Microfabricated المنصات الحيوي للثقافة الخلية ميكانيكيا

الهدف العام من التجربة التالية هو التصنيع الدقيق لأجهزة تُستخدم لتحفيز الخلايا ميكانيكياً في بيئات استزراع ثنائية وثلاثية الأبعاد. ويتم تحقيق ذلك باستخدام تقنية القولبة والتراص الشطيرية متعددة الطبقات لإنتاج مصفوفة من الأعمدة الدقيقة التي يتم تحريكها رأسياً. وفي خطوة ثانية، يتم تعديل مصفوفة الأعمدة الدقيقة ذات التحريك الرأسي لشد غشاء استزراع، مما يطبق إجهادات محكومة بدقة على الخلايا المستزرعة على الغشاء.

بدلاً من ذلك، يمكن تعديل المصفوفة لضغط هياكل المواد الحيوية ذات الأنماط الدقيقة من أجل تطبيق تحفيز ميكانيكي على الخلايا. تؤدي الزراعة في مصفوفة من الهيدروجيلات ثلاثية الأبعاد إلى الحصول على نتائج تظهر التطبيق المتزامن لمجموعة من سلالات الضغط ثنائية المحور ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد عبر المصفوفة، وذلك بناءً على تحليل الصور لعلامات مرجعية فلورية. مرحباً، أنا كريس مارياه من مختبرات كريج سيمونز و يو سون في قسم الهندسة الميكانيكية والصناعية ومعهد المواد الحيوية والهندسة الطبية الحيوية بجامعة تورنتو.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لتصنيع أجهزة دقيقة تُستخدم لتحفيز الخلايا ميكانيكياً. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة كيفية استجابة الخلايا لمجموعة متنوعة من القوى الميكانيكية في المزارع الخلوية خارج الجسم (in vitro). لذا، فلنبدأ.

تتضمن عملية تصنيع قالب الساندوتش وضع شريحة شفافة علوية فوق مادة poly dimethyl siloxane أو PDMS غير المعالجة والموضوعة على قالب SU-8 أساسي. يُوضع الساندوتش داخل مكدس من الزجاج الرغوي والمعدن، ثم يُعالج في فرن تحت الضغط. وأخيراً، يتم تفكيك المكدس وإزالة الشريحة الشفافة، مما يترك طبقة PDMS ذات النمط المحدد.

لبدء هذه العملية، امزج PDMS والمونومر والرابط التشابكي جيداً. وبنسبة قياسية تبلغ 10 إلى 1، ضع ثلاثة مليلترات من مزيج PDMS غير المعالج فوق قالب SU8 مُصنع مسبقاً، ثم قم بتفريغ البوليمر في غرفة تفريغ. بعد ذلك، ضع وسادة الرغوة وقالب SU8 على لوحة قاعدة من البلكسي غلاس.

أنزل الجانب الأملس لورقة الشفافية الخاصة بالطابعة النافثة للحبر بعناية فوق الـ PDMS غير المعالج، مع الحرص على تجنب حبس أي فقاعات هوائية. بعد ذلك، ضع شريحة زجاجية معالجة بالسيلان فوق ورقة الشفافية أسفل وسادة الرغوة الثانية ولوح علوي من البليكسي جلاس. ثبّت هذه الطبقات معاً باستخدام مشبك C.

قم بمعالجة شطيرة PDMS في فرن عند درجة حرارة 80 °C لمدة أربع ساعات على الأقل. بعد المعالجة، أخرج الشطيرة من الفرن واتركها لتبرد. وبمجرد أن تبرد، قم بإزالة المشبك وتفكيك الشطيرة.

قُم بنزع غشاء الشفافية بعناية عن قالب SU-8 مع الاحتفاظ بغشاء PDMS الرقيق. قُم بتقليم حواف غشاء النمط لإزالة الزوائد من مادة PDMS، ثم خَزِّن طبقات النمط في بيئة خالية من الغبار حتى يحين وقت استخدامها. يتضمن الجزء التالي من هذا البروتوكول بناء مصفوفة مُصنعة ميكروياً من أعمدة ذات تشغيل رأسي.

تتطلب عملية تصنيع متعددة الطبقات لإنشاء مصفوفة من الأعمدة الدقيقة. يتم تحضير طبقة PDMS المنقوشة السفلى عن طريق تصنيع القالب الشطائري. وفي هذه التجارب، استُخدمت أنماط دائرية يتراوح قطرها من 600 إلى 1,200 ميكرون.

من أجل نقل طبقة PDMS إلى شريحة زجاجية نظيفة، استخدم وحدة تفريغ كورونا لمعالجة أسطح PDMS والزجاج ببلازما الأكسجين. ثم ضع السطحين في حالة تلامس مع بعضهما البعض. ضع المجموعة على لوح تسخين عند درجة حرارة 80 °C لمدة 10 دقائق لإتمام عملية الربط.

قم بإزالة الغشاء الشفاف وتخلص منه. تضمن هذه العملية عدم تحرير فيلم PDMS المنقوش من الركيزة الصلبة، مما يمنع انكماش الطبقات الفردية. يتم تشكيل طبقة القالب الساندوتشي الثانية كقالب نسخة سالبة للحجاب الحاجز وبنية العمود المطلوبة.

في هذا العرض التوضيحي، استُخدمت دعامات دائرية بقطر 500 ميكرون لتشكيل هذه الطبقة. أولاً، يتم تثبيت قالب النسخة السلبية مؤقتاً على شريحة زجاجية باستخدام شريط لاصق مزدوج الوجه، ثم يتم ترسيب PDMS غير المعالج على طبقة القالب في مجفف فراغي. يتم التخلص من الفقاعات الهوائية والطلاء الدوراني لمدة 45 ثانية وبسرعة 1000 دورة في الدقيقة لإنتاج حجاب تحفيزي بسمك 60 ميكرون. يتم معالجة طبقة PDMS المطلية دورانيًا جزئياً عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبًا أو حتى يصبح PDMS لزجاً ولكن لا يتشوه بشكل دائم عند لمسه. تُزال الشريحة الزجاجية والشريط اللاصق مزدوج الوجه من طبقة PDMS المعالجة جزئياً وفيلم الشفافية، ثم يتم تثبيتها على زوج من شرائح المناولة الزجاجية وتُعرض للبلازما.

قم بمعالجة PDMS الذي تمت معالجته جزئياً، ثم اقلب PDMS وضعه في أداة محاذاة مصنعة خصيصاً. تتكون أداة المحاذاة من قطعة تثبيت مفرغة من الهواء مثبتة على ميكرو-مناور. بعد ذلك، قم بمعالجة طبقة PDMS الأولى بالبلازما، ثم ضعها على منصة دوارة أسفل قطعة التثبيت المفرغة.

لاحظ المحاذاة بين الطبقتين باستخدام نظام رؤية آلية بزيادة تكبير تصل إلى 12 مرة. وباستخدام الملقط، قم بمحاذاة الطبقات وتقريبهما من بعضهما بحذر حتى يتلامسا. طبق ضغطاً خفيفاً بإصبعك لإلصاق الطبقتين معاً.

ثم أخرج الشطيرة من أداة المحاذاة. قم بإزالة شرائح المناولة الزجاجية وتأكد من أن الطبقات في حالة تلامس كامل مع بعضها البعض. يتم الإنضاج في فرن عند 80 درجة Celsius لمدة 30 دقيقة إضافية.

بعد مرور 30 دقيقة، يمكن نزع قالب PDMS الشفاف والمطلي بمادة السيلون من الجهاز والتخلص منه. ثم يتم معالجة الجهاز بالكامل عند درجة حرارة 80 °C لمدة أربع ساعات على الأقل لإجراء تجارب على خلايا مستنبتة على ركيزة ثنائية الأبعاد قابلة للتشوه. ويتم تعديل مصفوفة المشغلات الدقيقة عن طريق ربط طبقة ثالثة من PDMS بالجهاز.

تتكون طبقة PDMS الثالثة من بنية ذات طبقتين. تتطابق الدائرة السفلية في الحجم مع تجويف التشغيل الموجود أسفل القوائم الدقيقة التي يتم تحريكها. ويكون قطر الدائرة العلوية أكبر بـ 100 ميكرون من قطر قوائم التحميل.

تربط قناة دقيقة بعرض 200 micron هذه المعالم بمنطقة توصيل، وتُستخدم لتزييت أعمدة التحميل وغشاء المستنبت. لتعديل الجهاز من أجل الاستنبات ثنائي الأبعاد (2D culture)، قم أولاً بتصنيع الموصلات وربطها بالجهاز كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. ثم قم بطلاء طبقة من PDMS بسماكة تتراوح بين 10 إلى 15 micron على الجانب الأملس لرقاقة شفافة ثم قم بمعالجتها.

يتم وضع غشاء PDMS الرقيق عند درجة حرارة 80 °C لمدة أربع ساعات على الأقل. الخطوة التالية هي تسليط تفريغ هوائي على المشغلات وربط طبقة PDMS بالجهاز. ولتحقيق ذلك.

أولاً، يتم تطبيق تفريغ منخفض المستوى على المشغلات لخفض مصفوفة القوائم التي تمت معالجتها بالبلازما وربطها. يتم طلاء غشاء PDMS بالتدوير على الجهاز الميكروي المشغل كما هو موضح في البروتوكول المكتوب، وستظل القوائم وغشاء المزرعة محبة للماء لفترة قصيرة. ثم قم بتوصيل سرنجة التزييت بالجهاز وملء قنوات التزييت بمحلول يتكون من 90% glycerol في ماء منزوع الأيونات.

بالإضافة إلى التزييت، تحافظ هذه التركيبة على خاصية المحبة للمياه لـ PDMS إلى أجل غير مسمى، مما يقلل من معاملات الاحتكاك. ضع الجهاز على لوح تسخين عند 40 درجة Celsius واستمر في حقن المزيّت داخل القناة، مما يتسبب في زيادة طفيفة في الضغط. بعد بضع دقائق، ستنتشر فقاعات الهواء عبر PDMS وتصبح جميع الأسطح مزيتة.

في الخطوة النهائية، قم بإزالة الضغط السلبي لتحرير القوائم باستخدام مشرط. اقطع حول غشاء PDMS الرقيق. ثم قم بتقشير الطبقة الخلفية الشفافة بعناية بعيداً عن رابط البلازما الخاص بالجهاز.

حاشية من مادة PDMS مقصوصة يدويًا حول منطقة استزراع الجهاز. يتم تعقيم الجهاز بنقعه في إيثانول بتركيز 70% لمدة خمس دقائق، يليه المعالجة تحت ضوء UV مبيد للجراثيم في كابينة السلامة البيولوجية لمدة 45 دقيقة. تُعالج السطح بالبلازما ثم تُحضن مع كولاجين بتركيز 100 micrograms per milliliter طوال الليل عند درجة حرارة أربعة degrees Celsius.

بعد التحضين طوال الليل، اغسل الجهاز بمحلول ملحي منظم بالفوسفات معقم أو PBS وقم باستزراع الخلايا بكثافة تتراوح من 10 إلى 15,000 خلية لكل سنتيمتر مربع. وفقاً لبروتوكولات زراعة الخلايا القياسية، يمكن تعديل مصفوفة المشغلات الدقيقة لإجراء تجارب على خلايا مستزرعة في هياكل هيدروجيل ثلاثية الأبعاد ذات أنماط ضوئية. أولاً، يتم تصنيع منصة متعددة الطبقات قائمة على مادة PDMS.

بعد تغطية المنصة الأساسية بمادة الميثاكريلات، يتم حقن محلول طليعي للهيدروجيل لغطاء زجاجي ذي صلة. ثم يتم تشكيل مادة حيوية قابلة للارتباط بالبوليمر الضوئي في مصفوفة بأنماط دقيقة، ويتم غسل محلول الطليعي المتبقي. ويمكن بعد ذلك استخدام مصفوفة أعمدة التحميل التي يتم تفعيلها رأسيًا لتطبيق قوى ميكانيكية ضاغطة على الخلايا المستزرعة في مواد حيوية ثلاثية الأبعاد، مع استخدام قطع من الشريط اللاصق لتغطية المناطق المحيطة بالأعمدة لطلاء الجهاز بمادة paraline C في نظام PDS 2010 lab COTER two.

سيؤدي ذلك إلى تحسين حركية البلمرة لنظام المادة الحيوية. وبمجرد الانتهاء من الطلاء، أخرج الجهاز من نظام الطلاء وقم بإزالة شريط scotch، مما يترك طبقة متوافقة من paraline C فوق القوائم. بعد ذلك، قم بمعالجة شريحة الغطاء الزجاجية ACRL عن طريق الغمر في محلول تركيزه 2% حجم/حجم من three trimeth oxy profile Methacrylate في 95% ethanol لمدة دقيقتين.

اشطف الغطاء. اغمره في ethanol بتركيز 100%، ثم قم بتسخينه عند 100 °C، مما يترك مجموعات الميثاكريلات على السطح. صب فاصل PDMS بسمك 200 micron.

ضع غشاءً في طبق بتري وقطعه إلى أقسام صغيرة. قم بربط أربعة من هذه الأقسام الصغيرة باستخدام البلازما حول حافة شريحة الغطاء المرتبطة بـ meac. بعد ذلك، قم بربط الفراغات باستخدام البلازما بمناطق PDMS في الجهاز بحيث تغطي الطبقة المطلية بـ Lene C.

أخيراً، يتم تعقيم الجهاز بالغسل في 70% ethanol وتعريضه لمبيد جراثيم أو للأشعة فوق البنفسجية UV في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 45 دقيقة. ولتشكيل هيدروجيلات PEG المحملة بالخلايا داخل الأجهزة باستخدام الطباعة الحجرية الضوئية، يتم تحضير محاليل السلائف والبادئ الضوئي كما هو موضح في البروتوكول المكتوب ومزجها جيداً للحصول على محلول بتركيز 0.4% وزن/حجم من البادئ الضوئي.

قم بترشيح الخليط عبر مرشح سرنجة بمسامية 0.45 micron للتعقيم وإزالة الجسيمات، ثم قم بهضم مزارع الخلايا الجليدية باستخدام trypsin، وحضّر معلقاً خلوياً في وسط استزراع بتركيز خلايا يعادل ضعف التركيز النهائي المطلوب. بعد ذلك، اخلط المعلق الخلوي ومحلول البادئ الضوئي لسلف الهيدروجيل المُرشح بنسبة واحد إلى واحد. احقن المحلول في الجهاز الدقيق باستخدام إبرة طويلة قياس 25 gauge.

تجنب بعناية حبس الفقاعات داخل الجهاز. قم بمحاذاة قناع شفاف مطبوع مع علامات المحاذاة الموجودة على سطح الجهاز. قم بإعداد نظام إضاءة UV لتوفير جرعة UV بطول موجي 365 nanometer وبقدرة 17.5 milliwatt per square centimeter عند سطح الجهاز.

قم بتسليط الضوء على الهيدروجيل من خلال القناع لمدة 195 ثانية بعد بدء الإضاءة. اغسل محلول طليعة الهيدروجيل غير المتبلمر باستخدام PBS واستبدل PBS بوسط استزراع، ثم قم بتفعيل أعمدة التحميل لضغط بنيات الهيدروجيل. يظهر هنا جهاز عينة مكتمل مخصص للاستزراع التحفيزي الميكانيكي ثنائي الأبعاد 2D.

يُستخدم الصبغ الأحمر لتمييز قنوات توصيل ضغط التشغيل، بينما يُستخدم الصبغ الأزرق لتمييز قنوات التشحيم الخاصة بتوصيف الانفعال. ويمكن استخدام التجارب لتحديد مجالات الانفعال المطبقة عن طريق تتبع حركة الخرزات الفلورية على الركائز. تمثل البقع الحمراء مواقع الخرزات قبل التشكل، بينما تمثل البقع الخضراء المواقع بعد التشوه.

يمكن رؤية جهاز عينة للتجارب الانضغاطية ثلاثية الأبعاد هنا، حيث استُخدم صبغ أخضر لتمييز قنوات ضغط التشغيل. ويكشف المنظر العلوي لمصفوفة الأعمدة الدقيقة عن بنية الهيدروجيل المنقوشة فوق الأعمدة، وصوراً مُعاد تركيبها من الجانب لخرزات فلورية داخل بنية الهيدروجيل. وتوضح هذه الصور عملية توصيف الانفعال في نظام استزراع ثلاثي الأبعاد تحت ضغط الراحة وضغط تشغيل قدره 55 kilo pascal.

لقد شرحنا لكم للتو كيفية تصنيع الأجهزة المستخدمة لتحفيز الخلايا ميكانيكياً في أنظمة زراعة خلوية ثنائية أو ثلاثية الأبعاد. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر الحفاظ على نظافة الأجهزة وخلوها من الغبار قدر الإمكان، والتحلي بالصبر، خاصة خلال خطوات المحاذاة. هذا كل شيء.

شكراً للمشاهدة، وبالتوفيق في تجاربكم.