Intravital المجهري للماوس دوران الأوعية الدقيقة الدماغ باستخدام نافذة مغلقة القحف

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة الدورة الدموية الدقيقة في دماغ الفأر عن طريق المجهر الحيوي، مما يسمح بتتبع التغيرات الديناميكية في المؤشرات الهيموديناميكية والالتهابية في الدورة الدموية الدقيقة المكدسة على فترات زمنية ممتدة. تم تطوير هذه التقنية في معهد لا جولا للهندسة الحيوية، حيث استُخدمت في أنواع عديدة من الدراسات؛ على سبيل المثال، متابعة التغيرات الهيموديناميكية خلال مسار العدوى بـ *Plasmodium burgi onca*، وعند وقت ظهور الملاريا الدماغية.

يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق زرع نافذة قحفية مزمنة قبل أسبوعين من دراسات المجهر الحيوي. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تسجيل المورفولوجيا العامة للنافذة القحفية باستخدام صورة رقمية عالية الدقة بتكبير منخفض. أما الخطوة الثالثة من الإجراء فهي الحصول على صور المجهر الحيوي باستخدام الإضاءة التقليدية والفلورية، واختيار مواقع دراسة محددة لإجراء قياسات فورية لقطر الوعاء الدموي وسرعة RBC.

تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في إجراء تحليل حيوي داخل الجسم لالتصاق الكريات البيضاء والصفائح الدموية في أوعية الـ pial عن طريق أجسام مضادة متخصصة وموسومة بفلوريسنت. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر التغيرات في الدورة الدموية الدقيقة داخل الجسم في نماذج دماغية تحاكي الحالات الفسيولوجية أو المرضية من خلال المجهر الحيوي داخل الدماغ لتحديد التغيرات الهيموديناميكية المرتبطة بهذه الحالات. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية في أننا نراقب الدماغ في بيئته الفسيولوجية دون تعريضه لعوامل خارجية أو وسط اصطناعي؛ وبالمقارنة مع التصوير بالرنين المغناطيسي وتصوير الأوعية، فإن المجهر الحيوي داخل الجسم يتميز بدقة مكانية وزمانية تتيح لنا الفحص من المستوى المجهري إلى المستوى المجهري الدقيق.

يمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في فسيولوجيا وفيزيولوجيا الأمراض الخاصة بالدورة الدموية الدقيقة في الدماغ، مثل التغيرات الهيموديناميكية والالتهابية أثناء المرض الحاد والمزمن. قبل أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من إجراء المجهر الحي، يتم إجراء عملية فتح الجمجمة في فئران تتراوح أعمارها بين 8 إلى 10 أسابيع كما تم توضيحه سابقاً، باستثناء عدم وضع قضيب تيتانيوم في رأس الحيوان. وتعتبر النافذة القحفية المزمنة تحضيراً مستقراً، مما يسمح بفحص الدورة الدموية الدقيقة حتى بعد عدة أشهر من زرعها في يوم التجربة.

أولاً، تحقق من درجة حرارة جسم الحيوان قبل وضعه في إطار التوجيه المجسم (stereotaxic frame)، ثم احقن كريات دم حمراء موسومة بصبغة فلورية محضرة مسبقاً عبر الوريد الذيلي للفأر. سيمكن هذا من تتبع كريات الدم الحمراء، وهو ما سيتم توضيحه لاحقاً. بعد ذلك، قم بتخدير الفأر تخديراً خفيفاً باستخدام isof fluorine.

4% للتحريض، ومن 1 إلى 2% للمحافظة. بعد ذلك، ضع الحيوان في وضعية الانبطاح في إطار مجسمي فوق وسادة تدفئة. ثبت الرأس بعناية باستخدام قضبان الأذن واضبط المستوى باستخدام الرافعتين اليمنى واليسرى.

نظف غطاء الشريحة الموجود على النافذة القحفية برفق باستخدام مسحة قطنية مبللة بالزيت المعدني. بعد ذلك، وباستخدام مجهر ستيريولوجي متصل بكاميرا رقمية، التقط عدة صور بانورامية للأوعية الدموية الموجودة تحت النافذة. وبعد نقل الصور البانورامية إلى جهاز الكمبيوتر، اختر أفضل صورة لطباعتها وتحديدها وتدوين تاريخها.

ستُستخدم هذه الصورة كخريطة لقياسات قطر الأوعية الدموية وسرعات خلايا الدم الحمراء، والتي سيتم توضيحها في الخطوة التالية لبدء المجهر الحيوي. انقل الفأر إلى منصة مجهر حيوي مخصصة. ضع قطرة من الماء على النافذة القحفية مستفيداً من التجويف الذي شكلّه الأكريليك السني.

تُستخدم عدسة شيئية غمر مائي بقوة 20x وفتحة عددية تبلغ 0.5. يتم تسجيل الصور باستخدام كاميرتين: كاميرا رقمية عالية السرعة منخفضة الإضاءة متصلة بجهاز كمبيوتر وشاشة، وكاميرا تناظرية منخفضة الإضاءة متصلة بجهاز تسجيل فيديو (VCR Tape) وطابع زمني وشاشة ملونة. قبل اختيار الأوعية للقياس، يتم فحص الأوعية لتقييم جودة التحضير، وإذا كان الدم يتدفق في جميع الأوعية، يتم حينئذٍ اختيار الأوعية المراد قياسها. ويجب أن تشمل هذه الأوعية أوردة وشرايين بأقطار مختلفة وتغطي مواقع متنوعة ضمن المنطقة المكشوفة من خلال النافذة.

في تجربتنا، نختار 12 وعاءً دمويًا للقياس أثناء معاينة حقول مختلفة داخل النافذة القحفية. ولاختيار الأوعية الدموية، يتم تحديد الموقع الدقيق لكل نقطة سيتم قياسها في صورة الأوعية الدموية الخاصة بـ PY التي تم التقاطها مسبقًا؛ حيث يتم قياس قطر الوعاء الدموي باستخدام جهاز قص الصور. وبمجرد اختيار النقطة، يتم محاذاة صورة الوعاء الدموي في الوضع العمودي ثم يتم قص الصورة حتى الوصول إلى الجانب المقابل.

يتم محاذاة النهايات القصوى وتوثيق القراءة. وبالنسبة لتتبع كريات الدم الحمراء، يتم تسجيل كل بقعة بواسطة الكاميرا الرقمية لمدة 30 ثانية على الأقل، وتُسجل الصور الفيديوية بمعدل 150 إطاراً في الثانية. تم ضبط هذا المعدل للحصول على صورة واحدة إلى ست صور للخلية في الإطار الفيديو الواحد من أجل تحديد السرعات التي تصل إلى 6 mm/s.

بمجرد الانتهاء من جمع البيانات، يتم إخراج الفأر من الإطار المجسم وإعادته إلى قفصه للتعافي من التخدير باستخدام البرنامج المناسب. تتم رقمنة صور الفيديو المكتسبة، ويتم الحصول على بيانات الإحداثيات XY لكل صورة خلية. يتم تحديد مواقع الخلايا يدويًا بدلاً من الاعتماد على تحليل الصور.

بما أن عين المراقب المدرب تعطي تقديراً جيداً لموقع مركز الخلية، والذي يتوافق عموماً مع موقع أقصى فلورة ملحوظة. وبالنسبة لمعظم اتجاهات الخلايا، يتم تحديد الموقع والسرعة لـ 15 خلية في كل وعاء. ويُحسب المتوسط للحصول على متوسط سرعة RBC بمجرد توفر قياسات قطر الوعاء وسرعة RBC.

يمكن حساب تدفق الدم في كل وعاء دموي باستخدام الصيغة Q تساوي D على 2 تربيع مضروبة في PI مضروبة في V حيث تمثل Q تدفق الدم، وV سرعة خلايا RBC، وD قطر الوعاء لتقييم التروية وتحليل التصاق الكريات البيضاء في الأوعية الشعرية. يتم إجراء المجهر الحيوي على حيوان تم حقنه بمزيج من الألبومين المسمى بـ FSE وأجسام مضادة ضد علامة الكريات البيضاء الشاملة CD 45 المسمى بـ Texas Red. يسمح الألبومين المسمى فلورياً بتحسين رؤية الشبكة الوعائية، بما في ذلك الأوعية المخترقة، وهو مفيد بشكل خاص في الحالات المرضية مثل الملاريا الدماغية للتحقق من الأوعية غير المروية أو ناقصة التروية.

تسهل الأجسام المضادة لـ CD 45 الموسومة فلورياً عملية تحديد وقياس تدحرج وكريات الدم البيضاء والتصاقها بالأوعية الدموية. يتم قياس التصاق كريات الدم البيضاء عن طريق عد عدد كريات الدم البيضاء في طول وعاء يبلغ 100 micron. أما التدحرج فيتم قياسه عن طريق عد عدد كريات الدم البيضاء التي تتحرك بسرعة أبطأ بكثير من سرعة الدم في نفس الطول البالغ 100 micron خلال 30 ثانية. موضح.

فيما يلي مثال على قياسات سرعة خلايا الدم الحمراء في الأوعية الدموية الدقيقة عن طريق تتبع الخلايا باستخدام الفلورة عالية السرعة. تمثل تسجيلات الفيديو من الصور A إلى F سلسلة من صور الدورة الدموية الدقيقة. تمثل كل صورة موضع خلية دم حمراء واحدة متدفقة، والتي يتم التقاطها إطاراً تلو الآخر بواسطة الكاميرا عالية السرعة.

يوضح هذا الرسم البياني من تجربة نموذجية التغيرات في تدفق الدم في كومة الأوعية الدموية بمرور الوقت. في الفئران المصابة بـ plasmodium, burgi, onca، يظهر تدفق الدم انخفاضاً ملحوظاً عند وقت تطور الملاريا الدماغية، بينما يكون تدفق الدم في الفئران الضابطة غير المصابة مستقراً نسبياً بمرور الوقت.

في اليوم السادس، يكشف التصبيغ باستخدام الأجسام المضادة الفلورية Texas red لـ anti CD 45 عن عدد كبير من الكريات البيضاء الملتصقة بأوعية تجمعية لفأر مصاب بـ plasmodium burgi onca. لهذا الإجراء نطاق واسع من التطبيقات بالإضافة إلى العمل الموضح هنا اليوم. إذ يمكن تطويع أي تقنية بصرية يمكن استخدامها in vivo لهذا النموذج، كما يمكن دراسة معايير مثل الأنسجة، ومستوى الأكسجين في الأنسجة، والـ pH، وأنواع الأكسجين التفاعلية، والتفاعل البطاني مع الكريات البيضاء في هذا النموذج.