Microfabricated المنصات الحيوي للثقافة الخلية ميكانيكيا

الهدف العام من التجربة التالية هو التصنيع الدقيق لأجهزة تُستخدم لتحفيز الخلايا ميكانيكيًا في بيئات زراعة ثنائية وثلاثية الأبعاد. ويتم تحقيق ذلك باستخدام تقنية القولبة والترصيص الشطيرية متعددة الطبقات لإنتاج مصفوفة من الركائز الدقيقة التي يتم تشغيلها رأسيًا. وكخطوة ثانية، يتم تعديل مصفوفة الركائز الدقيقة ذات التشغيل الرأسي لتمديد غشاء زراعة، مما يطبق إجهادات محكومة بدقة على الخلايا المزروعة على الغشاء.

بدلاً من ذلك، يمكن تعديل المصفوفة لضغط بنى المواد الحيوية ذات الأنماط الدقيقة من أجل تطبيق تحفيز ميكانيكي على الخلايا. وتؤدي الزراعة في مصفوفة من الهيدروجيلات ثلاثية الأبعاد إلى الحصول على نتائج تظهر التطبيق المتزامن لمجموعة من سلالات الانضغاط ثنائية المحور ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد عبر المصفوفة بناءً على تحليل الصور لعلامات مرجعية فلورية. مرحباً، أنا كريس ماريا من مختبرات كريغ سيمونز ويو سون في قسم الهندسة الميكانيكية والصناعية ومعهد المواد الحيوية والهندسة الطبية الحيوية في جامعة تورنتو.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لتصنيع أجهزة مجهرية تُستخدم لتحفيز الخلايا ميكانيكيًا. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة كيفية استجابة الخلايا لمجموعة متنوعة من القوى الميكانيكية في المزارع المخبرية. لذا، فلنبدأ.

تتضمن عملية تصنيع قالب الساندوتش وضع شريحة شفافة علوية فوق مادة بولي ديميثيل سيلوكسان (PDMS) غير المعالجة على قالب رئيسي من مادة SU-8. يتم وضع "الساندوتش" في مجموعة من الرغوة الزجاجية والمعدن، ثم يُعالج في فرن تحت الضغط. وفي النهاية، يتم تفكيك المجموعة ونزع الشريحة الشفافة مع الاحتفاظ بطبقة PDMS المطبوعة.

لبدء هذه العملية، اخلط PDMS والمونومر وعامل التشبيك جيداً. وبنسبة قياسية تبلغ 10 إلى 1، ضع 3 milliliters من خليط PDMS غير المتصلب فوق قالب SU eight مُصنّع مسبقاً، ثم قم بإزالة فقاعات الغاز من البوليمر في غرفة تفريغ. بعد ذلك، ضع الوسادة الرغوية وقالب SU eight على لوحة قاعدة من البلكسي جلاس.

أَنْزِلْ الجانب الأملس لورقة شفافية نفث الحبر بعناية فوق الـ PDMS غير المعالج، مع الحرص على تجنب حبس أي فقاعات هوائية. ثم ضع شريحة زجاجية مُعالجة بالسيلون (Siloized) فوق الشفافية تحت وسادة الرغوة الثانية وصفيحة علوية من البلكسي جلاس. ثبّت هذه الطبقات معاً باستخدام مشبك C clamp.

قم بمعالجة شطيرة PDMS في فرن عند 80 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل. بعد انتهاء المعالجة، أخرج الشطيرة من الفرن واتركها تبرد. وبمجرد أن تبرد، قم بإزالة المشبك وتفكيك الشطيرة.

قم بإزالة الشفافية بعناية عن قالب SU-8 مع الاحتفاظ بطبقة PDMS الرقيقة. قم بتشذيب حواف فيلم النمط لإزالة الزوائد من PDMS، ثم خزن طبقات النمط في بيئة خالية من الغبار حتى يحين وقت استخدامها. يتضمن الجزء التالي من هذا البروتوكول إنشاء مصفوفة مصنعة دقيقاً من الأعمدة التي يتم تحريكها رأسياً.

تتطلب عملية تصنيع متعددة الطبقات لإنشاء مصفوفة من الأعمدة الدقيقة. يتم تحضير طبقة PDMS المنقوشة السفلية عن طريق تصنيع قالب شطيرة. في هذه التجارب، تم استخدام أنماط دائرية يتراوح قطرها من 600 إلى 1,200 ميكرون.

من أجل نقل طبقة PDMS إلى شريحة زجاجية نظيفة، استخدم وحدة تفريغ كورونا لمعالجة سطحي PDMS والزجاج ببلازما الأكسجين. ثم ضع السطحين في تلامس مع بعضهما البعض. ضع المجموعة على لوح تسخين عند 80 °C لمدة 10 دقائق لإتمام عملية الربط.

قم بنزع الغشاء الشفاف والتخلص منه. تضمن هذه العملية عدم تحرير فيلم PDMS المنقوش من ركيزة صلبة، مما يمنع انكماش الطبقات الفردية. يتم تشكيل طبقة القالب الساندوتشي الثانية كقالب نسخ سلبي للحجاب الحاجز وبنية العمود المرغوب فيها.

في هذا العرض التوضيحي، استُخدمت قوائم دائرية بقطر 500 ميكرون لتشكيل هذه الطبقة. أولاً، ثبت قالب النسخة السالبة مؤقتاً على شريحة زجاجية باستخدام شريط لاصق مزدوج الوجه، وفي مجفف تفريغ هوائي، يتم ترسيب PDMS غير المعالج على طبقة القالب في وضعية الساندوتش، ثم يتم تفريغ الغاز والطلاء الدوراني لمدة 45 ثانية وبسرعة 1000 دورة في الدقيقة، مما ينتج عنه حجاب تشغيل بسمك 60 ميكرون، ثم يتم معالجة طبقة PDMS المطلية دورانياً جزئياً عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تقريباً أو حتى يصبح PDMS لزجاً ولكن دون أن يتشوه بشكل دائم عند لمسه. بعد ذلك، تُزال الشريحة الزجاجية والشريط اللاصق مزدوج الوجه من طبقة PDMS المعالجة جزئياً وفيلم الشفافية، ثم تُثبت على زوج من شرائح المناولة الزجاجية وتُعالج بالبلازما.

قم بمعالجة PDMS الذي تم تصلبه جزئياً، ثم اقلب PDMS وضعه في أداة محاذاة مصنعة خصيصاً. تتكون أداة المحاذاة من رأس تثبيت تفريغي مثبت على مناور دقيق. بعد ذلك، قم بمعالجة طبقة PDMS الأولى بالبلازما، ثم ضعها على منصة دوارة أسفل رأس التثبيت التفريغي.

لاحظ المحاذاة بين الطبقتين باستخدام نظام رؤية آلية بتكبير 12 مرة. وباستخدام المناول، قم بمحاذاة الطبقات ثم اجعلها تتلامس بعناية. اضغط ضغطاً خفيفاً بإصبعك لإلصاق الطبقتين معاً.

بعد ذلك، قم بإزالة الشطيرة من أداة المحاذاة. أزل شرائح مناولة الزجاج وتأكد من أن الطبقات في حالة تلامس كامل مع بعضها البعض. قم بالمعالجة في فرن عند 80 degrees Celsius لمدة 30 minutes إضافية.

بعد مرور 30 دقيقة، يمكن نزع قالب PDMS الشفاف والمطلي بالسيلوكسان من الجهاز والتخلص منه. ثم يتم معالجة الجهاز بالكامل عند درجة حرارة 80 °C لمدة أربع ساعات على الأقل لإجراء التجارب على الخلايا المستزرعة على ركيزة ثنائية الأبعاد قابلة للتشوه. ويتم تعديل مصفوفة المشغلات الدقيقة عن طريق لصق طبقة ثالثة من PDMS بالجهاز.

تتكون طبقة PDMS الثالثة من هيكل مكون من طبقتين. وتتطابق الدائرة السفلية في الحجم مع تجويف التشغيل الموجود أسفل الركائز الدقيقة التي يتم تشغيلها. أما قطر الدائرة العلوية فهو أكبر بـ 100 microns من قطر ركائز التحميل.

تربط قناة دقيقة بعرض 200 micron هذه المعالم بمنطقة توصيل، وستُستخدم لتزييت أعمدة التحميل وغشاء المزرعة. لتعديل الجهاز من أجل المزرعة ثنائية الأبعاد (2D culture)، قم أولاً بتصنيع الموصلات وربطها بالجهاز كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. بعد ذلك، قم بطلاء طبقة من PDMS بسمك يتراوح من 10 إلى 15 micron باستخدام الطلاء الدوراني على الجانب الأملس من شريحة شفافة ثم قم بمعالجتها.

يُترك غشاء PDMS الرقيق عند درجة حرارة 80 °C لمدة أربع ساعات على الأقل. الخطوة التالية هي تطبيق تفريغ هوائي على المشغلات الميكانيكية لربط طبقة PDMS بالجهاز. ولتحقيق ذلك.

أولاً، يتم تطبيق فراغ منخفض المستوى على المشغلات لخفض مصفوفة الأعمدة المعالجة بالبلازما والمترابطة. يتم طلاء غشاء PDMS بالتدوير على الجهاز الدقيق المُشغل كما هو موضح في البروتوكول المكتوب، حيث ستظل الأعمدة وغشاء المزرعة محبة للماء لفترة قصيرة. بعد ذلك، يتم توصيل حقنة التشحيم بالجهاز وملء قنوات التشحيم بمحلول يتكون من 90% glycerol في ماء منزوع الأيونات.

بالإضافة إلى التزييت، تحافظ هذه التركيبة على خاصية محبة الماء لـ PDMS إلى أجل غير مسمى، مما يقلل من معاملات الاحتكاك. ضع الجهاز على لوح تسخين عند 40 °C واستمر في حقن المزلق داخل القناة، مما يؤدي إلى زيادة طفيفة في الضغط. وبعد بضع دقائق، ستنتشر الفقاعات الهوائية عبر PDMS وتصبح جميع الأسطح مزلقة.

في الخطوة النهائية، قم بإزالة الضغط السلبي لتحرير الركائز باستخدام مشرط. قم بالقص حول غشاء PDMS الرقيق. انزع بعناية الطبقة الخلفية الشفافة بعيداً عن رابط البلازما للجهاز.

حشوة من مادة PDMS مقصوصة يدوياً حول منطقة استزراع الجهاز. يتم تعقيم الجهاز بنقعه في ethanol بتركيز 70% لمدة خمس دقائق، يليه المعالجة تحت ضوء UV مبيد للجراثيم داخل كابينة السلامة البيولوجية لمدة 45 دقيقة. تُعالج السطوح بالبلازما، ثم تُحضن مع collagen بتركيز 100 µg/mL طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C.

بعد التحضين طوال الليل، اغسل الجهاز بمحلول ملحي منظم بالفوسفات معقم أو PBS واستزرع الخلايا بمعدل 10 إلى 15,000 خلية لكل سنتيمتر مربع. وفقاً لبروتوكولات زراعة الخلايا القياسية، يمكن تعديل مصفوفة المشغل الميكروي لإجراء تجارب على خلايا مستزرعة في بنى هيدروجيل ثلاثية الأبعاد منقوشة ضوئياً. أولاً، يتم تصنيع منصة متعددة الطبقات تعتمد على PDMS.

بعد تغطية المنصة الأساسية بطبقة من الميث، يتم حقن محلول سلائف هيدروجيل لغطاء زجاجي ذي صلة. ثم يتم تشكيل مادة حيوية قابلة للبولمرة الضوئية في المصفوفة بنمط دقيق، ويتم غسل محلول السلائف المتبقي. يمكن بعد ذلك استخدام مصفوفة أعمدة التحميل التي يتم تفعيلها رأسيًا لتطبيق قوى ميكانيكية ضاغطة على الخلايا المستنبتة في مواد حيوية ثلاثية الأبعاد، مع استخدام قطع من الشريط اللاصق لتغطية المناطق المحيطة بالأعمدة لطلاء الجهاز بمادة paraline C في نظام PDS 2010 lab COTER two.

سيؤدي ذلك إلى تحسين حركية البلمرة لنظام المادة الحيوية. بمجرد الانتهاء من الطلاء، قم بإزالة الجهاز من نظام الطلاء وانزع شريط scotch، مما يترك طبقة متوافقة من paraline C فوق القوائم. بعد ذلك، قم بتمثيل شريحة غطاء ACRL الزجاجية عن طريق الغمر في محلول بتركيز 2% حجم/حجم من three trimeth oxy profile Methacrylate في 95%ethanol لمدة دقيقتين.

اشطف الغطاء. اغمره في 100%ethanol، ثم قم بتسخينه عند 100 degrees Celsius، لترك مجموعات الميثاكريلات على السطح. قم بصهر فاصل PDMS بسماكة 200 micron.

ضع الغشاء في طبق بتري وقطعه إلى أقسام صغيرة. قم بربط أربعة من هذه الأقسام الصغيرة باستخدام البلازما حول حافة شريحة التغطية المتعلقة بـ meac. ثم قم بربط الفراغات باستخدام البلازما بمناطق PDMS في الجهاز التي تغطي الطبقة المطلية بـ Lene C.

أخيراً، يتم تعقيم الجهاز عن طريق الغسل بـ 70%ethanol وتعريضه لمادة قاتلة للجراثيم أو للأشعة فوق البنفسجية UV في كبينة السلامة البيولوجية لمدة 45 دقيقة. ولتوزيع هيدروجيلات PEG المحملة بالخلايا داخل الأجهزة باستخدام الطباعة الحجرية الضوئية، يتم تحضير محاليل السلائف والبادئ الضوئي كما هو موضح في البروتوكول المكتوب، وخلطها جيداً للحصول على محلول بتركيز 0.4% وزن/حجم من البادئ الضوئي.

قم بترشيح الخليط باستخدام مرشح محقنة بمسامية 0.45 micron لتعقيمه وإزالة الجسيمات، ثم قم بتثليج مزارع الخلايا بالتربسين (trypsin)، وحضّر معلقاً خلوياً في وسط استزراع بتركيز خلوي يبلغ ضعف التركيز النهائي المطلوب. بعد ذلك، اخلط المعلق الخلوي ومحلول البادئ الضوئي لسلف الهيدروجيل المُرشح بنسبة واحد إلى واحد. احقن المحلول في الجهاز الدقيق باستخدام إبرة طويلة قياس 25 gauge.

تجنب بعناية حبس الفقاعات داخل الجهاز. قم بمحاذاة قناع شفاف مطبوع مع علامات المحاذاة الموجودة على سطح الجهاز. قم بإعداد نظام إضاءة UV لتوفير جرعة UV بطول موجي 365 nanometer وبقدرة 17.5 milliwatt per square centimeter عند سطح الجهاز.

قم بتسليط الضوء على الهيدروجيل من خلال القناع لمدة 195 ثانية بعد الإضاءة. اغسل محلول بادئ الهيدروجيل غير المبلمر باستخدام PBS واستبدل PBS بوسط زراعي، ثم قم بتفعيل أعمدة التحميل لضغط هياكل الهيدروجيل. يظهر هنا جهاز عينة مكتمل للزراعة التحفيزية الميكانيكية ثنائية الأبعاد (2D).

تُستخدم الصبغة الحمراء لتمييز قنوات توصيل ضغط التشغيل، بينما تُستخدم الصبغة الزرقاء لتمييز قنوات التشحيم في توصيف الانفعال. ويمكن استخدام التجارب لتحديد مجالات الانفعال المطبقة عن طريق تتبع حركة الخرزات الفلورية على الركائز. تمثل النقاط الحمراء مواقع الخرزات قبل التشكل، بينما تمثل النقاط الخضراء المواقع بعد التشوه.

يمكن رؤية نموذج لجهاز تجارب الضغط ثلاثية الأبعاد هنا، حيث استُخدم صبغ أخضر لتمييز قنوات ضغط التشغيل. ويكشف المنظر العلوي لمصفوفة الأعمدة الدقيقة عن بنية الهيدروجيل المطبوعة فوق الأعمدة، بينما تظهر الصور المعاد بناؤها لجانب الأعمدة لكرات فلورية داخل بنية الهيدروجيل. وتوضح الصور تحت ضغوط التشغيل في حالة الراحة وعند 55 kilo pascal عملية توصيف الانفعال في نظام زراعة ثلاثي الأبعاد.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية تصنيع الأجهزة المستخدمة لتحفيز الخلايا ميكانيكياً في أنظمة زراعة ثنائية أو ثلاثية الأبعاد. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على نظافة الأجهزة وخلوها من الغبار قدر الإمكان، والتحلي بالصبر، خاصة خلال خطوات المحاذاة. وهذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.