطفة EM بمقدار عشرة أضعاف.

على الرغم من أن هذه الطرق يمكن أن توفر نظرة ثاقبة حول التسبب في التهاب الغدة النخامية المناعي الذاتي ، إلا أنه يمكن استخدامها أيضا لدراسة أمراض المناعة الذاتية الأخرى التي لا يزال يتعين تحديد المستضدات الذاتية لها. بشكل عام ، سيكافح الأفراد الجدد في هذه الأساليب بشكل أساسي مع الخطوة الأخيرة ، وهي إعداد الهامش ، لأنها تتطلب مهارات يدوية ووقت وتفاني. لذلك يعد العرض المرئي أمرا بالغ الأهمية لفهم كيفية تحضير المستحلب المناسب.

يمتد تأثير هذه التقنية إلى ما هو أبعد من مجال المناعة الذاتية. يمكن أيضا استخدام معرفة كيفية تحضير المستضد الداخلي للتحصين في إنتاج الأجسام المضادة وحيدة النسيلة أو لاختبار لقاحات جديدة. وسيكون إظهار هذه التقنية هو S Zooic Ura و Mayland al gato من مختبري.

الغدة النخامية الفأرية هي غدة أسطوانية الشكل تقع في قاعدة الجمجمة في انخفاض في العظم الوتدي يسمى terica. يحد الغدة جانبيا الأعصاب ثلاثية التوائم والأمامية بعصاب العصب البصري. يتكون من فص أمامي أكبر وفصوص أصغر ومتوسطة وخلفية.

لعزل الغدة النخامية ، استخدم المقص لقطع رأس الفأر القتل الرحيم ، ثم قم بعمل قطع متوازية من الجزء الخلفي إلى الأمام من الجمجمة. ارفع الدماغ واقلبه للخلف لكشف الغدة النخامية ، والتي تظهر على شكل أسطوانة في سياق مثلث متساوي الساقين. وجود الغدة النخامية كقاعدة ، والأعصاب ثلاثية التوائم كجوانب ، والتصلب البصري كرأس.

ضع دائرة حول الغدة بأطراف ملقط مغلق لكسر السحايا المحيطة. ثم باستخدام ملقط ناعم ، أمسك الغدة النخامية من خلية توركا وضعها في أنبوب بلاستيكي على ثلج جاف. لإعداد واحد ، اجمع 300 غدة نخامية من الفأر.

تتطلب هذه المجموعة ما يقرب من تسع ساعات شخص. بمجرد اكتمال الجمع ، قم بتخزين الغدد النخامية عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تكون هناك حاجة إليها. ضع أنبوب فالكون سعة 15 مليلتر في حمام جليدي.

أضف إلى الأنبوب 250 ميكرولتر من مخزن التجانس. لكل 100 غدة نخامية تم جمعها قبل التجانس مباشرة ، أضف الغدد النخامية الفأرية إلى المخزن المؤقت. بعد ذلك ، ضع طرف الخالط بولي ترون ، وهو مولد قطره خمسة ملليمترات في الجزء السفلي من أنبوب فالكون ، ويحتوي على غدة النخام، وتجانس المخزن المؤقت بأقصى سرعة لمدة 30 ثانية.

حرك الأنبوب برفق لأعلى ولأسفل مع إبقائه على الجليد. ثم ضع المتجانس على الجليد لمدة دقيقة واحدة. كرر خطوات التجانس والتبريد مرتين أخريين.

يجب أن يؤدي هذا التجانس اللطيف إلى كسر الخلايا وإطلاق البروتينات دون كسر أجهزة الطرد المركزي للنوى. يتجانس بسرعة منخفضة ، حوالي 1000 جم لمدة 10 دقائق عند أربع درجات مئوية إلى الرواسب والنوى والأنسجة غير المكسورة والمواد غير القابلة للذوبان مثل النسيج الضام ومجمعات البروتين المشوهة. الحرص على عدم إزعاج الحبيبات.

انقل SNA الذي يطلق عليه الآن اسم ما بعد المحطة النووية أو PNS إلى متجر أنبوب Falcon جديد. يسحب الجهاز العصبي المحيطي الموجود على الجليد الحبيبات باستخدام نفس حجم المخزن المؤقت للتجانس كما كان قبل التجانس والطرد المركزي كما كان من قبل. بعد تجميع عينتي PNS ، قم بتحويل المحلول إلى العديد من أنابيب الطرد المركزي الدقيقة.

قم بتخزين أنابيب الطرد المركزي الدقيقة عند 80 درجة مئوية تحت الصفر حتى تكون هناك حاجة إليها. مستحضر البروتين هذا مستقر عند 80 درجة مئوية تحت الصفر ، لكنه يفقد فعاليته تدريجيا. وبالتالي ، يوصى باستخدامه في غضون ستة أشهر من التحضير.

احتفظ بكمية صغيرة واحدة من PNS لتحديد إنتاجية البروتين وتركيزه بواسطة مقايسة حمض biy. ثم تحديد جودة البروتين عن طريق الرحلان الكهربائي للهلام من 300 غدة نخامية فأرية ، والتي يبلغ متوسط وزنها الإجمالي حوالي 570 ملليغرام. توقع إنتاجا قدره 60 ملليغراما من بروتينات الغدة النخامية أو ملليغرام واحد من البروتين لكل 10 ملليغرام من الأنسجة.

تركيز البروتين عادة حوالي 40 ملليغرام لكل مليلتر. المثال المقدم هنا هو لتحصين 10 فئران. خطط لحقن كل فأر ب 100 ميكرولتر من المستحلب يحتوي على ملليغرام واحد من بروتين الغدة النخامية ، مما يسمح لفأرين إضافيين بخسائر المواد أثناء التحضير هنا ، يتم تحضير 12 ملليغرام من مستحلب البروتين.

ابدأ بإذابة كميات البروتين المجمدة بسرعة عن طريق تسخينها بين يديك. اضبط تركيز البروتين على 20 ملليغرام لكل مليلتر باستخدام PBS. بعد ذلك ، ارسم 600 ميكرولتر من مستخلص بروتين الغدة النخامية المقابلة ل 12 ملليغرام في 2.5 ملليلتر من حقنة غاز Tite Hamilton resuspend ، ومساعد FRONS كامل أو CFA يحتوي على خمسة ملليغرام لكل مليلتر من الحرارة يقتل المتفطرة السلية عن طريق رجها يدويا.

ثم اسحب 600 ميكرولتر من CFA في حقنة هاميلتون أخرى سعة 2.5 ملليلتر. قم بتوصيل وتثبيت إبرة استحلاب دقيقة قياس 22 بالمحقنة المملوءة ب CFA. ادفع المكبس ببطء بحيث تمتلئ الإبرة ب CFA.

ثم قم بتوصيل وتأمين الطرف الآخر من الإبرة بالمحقنة الأخرى المملوءة بمستخلص بروتين الغدة النخامية. تجنب حبس فقاعات الهواء داخل المحاقن. تقدم ببطء المكبس من حقنة CFA لدفع مكون الزيت إلى استخراج الغدة النخامية المائية بحيث يتم خلط كمية صغيرة فقط.

ثم ادفع مكبس مستخلص الغدة النخامية إلى الخلف في حقنة CFA. كرر هذا الإجراء لزيادة كمية المواد المختلطة تدريجيا حتى تختلط المحتويات بالكامل. تمثل هذه المادة البيضاء والموزعة بالتساوي مستحلب الماء والزيت.

بمجرد تكوين المستحلب ، كرر الدورة الكاملة ذهابا وإيابا 500 مرة على الأقل بعد الدورة النهائية ، ستحتوي المحاقن على مستحلب ماء وزيت واحد لواحد حيث يبلغ تركيز بروتين الغدة النخامية الآن 10 ملليغرام لكل مليلتر. المستحلب جاهز للاستخدام لاختبار جودة المستحلب عند قطرة منه إلى كوب من الماء. إذا تم تحضير المستحلب بشكل صحيح ، فسيبقى القطرة مضغوطا وضيقا على السطح.

إذا كان المستحلب ذا نوعية رديئة ، فسوف ينتشر وينقسم إلى قطرات أصغر. يتم حقن المستحلب في نفس يوم تحضيره في الفئران SJL للحث على التهاب نقص المناعة الذاتية التجريبي. تم تفصيل هذا البروتوكول في الجو المصاحب للعمودي.

بمجرد جمع غدة pitu وإتقان التقنيات ، يمكن للمرء أن يؤدي تعليمات البروتين في ساعة واحدة ، مع تذكر العمل بسرعة وعلى الجليد. خلال هذه الخطوة ، أثناء إعداد الغمر ، والذي يتطلب حوالي ساعة واحدة. تذكر أن تعمل ببطء وصبر في مرحلة الخلط الأولية بعد تطورها.

مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال المناعة الذاتية لاستكشاف الآليات التي من خلالها تتعرف الخلايا الليمفاوية ذاتية التفاعل على العضو المستهدف وتتسلل إليه. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لجميع كيفية تحضير مستخلص البروتين من الغدة النخامية للفأر وكيفية مزجه مع أكشاك كرون لتحضير مستحلب جاهز للاستخدام كمادة مناعية. لا تنس أن العمل مع المحاقن والمحاقن الكاملة لحافة الأنفلونزا ، والتي تحتوي على السل الميكروتيري المعطل والجاف يمكن أن يكون خطيرا إذا قمت بثقب نفسك عن طريق الخطأ.

لذلك استخدم دائما توهج G وتخلص من الإبر بشكل صحيح أثناء تنفيذ هذا الإجراء.