تشكيل خلية مستعمرة (CFC) للخلايا المكونة للدم الفحص الإنسان

مستعمرة تشكيل خلية (CFC) مقايسة هو فحص في المختبر الذي الأسلاف لدم شكل مستعمرات في وسط شبه صلبة. وتستخدم مجموعة من التشكل مستعمرة ، مورفولوجيا الخلايا ، والتدفق الخلوي لتقييم قدرة الأسلاف لتتكاثر والتفريق على طول الأنساب مختلفة للدم.

يقيم هذا الإجراء في وسط شبه صلب قدرة الأسلاف المكونة للدم على التكاثر والتمايز على طول سلالات المكونة للدم المختلفة لبدء الثقافة. إذابة حديثا CD 34 خلية إيجابية في وجود السيتوكينات لتعزيز التنشيط بعد يومين. قم بإجراء نقل الفيروسات القهقرية لبناء اختبار التعبير عن GFP عن طريق إضافة الخلايا الإيجابية CD 34 المنشطة إلى لوحة محملة مسبقا بالفيروس.

بعد 48 ساعة ، قم بعزل الخلايا الإيجابية ل GFP عن طريق الفاكس ، ثم قم بوضع هذه الخلايا في وسط ميثيل سلولوز شبه صلب مكمل بعوامل النمو تحتضن لمدة أسبوعين تقريبا حتى تظهر المستعمرات على السطح. أخيرا ، قم بحصاد المستعمرات ، وشل حركة الخلايا على الشرائح باستخدام السيتوزين وصمة عار مع الجيزة اليمنى للتحديد المجهري للنسب المكونة للدم ومرحلة النضج. يمكن أن توفر هذه الطريقة نظرة ثاقبة ميكانيكية في دراسات تكوين الكريات البيضاء ، أي تأثيرات الجينات المسرطنة على التمايز المكونة للدم.

من أجل رؤية ثقافة بسرعة ، قم بإذابة قارورة من الخلايا الموجبة CD 34 المجمدة عند 37 درجة مئوية عن طريق الرج برفق حتى تترك آخر بلورة جليدية صغيرة ونقل معلق الخلية إلى أنبوب مخروطي سعة 50 ملليلترا. اشطف الخلايا المتبقية برفق من القارورة بملليلتر واحد من درجة حرارة الغرفة ، و 2٪ وسائط F-B-S-I-M-D-M وأضفها بالتنقيط إلى أنبوب 50 مليلتر أثناء الدوران برفق. انتظر الآن لمدة ثلاث دقائق.

استمر بإضافة ملليلترين من الوسائط ببطء أثناء الخلط برفق وتوازن مرة أخرى لمدة ثلاث دقائق. كرر هذا الإجراء المتمثل في إضافة وسائط متساوية الحجم إلى تعليق الخلية المخفف على فترات ثلاث دقائق ، مع الدوران برفق بين الإضافات حتى يصل الحجم النهائي إلى 32 مليلترا لجمع أجهزة الطرد المركزي للخلايا عند 250 جم لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة وإزالة السوبر ، تاركا وراءه حوالي 0.5 ملليلتر من الوسائط فوق الحبيبات. استمر في غسل الخلايا مرة واحدة عن طريق تعليق الحبيبات في 20 مل من الوسائط والطرد المركزي عند 200 غرام لمدة ثماني دقائق في درجة حرارة الغرفة ، قم بإزالة العقل الخلايا في وسط IMDM كامل بحوالي نصف مليون خلية لكل ملليلتر.

أخيرا ، لتحديد تركيز الخلية ، خذ 10 ميكرولترات من المعلق في أنبوب صغير ممزوج بنفس الحجم البالغ 0.4٪ محلول أزرق ثلاثي الأبعاد وعدها. باستخدام مقياس الخلوي الدموي ، قم بتخفيف الخلايا إلى 10 إلى الخلايا الخامسة لكل مليلتر عن طريق إضافة وسيط IMDM كامل مكمل بمزيج من تنشيط ثقافة السيتوكينات ، والخلايا في حاضنة مرطب 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين في يوم العد الخلوي قبل بدء التحميل المسبق للفيروس لتحديد عدد الآبار التي سيتم تحضيرها من أجل إعداد لوحة زراعة الأنسجة غير المعالجة 24 جيدا. أضف 400 ميكرولتر من 25 ميكروغراما لكل مليلتر ، ومحلول أكتين رجعي لكل بئر واحتضانه لمدة ساعتين في درجة حرارة الغرفة في غطاء السلامة الحيوية للتدفق الرقائقي.

قم بإزالة محلول الأكتين الرجعي وقم بترميز كل بئر بنسبة 2٪ BSA عن طريق الحضانة لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة. في هذه الأثناء ، قم بإذابة حلول مخزون الفيروسات وتخزينها على الجليد. ثم استنشق فيروس تحميل محلول BSA عن طريق إضافة 0.5 ملليلتر من مستحضر الفيروس إلى كل بئر وجهاز طرد مركزي عند 2 ، 200 جم عند أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة.

قم بإزالة محلول الفيروسات من الآبار وكرر تحميل الفيروس ثلاث مرات أخرى. أخيرا ، اشطف كل بئر بوسيط IMDM بارد. الآن اجمع الخلايا الموجبة CD 34 المنشطة مسبقا عن طريق الطرد المركزي وأعد تعليق الخلايا في وسط IMDM كامل جديد مكمل بالسيتوكينات 0.15 مليون CD 34 خلية موجبة في كل من الآبار والآبار المشفرة للفيروس واحتضانها في حاضنة ترطيب 37 درجة مئوية مع 5٪ ثاني أكسيد الكربون لمدة يومين من أجل حصاد الخلايا المنقولة برفق ولكن بدقة.

قم بتعليق الخلايا من الألواح العائمة للفيروس وقم بتصفية المعلق من خلال مرشح خلية 50 ميكرون في أنبوب مخروطي الشكل. خذ 10 ميكرولتر من تعليق الخلية في أنبوب صغير. امزج بحجم متساو من محلول تريان الأزرق وعد الخلايا باستخدام مقياس الخلوي الدموي.

اشطف كل بئر ب 0.8 ملليلتر من HBSS البارد مع 0.02٪ EDTA وأضفه إلى نفس أنبوب التجميع من خلال مرشح خلية CEL Trix 50 ميكرون. بيليه الخلايا عن طريق الطرد المركزي واغسلها مرة واحدة باستخدام HBSS البارد. أعد تعليق حبيبات الخلية النهائية في HBSS مع 1٪ BA واحتفظ بالخلايا على الجليد في الظلام لفرز الخلايا اللاحق ، والذي يتم إجراؤه عادة في منشأة أساسية لفرز الخلايا عالية السرعة بناء على التصميم التجريبي.

قم بإذابة العدد المطلوب من الحصص من دوامة وسائط فحص CFC بقوة لخلطها واترك الأنبوب يقف لمدة خمس دقائق على الأقل للسماح للفقاعات بالارتفاع إلى السطح قبل إضافة الخلايا. الآن خذ 3000 خلية مصنفة منقولة بالفيروس إلى أنبوب دقيق معقم يحتوي على وسائط باردة 2٪ F-B-S-I-M-D-M واضبط حجم التعليق النهائي على 0.3 ملليلتر. قم بتعليق الخلايا ونقل تعليق الخلية بالكامل إلى ثلاثة ملليلتر من وسط نمو عبادة الميثيل.

قم بإنشاء تعليق خلوي متجانس عن طريق الدوامة بقوة. دع الأنبوب يقف ثابتا لمدة ثلاث دقائق. من أجل صفيحة الخلايا ، قم بإرفاق إبرة نهاية حادة عيار 16 بحقنة ثلاثة ملليلتر واسحب 2.2 ملليلتر.

مع الحرص على تجنب امتصاص الفقاعات الكبيرة ، ادفع 1.1 مليلتر لكل منهما إلى طبقين غير معالجين بحجم 30 ملم وقم بتوزيع الخليط بالتساوي عن طريق تدوير الألواح المكررة في صفيحة 100 ملم مع طبق ماء. الاستمرار في استزراع المياه المعقمة لمدة ثلاثة لترات لمدة أسبوعين. قم بتمييز المستعمرات وتسجيلها وفقا لمورفولوجيتها باستخدام مجهر مقلوب بتكبير 40 × في طبق ثقافة مميز بشبكة تسجيل.

من أجل توثيق نتائج الاستزراع ، قم بمسح لوحة فحص CFC بالكامل باستخدام ماسح ضوئي عادي بدقة 600 نقطة في البوصة والتقاط صور مجهرية منخفضة الطاقة للمستعمرات التمثيلية باستخدام مجهر مقلوب مزود بكاميرا ملونة لمزيد من التحليل لخلايا التمايز والتكاثر من لوحة فحص CFC بأكملها يتم استردادها عن طريق التعليق في عدة أحجام من درجة حرارة الغرفة 2٪ F-B-S-I-M-D-M غسلها وحسابها للتحليلات المورفولوجية. انقل 30،000 خلية تم استردادها من لوحات فحص CFC إلى شريحة. باستخدام جهاز طرد مركزي تدور STOs ، قم بتجفيف الشرائح بالهواء طوال الليل لتلطيخ الشرائح بكفاءة.

قم بإعداد خط تجميع من تسع أوعية تلطيخ تحتوي على محاليل بالترتيب التالي. محلول مخزون الميثانول الصحيح المطلق gemsa المخزن المؤقت الصحيح ، 50٪ الميثانول والماء ، وعاءان من عازلة فوسفات الماء درجة الحموضة ستة وأخيرا وعاءين من الماء. ضع الشرائح في حامل منزلق واغمس في الميثانول المطلق لمدة دقيقتين وقم بإزالة الميثانول الزائد.

اغمس حامل الشرائح على الفور واكتب محلول مخزون gemsa لمدة خمس دقائق. انقل الحامل إلى المخزن المؤقت الأيمن gemsa pH 6.4 واحتضنه لمدة 10 دقائق. اغمس الناقل مرتين في 50٪ من الميثانول 10 مرات في الماء و 10 مرات أخرى في وعاء الماء التالي ثم خمس مرات في مخزن الفوسفات.

الرقم الهيدروجيني 6.0. انقل الحامل إلى الماء واحتضنه لمدة دقيقتين. كرر الغسيل في آخر وعاء مائي.

الآن اسمح للشرائح بالجفاف تماما في الحامل. قم بإزالة كل شريحة وامسح الجزء الخلفي من الشريحة بمناديل كيم مبللة بالميثانول لإزالة البقع. ضع قطرة من ختم cyto 60 وغطاء زجاجي لإغلاقه.

قم بإجراء عد تفاضلي ل 500 خلية لكل شريحة مستدامة من GM باستخدام المجهر. لأغراض هذه التجربة ، تنقسم الخلايا إلى خمس فئات ، الخلايا البدائية ، والخلايا النخاعية الوسيطة ، والخلايا النخاعية الناضجة ، والخلايا الحمراء الوسيطة ، وخلايا الكريات الحمراء الناضجة. على سبيل المثال ، عند مقارنتها بالتحكم في التعبير عن 98 صقرا جديدا ، زاد تسعة جينات ورمية من تكوين مستعمرات الكريات الحمراء الحمراء.

يتضح تأثير السوق هذا للجين الورمي بوضوح عندما يتم ملاحظة المستعمرات تحت تكبير منخفض. يوفر الفحص المورفولوجي الإضافي بواسطة الحفاظ على GEM معلومات عن النسب ودرجة نضج مجموعة الخلايا. في هذا المثال ، تسبب إدخال 98 صقور جديدة ، تسعة ، في زيادة إجمالية في أعداد الخلايا المصابة بتضخم الكريات الحمراء وتثبيط كل من نضوج الكريات الحمراء والنخاعية.

يوفر SA نظرة ثاقبة لتمايز الخلايا المكونة للدم من خلال قياس قدرة تحضير خلية الإدخال على التكاثر والتمايز وتشكيل المستعمرات في وسط شبه صلب.