اختبار نشاط Protozoacidal من يجند - lytic هضميدات ضد النمل الأبيض غوت البروتوزوا في المختبر (الثقافة البروتوزوا) و في الجسم الحي (Microinjection في المعى المؤخر النمل الأبيض)

الهدف العام من هذا الإجراء هو إثبات أن الربيطات المُصنّعة ترتبط تحديداً بالأوليات الهاضمة للسليلوز في أمعاء النمل الأبيض الجوفي من نوع form mosen، وأن الربيطة المقترنة بالببتيد المحلل تقتل هذه الأوليات في المختبر (in vitro) ضمن مستنبت أوليات لاهوائي، وفي الجسم الحي (in vivo) عن طريق الحقن في المعي الخلفي للنمل الأبيض. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استخلاص الأوليات من أمعاء النمل الأبيض العامل تحت ظروف لاهوائية. أما الخطوة الثانية من الإجراء فهي تأكيد ارتباط الربيطة المقترنة بفلوروفور بأوليات أمعاء النمل الأبيض في المختبر (in vitro).

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إثبات أن الببتيد المحلل المقترن بالرابط يقتل الأوليات المعوية للنمل الأبيض في المختبر (in vitro). أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي حقن الرابط المقترن بصبغة فلورية والببتيد المحلل المقترن بالرابط في المعي الخلفي للنمل الأبيض للتأكد من عملية الارتباط وتدمير الأوليات المعوية في الجسم الحي (in vivo). وباستخدام حقن مستنبتات الأوليات في المعي الخلفي للنمل الأبيض والمجهر الفلوري، نوضح أن الرابط المقترن بالببتيد المحلل يرتبط بفعالية ويقتل الأوليات المعوية للنمل الأبيض في المختبر (in vitro) وفي الجسم الحي (in vivo).

أدى ربط الربيطة بالببتيد المحلل إلى زيادة السمية تجاه الأوليات مقارنة بالببتيد المحلل وحده. وبينما قللت هذه العملية من السمية تجاه الكائنات غير المستهدفة مثل e coli، ويرجع ذلك على الأرجح إلى أن الربيطة لم ترتبط بغشاء الخلية البكتيرية، فإن فقدان الأوليات يؤدي إلى موت النمل الأبيض في أقل من أسبوعين. وتعد تقنية استخدام الببتيدات المحللة المرتبطة بربيطة لقتل الأوليات التكافلية في أمعاء النمل الأبيض تحت الأرضي جزءاً من الجهود المبذولة لتطوير تقنيات بديلة لمكافحة النمل الأبيض.

تموت النمل الأبيض نتيجة لقلة الاعتماد على المواد الكيميائية في غياب المتعايشات في أمعائها. نقوم باستخلاص الأوليات من أمعاء النمل الأبيض لإثبات أن الربيطة ترتبط بالأوليات وأن الببتيد المحلل للربيطة يقتل هذه الأوليات. تظهر جزيئات الخشب داخل الأوليات فلورة ذاتية، لذا من المهم مقارنة نتائج الأوليات المعالجة بالربيطة الفلورية مع الأوليات غير المعالجة.

لتجنب أي نتائج إيجابية كاذبة، نقوم بحقن الببتيدات مباشرة في المعي الخلفي؛ لأنه إذا تم إطعام الببتيدات للنمل الأبيض، فإن البروتياز الموجود في المعي المتوسط والمعي الأمامي سيعمل على هضمها. وباستخدام مكتبات عرض الفاج (phage display) من New England Bio Labs، حددنا 19 تسلسلاً من ببتيدات hep التي ترتبط بالأوليات. وقد اخترنا أحد الربيطات ذات التسلسل الببتيدي الذي أظهر تشابهاً مع البروتينات السكرية المفترضة المعروفة في غشاء *Trypanosoma brucei*.

بعد تخليق الببتيد، قمنا بربط الببتيد المُخلق بمسبار فلوري عند الطرف الكربوكسيلي (C terminal) عن طريق تخليق الببتيد في الحالة الصلبة باستخدام راتنج E-D-A-N-S novatech لتقييم الخصائص التحللية لمركبات الببتيد المقترنة. في هذا الإجراء، نستخدم مركبًا من اللجين المُخلق والببتيد التحللي الذي تم تخليقه مسبقًا في مرفق البروتينات بجامعة ولاية لويزيانا (LSU) قبل يوم واحد من التجربة. استخدم sigma coat لمعالجة جميع المواد المستخدمة ومنع امتصاص الأوليات أو الببتيدات على الأسطح.

ضع طبقة متساوية واتركها تجف طوال الليل قبل الاستخدام في اليوم التالي. قم بتجهيز صندوق مروحة داخل صندوق القفازات لتدوير الهواء باستمرار في درجة حرارة الغرفة عبر مجفف وحزم رزم محفز من النوع D لتقليل مستويات الرطوبة والأكسجين لمدة تزيد عن ساعة واحدة. املأ صندوق القفازات بتدفق مستمر من النيتروجين لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة واستخدم نيتروجين إضافياً للحفاظ على الظروف اللاهوائية عند الحاجة.

بعد ذلك، قم بتحضير وسط Traeger U واضبط قيمة pH إلى 7، ثم قم بتصفية الوسط المعقم في الصندوق القفازي عبر رأس ماصة سعة 200 microliter متصل بأنبوب يحتوي على خليط من 2.5% hydrogen و 5% carbon dioxide و 92.5% nitrogen لمدة ساعة واحدة لإزالة بقايا الأكسجين من الصندوق القفازي. وبمجرد تجهيز المواد، استخدم ملقطاً لنقل عامل نمل أبيض من طبق بتري وغطس الجسم بالكامل في بيكر مملوء بـ 70% ethanol برفق مع تثبيت النملة بالملقط لمدة 10 ثوانٍ تقريباً. ولإزالة الملوثات السطحية، أخرج العامل من الإيثانول واتركه ليجف على منديل Kim wipe نظيف لمدة 20 ثانية تقريباً.

في صندوق القفازات، قم بتجهيز شريحة مجهرية مسيلنة بـ 100 µL من وسط Trager U لجمع أمعاء النمل الأبيض، وأنبوب يحتوي على 900 µL من وسط Trager U لجمع الأوليات. بعد ذلك، وباستخدام مجهر تشريحي وزوج من الملاقط المعقمة ذات الرؤوس الدقيقة، ثبت بطن العامل وأمسك طرف البطن بزوج آخر من الملاقط لسحب الأمعاء برفق للأعلى أو للأسفل بزاوية 45 درجة، وحاول جمع أربعة أمعاء (الأمعاء المتوسطة والأمعاء الخلفية) كقطعة واحدة. ضع أمعاء النمل الأبيض في قطرة بحجم 100 µL من وسط Trager U على الشريحة المجهرية.

بعد ذلك، ثَقِّب الأمعاء الخلفية باستخدام زوج من مسابر التشريح الدقيقة والمعقمة لتحرير الأوليات، ثم انقل محتويات الأمعاء برفق باستخدام ماصة 200 µL إلى أنبوب طرد مركزي دقيق سعة 1 mL يحتوي على 900 µL من وسط Traeger. انتظر خمس ثوانٍ لترسيب شظايا جدار الأمعاء، ثم انقل 900 µL من السائل الطافي إلى أنبوب جديد. انقل 10 µL من مستنبت الأوليات إلى شريحة مجهرية مغلفة بالسيجما.

ضع الشريحة وافحص حالة الأوليات تحت المجهر بتكبير 200 مرة. قم بتحضير مزارع ضابطة للأوليات الهوائية، وtetra piriformis، وamoeba، وug، وgleaner، وparamecium، بالإضافة إلى مزرعة ليلية من e coli في أوساط زراعية حسب توصيات المورد فور الحصول على الأوليات؛ ثم قم بتثبيت أوليات أمعاء النمل الأبيض وأي ضوابط أخرى من الأوليات وe coli باستخدام 10% formaldehyde عند درجة حرارة 4 °C لمدة 12 ساعة. بعد ذلك، قم بطرد محلول الأوليات مركزياً عند 30 ×g لمدة 10 دقائق.

تخلص من السائل الطافي واغسل الراسب الذي يحتوي على الأوليات المثبتة مرتين باستخدام 1 mL من وسط Trager U، ثم أعد تعليق الراسب في 1 mL من وسط Traeger Edia. قم بتحضين الكائنات الدقيقة المثبتة لمدة تتراوح من ساعة إلى ساعتين مع 100 µL من محلول الرابط الاصطناعي المقترن بالصبغة الفلورية E-D-A-N-S، بتركيز نهائي قدره 50 µM من الرابط المذاب في الماء. افحص الكائنات الدقيقة المعالجة بالروابط وعينات الضبط غير المعالجة تحت مجهر فلوري بتكبير 400 مرة، عند أقصى امتصاص عند 341 nm وانبعاث في المنطقة الزرقاء عند 471 nm.

لتقييم خصائص الببتيد المحلل المرتبط بربيطة، انقل ست حصص سعة 198 µL من مزرعة الأوليات التي تم تحضيرها كما هو موضح في القسم الثالث إلى أنابيب إبنشوفن سعة 0.5 mL. أضف 2 µL من محلول بتركيز 100 µM من الببتيد المحلل المرتبط بربيطة إلى نصف حصص مزرعة أوليات أمعاء النمل الأبيض. وللوصول إلى تركيز نهائي قدره 1 µM، أضف 2 µL من الماء المعقم كمجموعة ضابطة إلى النصف الآخر من الحصص.

بعد مرور ساعة واحدة، انقل 10 µL من كل مزرعة للأوالي إلى شريحة. قارن بقاء الأوالي المعالجة بالببتيد المحلل المقترن باللجين ببقاء عينات الضبط تحت المجهر بتكبير 200 مرة. اسحب الإبر باستخدام سحب الماصات الدقيقة NGI PC 10 بمستوى حرارة مزدوج المرحلة. وللحصول على حجم سن يتراوح بين 20 إلى 30 microns، قم بتأكيد حجم السن من خلال قياسه تحت المجهر.

باستخدام الميكروميتر، املأ إبرة واحدة بحوالي 30 µL من ربيطة معلمة فلوريسنتِيًّا بتركيز 50 µM معلقة في الماء. وباستخدام سرنجة ملحقة، املأ إبرة أخرى بالماء من أجل عينة الضبط. قم بتثبيت ماصة دقيقة في حامل وجهاز تلاعب دقيق. ثم ثبت إبرة في حامل نظام الحقن الموجود في جهاز تلاعب دقيق ثانٍ.

اضبط معاملات الحقن الأولية على طول نبضة يبلغ ثانية واحدة تقريباً وضغط حقن يتراوح بين 10 إلى 12 PSI. ثم ادفع الإبرة ببطء داخل الماصة الدقيقة (micro pipette) واححقن المحلول باستخدام دواسة القدم بعد عملية الحقن. أخرج الماصة الدقيقة وسجل طول المحلول المحقون.

باستخدام الفرجار الورني، احسب الحجم المحقون بناءً على المعاملات المعروفة للماصة الدقيقة، ثم اضبط الضغط وطول النبضة لطرد 0.3 µL من المحلول. بعد ذلك، جهز 20 نملة بيضاء لكل مجموعة علاجية من أجل الحقن، وذلك عن طريق الضغط أولاً على نهاية البطن باستخدام ملقط ناعم لإزالة أي إفرازات موجودة في المستقيم.

بعد ذلك، يتم تثبيت النمل الأبيض العامل عن طريق التبريد على الثلج لمدة خمس دقائق حتى يسكن النمل. اصنع مستقبلات لحفظ العمال عن طريق قطع أطراف ماصات سعة 100 microliter. باستخدام شفرة مشرط، اقطع الطرف بطول يتراوح من 10 إلى 12 millimeters واستخدمها وفقاً لحجم النمل ثم ضعها في قارورة.

باستخدام غطاء لولبي، قم بتثبيت المستقبل بالمتحكم الدقيق. ضع نملة عاملة على طبق بتري على جانبها الظهري، ثم قم بشفط العاملة من الرأس إلى داخل المستقبل باستخدام مضخة شفط نيتروجينية، بحيث يبرز طرف العاملة من المستقبل. وأثناء إمساك النملة في المستقبل، قم بدفع الإبرة المملوءة بعناية باستخدام المتحكم الدقيق لإدخالها في شرج العاملة. احقن 0.3 µL من اللجين المسمى فلوريسنتيًا أو الماء كمجموعة ضابطة.

ضع الشغالات التي حُقنت بالرابط أو بالماء في أطباق بتري منفصلة تحتوي على ورق ترشيح رطب، واحفظها طوال الليل عند درجة حرارة 26 درجة مئوية مع رطوبة نسبية تبلغ 78%. بعد مرور 24 ساعة، استخرج الأمعاء من النمل الأبيض المحقون واجمع البروتوزوا كما هو موضح سابقاً. افحص ارتباط الرابط في البروتوزوا المستخلصة من النمل الأبيض المحقون باستخدام المجهر الفلوري لتقييم الخصائص المحللة للببتيدات المحللة المقترنة بالرابط في النمل الأبيض الحي.

قم بتجهيز مواد الحقن والمعدات والنمل الأبيض كما تم القيام به سابقاً لعمليات الحقن، ثم احقن 0.3 µL من محلول الببتيد المحلل للرابطة بتركيز 500 µM أو الماء كمجموعة ضابطة في المعي الخلفي لـ 20 عاملاً من النمل الأبيض. بعد مرور 24 ساعة، استخرج الأمعاء من عدة عمال وافحص محتويات الأمعاء تحت المجهر بتكبير 200 مرة، وبمجرد التأكد من موت جميع الأوليات في أمعاء النمل الأبيض المعالج. احتفظ ببقية النمل الأبيض المعالج والمجموعات الضابطة في أطباق بتري تحتوي على ورق ترشيح رطب، وراقب معدل النفوق يومياً. نحن نؤكد أن الرابطة المقترنة بمسبار فلوري ترتبط بجميع الأنواع الثلاثة من الأوليات، وهي p grassi و h heart mani و sla.

من الأمعاء الخلفية لأربعة من النمل الأبيض تحت الأرضي من نوع mosson وبكثافات يمكن اكتشافها، حدث ارتباط الرابط (ligand) على سطح الخلية بالكامل وتركز في المنطقة الأمامية من الأوليات على المحور، وبالتحديد في طبقة من الأنابيب الدقيقة والنواة MP grass eye. كما رصدنا وميضاً فلورياً في جميع أنواع الأوليات الهوائية ذات الحياة الحرة التي تم اختبارها، مما يشير إلى أن الرابط يرتبط بتراكيب عامة في الأوليات. وبينما لم يُلاحظ أي ارتباط للرابط مع بكتيريا e coli، فإن تركيز 1 µM من الببتيد المحلل المرتبط بالرابط قد أدى إلى قتل الأنواع الثلاثة من الأوليات المستخلصة من أمعاء عمال النمل الأبيض من نوع omo والنمل الأبيض تحت الأرضي، وكذلك الأوليات ذات الحياة الحرة من نوع tea piriformis في المختبر خلال أقل من 10 دقائق، بينما ظلت مجموعة الضبط على قيد الحياة.

تظهر هذه الصورة الفقدان التدريجي لسلامة الغشاء في الأوليات الموجودة في أمعاء النمل الأبيض والمعالجة بـ ligand lytic peptide. لم يُلاحظ أي فرق في عدد مستعمرات e coli بين المعالجة بـ ligand lytic peptide والمعالجة بالماء؛ أما Litic peptide بدون ligand، فقد خفض عدد مستعمرات e coli بشكل كبير. يشير هذا إلى أن ربط ligand بـ lytic peptide يحمي الميكروبات غير المستهدفة من التحلل إلى حد ما. أدى حقن 0.3 µL من 500 µM من ligand lytic peptide إلى قتل الأنواع الثلاثة من الأوليات في أمعاء النمل الأبيض من نوع foremost والنمل الأبيض تحت الأرضي في غضون 24 ساعة، ونفق النمل الأبيض بعد 10 أيام من حقن ligand coupled litic peptide.

لقد نفقت الأوليات والنمل الأبيض بسرعة تزيد بثلاث مرات مقارنة بحقن الببتيدات المحللة غير المقترنة بربيطة كما هو موضح في husen and Colia 2009، مما يشير إلى أن الربيطة تزيد من كفاءة القتل الخلوي للأوليات بواسطة الببتيدات المحللة في ظل ظروف استنبات مثالية. يجب أن تظل الأنواع الثلاثة من الأوليات المستخلصة من أمعاء النمل الأبيض من نوع Omo. Subterranean حية وسليمة لمدة ثلاثة أيام على الأقل.

ومع ذلك، إذا بقيت رواسب من الأكسجين في الوسط، فإن حركة الأوليات تتوقف على الفور. وإذا استُخدم وسط غير مناسب وأصبح الضغط الأسموزي داخل الخلايا مرتفعاً جداً، فإن أغشية الأوليات تنتفخ ثم تنفجر. أما إذا انخفض الضغط الأسموزي في الخلايا بشكل كبير أو تضررت الأغشية، فإن الأوليات تتجعد وتنكمش. ويجعل تثبيت الأوليات من السهل اكتشاف ارتباط ربيطة المزدوج الفلوري بالأوليات.

من الصعب الكشف عن الفلورة وتمييزها عن الفلورة الذاتية لجزيئات الخشب عندما تتحرك الأوليات بحرية. وبمجرد إتقان هذه التقنية، يمكن حقن ما يقرب من 30 نملة بيضاء في الساعة بمساعدة مساعد. ورغم أن الببتيد الرابط المسبب لالتهاب القولون قد تم تطويره لقتل المتعايشات البروتوزومية في أمعاء النمل الأبيض تحت الأرض وبالتالي لمكافحة النمل الأبيض، إلا أنه قد يكون مفيداً أيضاً في تطوير أدوية ضد الطفيليات البروتوزومية مثل slash mania وponoma وte وodium، والتي تسبب العديد من الأمراض لدى البشر.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد حول كيفية الحصول على الأوليات المستخرجة من أمعاء النمل الأبيض والحفاظ عليها في المزرعة، وكيفية إظهار الارتباط النوعي لربيطة ما بالأوليات عبر المجهر الفلوري، وكيفية إثبات عمل الببتيد القولوني الربيطي في تحفيز الانتحار البروتوزوي في المختبر. وأخيراً وليس آخراً، كيفية حقن الببتيدات في أمعاء النمل الأبيض للتأكيد في الجسم الحي.