Intravital المجهري للماوس دوران الأوعية الدقيقة الدماغ باستخدام نافذة مغلقة القحف

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة دوران الأوعية الدقيقة في دماغ الفأر عن طريق الفحص المجهري داخل الحيوية ، مما يسمح بتتبع التغيرات الديناميكية في علامات الدورة الدموية والالتهابات في دوران الأوعية الدقيقة في الوبر على مدى فترات طويلة من الزمن. تم تطوير هذه التقنية في معهد لا جولا للهندسة الحيوية ، حيث تم استخدامها في العديد من أنواع الدراسات. على سبيل المثال ، متابعة التغيرات الديناميكية الدموية أثناء مسار عدوى المتصورة بورجي أونكا ، وفي وقت التعبير عن الملاريا الدماغية.

يتم تحقيق ذلك عن طريق زرع نافذة قحفية مزمنة أولا قبل أسبوعين من دراسات الفحص المجهري داخل الحيوية. تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تسجيل التشكل العام لنافذة الجمجمة باستخدام صورة رقمية عالية الدقة بتكبير منخفض. تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في الحصول على صور مجهرية داخل الحيوية باستخدام الإضاءة التقليدية والفلورية ، وتحديد مواقع دراسة محددة للقياسات عبر الإنترنت لقطر الوعاء وسرعة كرات الدم الحمراء.

تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في إجراء تحليل داخل الحيوية للالتصاق الكريات البيض والصفائح الدموية في أوعية الوبر عبر أجسام مضادة محددة تحمل علامة الفلورسنت. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج تظهر في الجسم الحي ، تغيرات في الدورة الدموية الدقيقة في نماذج الانعكاس الدماغي للحالات الفسيولوجية المرضية أو المرضية من خلال الفحص المجهري داخل الدماغ لإنشاء تغيرات ديناميكية الدم المرتبطة بهذه الحالات. الميزة الرئيسية لهذه التقنية هي أننا نلاحظ الدماغ في بيئته الفسيولوجية دون تعريضه لعوامل خارجية أو الفحص المجهري داخل الحيوية الوسط الاصطناعي مقارنة بالرنين المغناطيسي للصورة وتصوير الأوعية الدموية له دقة مكانية وزمانية وتسمح لنا بالنظر من المستوى المجهري إلى المستوى المجهري.

يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة الرئيسية في علم وظائف الأعضاء والفيزيولوجيا المرضية لدوران الأوعية الدقيقة في الدماغ ، مثل التغير الديناميكي الدموي والالتهابي أثناء المرض الحاد والمزمن قبل أسبوعين إلى ثلاثة أسابيع من الفحص المجهري داخل الحيوية. يتم إجراء بضع القحف في الفئران التي تتراوح أعمارها بين ثمانية و 10 أسابيع ، وقد تم إثباته مسبقا باستثناء عدم وضع قضيب التيتانيوم في رأس. نافذة الجمجمة المزمنة هي مستحضر مستقر ، مما يسمح بفحص دوران الأوعية الدقيقة للكومة حتى بعد أشهر من زرعها في يوم التجربة.

أولا ، تحقق من درجة حرارة جسم قبل وضع في إطار تجسيمي مملوء مسبقا بكريات الدم الحمراء المسماة بالفلورسنت من خلال وريد ذيل الفأر. سيمكن ذلك من تتبع كريات الدم الحمراء ، والذي سيتم إظهاره لاحقا. ثم قم بتخدير الفأر برفق باستخدام الفلور.

4٪ للحث ، واحد إلى 2٪ للصيانة. بعد ذلك ، ضع في وضع الانبطاح في إطار تجسيمي على وسادة تدفئة. قم بتأمين الرأس بعناية باستخدام قضبان الأذن واضبط المستوى باستخدام الذراعين اليمنى واليسرى.

نظف زلة الغطاء برفق على نافذة الجمجمة باستخدام قطعة قطن مبللة بالزيت المعدني. ثم باستخدام مجهر استريو متصل بكاميرا رقمية ، التقط بعض الصور البانورامية للأوعية الموجودة أسفل النافذة. بعد نقل الصور البانورامية إلى جهاز كمبيوتر ، حدد أفضل صورة ليتم طباعتها وتحديدها وتأريخها.

سيتم استخدام هذه الصورة كخريطة لقياسات قطر الوعاء الدموي وسرعات خلايا الدم الحمراء ، والتي سيتم عرضها بعد ذلك لبدء الفحص المجهري داخل الحيوية. انقل الماوس إلى مرحلة مجهر داخل الحيوية مخصصة. ضع قطرة ماء على نافذة الجمجمة للاستفادة من البئر الذي يتكون منه أكريليك الأسنان.

يتم استخدام هدف الغمر في الماء 20 × بفتحة عددية 0.5. يتم تسجيل الصور باستخدام كاميرتين ، وكاميرا رقمية منخفضة الإضاءة ، وكاميرا عالية السرعة متصلة بجهاز كمبيوتر وشاشة ، وكاميرا تناظرية منخفضة الإضاءة متصلة بشريط VCR ، وطابع زمني ، وشاشة ملونة قبل اختيار الأوعية للقياس ، وفحص الأوعية لتقييم جودة المستحضر ، وما إذا كان الدم يتدفق في جميع الأوعية ، ثم حدد الأوعية المراد قياسها. يجب أن تشمل أماكن وشرايين بأقطار مختلفة وتغطي مواقع مختلفة داخل المنطقة المكشوفة بالنافذة.

في تجربتنا ، نختار 12 وعاءا للقياس أثناء عرض الحقول المختلفة داخل نافذة الجمجمة. لتحديد الأوعية ، قم بالتعليق على الموقع الدقيق لكل بقعة ليتم قياسها في صورة الأوعية الدموية PY التي تم التقاطها مسبقا لكل بقعة ، ويتم قياس قطر الوعاء باستخدام جهاز قص الصورة. بمجرد تحديد البقعة ، تتم محاذاة صورة السفينة في الوضع الرأسي ويتم قص الصورة حتى العكس.

يتم محاذاة التطرف ويتم توثيق القراءة. لتتبع كريات الدم الحمراء ، يتم تسجيل كل بقعة بواسطة الكاميرا الرقمية لمدة 30 ثانية على الأقل ، ويتم تسجيل صور الفيديو بمعدل 150 إطارا في الثانية. تم تعيين هذا المعدل للحصول على صورة واحدة إلى ست صور لخلية في إطار فيديو واحد لتحديد سرعات تصل إلى ستة ملليمترات في الثانية.

بمجرد الانتهاء من جمع البيانات ، قم بإزالة الماوس من الإطار التجسيمي وإعادته إلى قفصه للتعافي من التخدير باستخدام البرنامج المناسب. صور الفيديو المكتسبة رقمية و XY. يتم الحصول على بيانات الإحداثيات لكل صورة خلية. يتم تحديد مواضع الخلايا يدويا بدلا من تحليل الصور.

بالنظر إلى أن عين المراقب المدرب تعطي تقديرا جيدا لموقع مركز الخلية ، والذي يتوافق بشكل عام مع موقع التألق الأقصى الذي لوحظ. بالنسبة لمعظم اتجاهات الخلايا ، يتم تحديد الموضع والسرعة ل 15 خلية في كل وعاء. متوسط للحصول على متوسط سرعة كرات الدم الحمراء بمجرد توفر قطر الوعاء وقياسات سرعة كرات الدم الحمروية.

يمكن حساب تدفق الدم في كل وعاء باستخدام الصيغة Q يساوي D على مربعين في PI في V حيث Q يساوي تدفق الدم V يساوي سرعة كرات الدم الحمراء ، و D يساوي قطر الوعاء لتقييم وفرة وتحليل التصاق الكريات البيض في أوعية الخوازيق. يتم إجراء الفحص المجهري داخل الحيوية على مملوء بمزيج من الألبومين والأجسام المضادة المسمى FSE ضد علامة الكريات البيض CD 45 المسمى ب Texas Red. يسمح الألبومين المسمى بالفلورسنت بتحسين تصور شبكة الأوعية الدموية ، بما في ذلك اختراق الأوعية الدموية وهو مفيد بشكل خاص في الحالات المرضية مثل الملاريا الدماغية للتحقق من عدم انتشار الأوعية الدموية أو تحت الأوعية المنفوخة.

تسهل الأجسام المضادة المضادة للفلورسنت المضادة ل CD 45 تحديد وتحديد دحرجة الكريات البيض والالتصاق بأوعية الخوازر. يتم القياس الكمي لتصاق الكريات البيض عن طريق حساب عدد الكريات البيض في طول وعاء 100 ميكرون. يتم قياس التدحرج عن طريق حساب عدد الكريات البيض التي تسافر بسرعة أبطأ بكثير من سرعة الدم في نفس طول 100 ميكرون خلال 30 ثانية. تفعيلك.

فيما يلي مثال على قياسات سرعة خلايا الدم الحمراء الوعائية الدقيقة عن طريق تتبع الخلايا من التألق عالي السرعة. تسجيلات الفيديو الصور من A إلى F هي صور تسلسل من دوران الأوعية الدقيقة. تمثل كل صورة موضع خلية دم حمراء واحدة متدفقة ، والتي يتم التقاطها إطارا تلو الآخر بواسطة الكاميرا عالية السرعة.

يوضح هذا الرسم البياني من تجربة تمثيلية التغيرات في تدفق الدم في الوبر بمرور الوقت. في الفئران المصابة بالمتصورة والبورجي والأونكا وفي الفئران الضابطة غير المصابة ، بينما في الفئران الضابطة ، يكون تدفق الدم في الوبر مستقرا نسبيا بمرور الوقت. تظهر الفئران المصابة ب PBA انخفاضا في تدفق الدم في السوق في وقت تطور الملاريا الدماغية.

في اليوم السادس ، تكشف الأجسام المضادة الفلورية الحمراء في تكساس بمضاد CD 45 عن عدد كبير من الكريات البيض الملتصقة بأوعية كومة الفأر المصاب بالمتصورة بورجي أونكا. يحتوي هذا الإجراء على مجموعة واسعة من التطبيقات إلى جانب الوظيفة الواحدة هنا اليوم. يمكن تكييف أي تقنية بصرية يمكن استخدامها في الجسم الحي مع هذا النموذج ويمكن دراسة معلمات مثل الأنسجة وأنسجة مستوى الأكسجين وأنواع الأكسجين التفاعلية الأس الهيدروجيني والتفاعل البطاني مع الكريات البيض في هذا النموذج.