Microfabricated المنصات الحيوي للثقافة الخلية ميكانيكيا
ديسمبر 26, 2010
في هذا البروتوكول ، ونحن إثبات تلفيق مجموعة من الوظائف microactuator عموديا على النازحين الذي يستند إليه التكنولوجيا ، وكيف يمكن تعديل هذه التكنولوجيا لإجراء قاعدة إنتاجية عالية خلية ثقافة ديناميكية ميكانيكيا في كل ثقافة ثنائي الابعاد وثلاثي الابعاد نماذج.
الهدف العام من التجربة التالية هو تصنيع الأجهزة الدقيقة المستخدمة لتحفيز بيئات زراعة الخلايا ثنائية وثلاثية الأبعاد ميكانيكيا. يتم تحقيق ذلك باستخدام تقنية قولبة وتكديس شطيرة متعددة الطبقات لإنتاج مجموعة من الأعمدة الصغيرة التي يتم تشغيلها رأسيا. كخطوة ثانية ، يتم تعديل مصفوفة الوظائف الدقيقة التي يتم تشغيلها رأسيا لتمديد فيلم الاستزراع ، والذي يطبق سلالات يتم التحكم فيها جيدا على الخلايا المزروعة على الفيلم.
بدلا من ذلك ، يمكن تعديل المصفوفة لضغط تركيبات المواد الحيوية ذات النمط الدقيق من أجل تطبيق التحفيز الميكانيكي على الخلايا. تم الحصول على نتائج مستنبتة في مجموعة من الهلاميات المائية ثلاثية الأبعاد والتي تظهر التطبيق المتزامن لمجموعة من سلالات الضغط ثنائية الأبعاد وثنائية الأبعاد عبر المصفوفة بناء على تحليل الصور للعلامات الائتمانية الفلورية. مرحبا ، أنا كريس مارياس من مختبرات كريج سيمونز ويو صن في قسم الهندسة الميكانيكية والصناعية ومعهد المواد الحيوية والهندسة الطبية الحيوية في جامعة تورنتو.
سنعرض لك اليوم إجراء لتصنيع الأجهزة الدقيقة المستخدمة لتحفيز الخلايا ميكانيكيا. نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة كيفية استجابة الخلايا لمجموعة متنوعة من القوى الميكانيكية في الثقافة المختبرية. لذلك دعونا نبدأ.
تتضمن عملية تصنيع قالب الساندويتش وضع شفافية علوية على بولي ثنائي ميثيل سلون أو PDMS غير المعالج على SU ثمانية سيد. توضع الساندويتش في كومة زجاجية ومعدنية رغوية وتعالج في فرن تحت الضغط. أخيرا ، يتم تفكيك المكدس وتقشير الشفافية مع الاحتفاظ بطبقة PDMS المزخرفة.
لبدء هذه العملية ، امزج PDMS والمونومر والرابط المتشابك جيدا. في النسبة القياسية 10 إلى واحد ، قم بإيداع ثلاثة ملليلتر من خليط PDMS غير المعالج على SU ثمانية سيد وبوليمر DGAs المصنوع مسبقا في غرفة مفرغة. بعد ذلك ، ضع وسادة الرغوة و SU eight master على لوحة قاعدة زجاج شبكي.
قم بخفض الجانب الأملس لشفافية نفث الحبر بعناية على نظام PDMS غير المعالج ، مع التأكد من تجنب احتجاز أي فقاعات هواء. ثم ضع شريحة زجاجية محبوطة أعلى الشفافية أسفل وسادة الرغوة الثانية واللوحة العلوية الزجاجية. قم بتثبيت الشطيرة معا باستخدام مشبك C.
عالج شطيرة PDMS في فرن على حرارة 80 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل. بعد المعالجة ، أخرجي الساندويتش من الفرن واتركيه ليبرد. بمجرد أن يبرد ، قم بإزالة المشبك وتفكيك الشطيرة.
قشر الشفافية بعناية بعيدا عن SU ثمانية سيد يحتفظ بفيلم PDMS براءة الاختراع. قم بقص حواف فيلم النمط لإزالة PDMS الزائدة ، وقم بتخزين طبقات النمط في بيئة خالية من الغبار حتى تصبح جاهزة للاستخدام. يتضمن الجزء التالي من هذا البروتوكول إنشاء مجموعة صغيرة من المشاركات التي يتم تشغيلها رأسيا.
مطلوب عملية تصنيع متعددة الطبقات لعمل مجموعة من المشاركات الصغيرة. يتم تحضير طبقة PDMS السفلية الأكثر منقوشة عن طريق تصنيع قالب الساندويتش. في هذه التجارب ، تم استخدام أنماط دائرية يتراوح قطرها من 600 إلى 1 ، 200 ميكرون.
من أجل نقل طبقة PDMS إلى شريحة زجاجية نظيفة ، استخدم وحدة تفريغ Corona لمعالجة PDMS والأسطح الزجاجية ببلازما الأكسجين. ثم ضع السطحين على اتصال مع بعضهما البعض. ضع المكدس على طبق ساخن على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 10 دقائق لإكمال عملية الترابط.
قشر الشفافية بعيدا وتخلص منها. تضمن هذه العملية عدم إطلاق فيلم PDMS المزخرف أبدا من ركيزة صلبة ، مما يمنع انكماش الطبقات الفردية. تتكون الطبقة الثانية المصبوبة بالساندويتش كقالب طبق الأصل سالب للحجاب الحاجز المطلوب وهيكل المنشور.
في هذا العرض التوضيحي ، تم استخدام أعمدة دائرية قطرها 500 ميكرون لتشكيل هذه الطبقة. أولا ، قم بلصق قالب النسخة المتماثلة السالب مؤقتا على شريحة زجاجية باستخدام شريط على الوجهين ومنعزل في رواسب PDMS مجففة غير معالجة على الساندويتش وطبقة القالب وطبقة Degas وطبقة الدوران لمدة 45 ثانية عند 1000 دورة في الدقيقة مما ينتج عنه غشاء تشغيل بسمك 60 ميكرون ، قم بمعالجة طبقة PDMS المطلية بالدوران جزئيا عند 80 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة تقريبا أو حتى يصبح PDMS لزجا ولكنه لا يتشوه بشكل دائم. عند لمسها ، قم بإزالة الشريحة الزجاجية والشريط على الوجهين من طبقة PDMS المعالجة جزئيا وقم بلصق فيلم الشفاف على زوج من شرائح مناولة الزجاج والبلازما.
عالج PDMS المعالج جزئيا ، ثم اقلب PDMS وضعه في محاذاة مخصصة. يتكون التقويم من ظرف فراغ مثبت على مناور صغير. بعد ذلك ، تعالج البلازما الطبقة الأولى من PDMS ، ثم ضعها على مرحلة دوارة أسفل ظرف الفراغ.
راقب المحاذاة بين الطبقتين باستخدام نظام رؤية آلة التكبير الرمزي 12 مرة. باستخدام المعالج ، قم بمحاذاة الطبقات وملامستها بعناية. ضع ضغطا خفيفا بإصبعك للصق الطبقات معا.
ثم قم بإزالة الساندويتش من التقويم. قم بإزالة شرائح المناولة الزجاجية وتأكد من أن الطبقات على اتصال كامل ببعضها البعض. معالجة الفرن على حرارة 80 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة إضافية.
بعد 30 دقيقة ، يمكن تقشير قالب PDMS الشفاف والنسخة المتماثلة المنعزلة من الجهاز والتخلص منه. ثم يتم معالجة الجهاز بالكامل عند 80 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل لإجراء تجارب على الخلايا المزروعة على ركيزة مشوهة ثنائية الأبعاد. يتم تعديل مصفوفة المشغل الصغير عن طريق ربط طبقة PDMS ثالثة بالجهاز.
تتكون طبقة PDMS الثالثة من هيكل من طبقتين. تتطابق الدائرة السفلية مع حجم تجويف التشغيل أسفل الأعمدة الدقيقة التي يتم تشغيلها. قطر الدائرة العلوية أكبر بمقدار 100 ميكرون من قطر أعمدة التحميل.
تربط قناة صغيرة بعرض 200 ميكرون هذه الميزات بمنطقة اتصال وسيتم استخدامها لتشحيم أعمدة التحميل وفيلم الثقافة. لتعديل الجهاز للثقافة ثنائية الأبعاد ، قم أولا بتصنيع الموصلات وربطها بها كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. ثم قم بتدوير طبقة من 10 إلى 15 ميكرون من PDMS على الجانب الأملس من علاج الشفافية.
فيلم PDMS الرقيق عند 80 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل. الخطوة التالية هي تطبيق فراغ على المشغلات وربط طبقة PDMS بالجهاز. لتحقيق ذلك.
أولا ، قم بتطبيق فراغ منخفض المستوى على المشغلات التي تقلل من مجموعة المنشورات ومعالجة البلازما والرابطة. فيلم PDMS المطلي بالدوران إلى الجهاز الصغير الذي يتم تشغيله كما هو موضح في البروتوكول المكتوب ، ستظل المنشورات وفيلم الثقافة محبة للماء لفترة قصيرة. ثم قم بتوصيل حقنة زيوت التشحيم بالجهاز واملأ قنوات التشحيم ب 90٪ من الجلسرين في محلول مائي منزوع الأيونات.
بالإضافة إلى التشحيم ، تحافظ هذه التركيبة على المحبة للماء في PDMS مما يقلل من معاملات الاحتكاك إلى أجل غير مسمى. ضع الجهاز على لوح ساخن عند 40 درجة مئوية واستمر في حقن مواد التشحيم في القناة ، مما يتسبب في زيادة طفيفة في الضغط. بعد بضع دقائق ، تنتشر فقاعات الهواء من خلال PDMS وسيتم تشحيم جميع الأسطح.
بالنسبة للخطوة الأخيرة ، قم بإزالة الضغط السلبي الذي يطلق الأعمدة باستخدام مشرط. قص حول فيلم PDMS الرقيق. قشر بعناية دعامة الشفافية بعيدا عن رابطة بلازما الجهاز.
حشية PDMS مقطوعة يدويا حول منطقة ثقافة الجهاز. قم بتعقيم الجهاز عن طريق نقعه في 70٪ من الإيثانول لمدة خمس دقائق ، متبوعا بالعلاج تحت ضوء الأشعة فوق البنفسجية المبيد للجراثيم في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 45 دقيقة. البلازما ، عالج السطح واحتضان مع 100 ميكروغرام لكل ملليلتر الكولاجين بين عشية وضحاها عند أربع درجات مئوية.
بعد الحضانة الليلية ، اغسل الجهاز بمحلول ملحي معقم مخزن بالفوسفات أو PBS وخلايا البذور عند 10 إلى 15،000 خلية لكل سنتيمتر مربع. باتباع بروتوكولات زراعة الخلايا القياسية ، يمكن تعديل مصفوفة المحرك الصغير لإجراء تجارب على الخلايا المزروعة في تركيبات هيدروجيل منقوشة ثلاثية الأبعاد. أولا ، يتم تصنيع نظام أساسي متعدد الطبقات قائم على PDMS.
بعد تغطية المنصة الأساسية بالميثامفيتامين ، يتم حقن محلول سلائف هيدروجيل ذات غطاء زجاجي ذي صلة. ثم يتم تصميم مادة حيوية قابلة للحجز من بوليمر الصور في المصفوفة ويتم التخلص من محلول السلائف المتبقي. يمكن بعد ذلك استخدام مجموعة أعمدة التحميل التي يتم تشغيلها رأسيا لتطبيق قوى ميكانيكية ضاغطة على الخلايا المزروعة في مواد حيوية ثلاثية الأبعاد مع قطع من الشريط اللاصق الذي يخفي المناطق المحيطة بالأعمدة ، وتغطي الجهاز بالبارالين C في نظام مختبر PDS 2010 COTER two.
سيؤدي ذلك إلى تحسين حركية البلمرة لنظام المواد الحيوية. بمجرد الطلاء ، قم بإزالة الجهاز من نظام الطلاء وقشر الشريط اللاصق بعيدا ، مع ترك طبقة مطابقة من البارالين C فوق الأعمدة. ثم ينزلق غطاء زجاج الميثامفيتامين ACRL عن طريق الغمر في محلول حجم 2٪ لكل حجم من ثلاثة ثلاثيات أوكسي ميثاكريلات في 95٪ إيثانول لمدة دقيقتين.
اشطف الغطاء. انزلق في 100٪ من الإيثانول ، متبوعا بالخبز على حرارة 100 درجة مئوية ، مع ترك مجموعات الميثاكريلات على السطح. صب فاصل PDMS بسمك 200 ميكرون.
فيلم في طبق بتري وتقطيعه إلى أقسام صغيرة. رابطة البلازما أربعة من هذه الأقسام الصغيرة حول حافة زلة الغطاء ذات الصلة ب meac. ثم ربط البلازما الفراغات بمناطق PDMS للجهاز الذي يغطي طلاء Lene C.
أخيرا ، قم بتعقيم الجهاز عن طريق غسل 70٪ من الإيثانول وتعريضه لمبيد الجراثيم أو الأشعة فوق البنفسجية في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 45 دقيقة. لتصوير الطباعة الحجرية ، قم بتصميم الخلايا المحملة بالخلايا PEG hydrogels في الأجهزة. قم بإعداد حلول السلائف وبادئ الصور كما هو موضح في البروتوكول المكتوب وخلطها جيدا للحصول على محلول بتركيز 0.4٪ وزن لكل حجم من بادئ الصورة.
قم بتصفية الخليط من خلال مرشح حقنة 0.45 ميكرون لتعقيم وإزالة الجسيمات ، ومزارع خلايا الجليد التربسين ، وإعداد تعليق الخلية في وسط المزرعة بضعف تركيز الخلايا النقطية المطلوب. ثم امزج تعليق الخلية ومحلول بادئ صور السلائف الهيدروجيل المصفى بنسبة واحد إلى واحد. حقن المحلول في الجهاز الصغير باستخدام إبرة طويلة قياس 25.
تجنب بعناية محاصرة الفقاعات في الجهاز. قم بمحاذاة قناع شفاف مطبوع مع علامات المحاذاة على سطح الجهاز. قم بإعداد نظام إضاءة للأشعة فوق البنفسجية لتوفير جرعة UV بطول موجي 365 نانومتر تبلغ 17.5 مللي واط لكل سنتيمتر مربع على سطح الجهاز.
قم بإضاءة الهيدروجيل من خلال القناع لمدة 195 ثانية بعد الإضاءة. اغسل محلول سلائف الهيدروجيل غير المبلمر باستخدام PBS واستبدل PBS بوسائط الثقافة التي تعمل على تشغيل أعمدة التحميل لضغط تركيبات الهيدروجيل. هنا ، يتم عرض جهاز عينة مكتمل للثقافة التحفيدية الميكانيكية ثنائية الأبعاد.
تستخدم الصبغة الحمراء لتمييز قنوات توصيل ضغط التشغيل ويستخدم D الأزرق لتمييز توصيف سلالة قنوات التشحيم. يمكن استخدام التجارب لتحديد مجالات الإجهاد المطبقة عن طريق تتبع حركة حبة الفلورسنت على الركائز. تمثل البقع الحمراء الموقع غير المشكل للخرز بينما تمثل البقع الخضراء المواقع المشوهة.
يمكن رؤية جهاز عينة لتجارب الضغط ثلاثية الأبعاد هنا حيث يتم استخدام الصبغة الخضراء لتمييز قنوات ضغط التشغيل. يكشف المنظر العلوي لأسفل لمصفوفة المنشورات الدقيقة عن بنية الهيدروجيل المزخرفة أعلى الصور المعاد بناؤها من جانب العمود لخرز الفلورسنت في بنية الهيدروجيل. تحت السكون وضغوط التشغيل 55 كيلو باسكال توضح عملية توصيف الإجهاد في نظام استزراع ثلاثي الأبعاد.
لقد أوضحنا لك للتو كيفية تصنيع الأجهزة المستخدمة لتحفيز الخلايا ميكانيكيا في أنظمة استزراع ثنائية أو ثلاثية الأبعاد. عند القيام بهذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر الحفاظ على أجهزتك نظيفة وخالية من الغبار قدر الإمكان وأن تتحلى بالصبر ، خاصة أثناء خطوات المحاذاة. هذا كل شيء.
شكرا على المشاهدة ونتمنى لك السعادة في تجاربك.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يوضح هذا البروتوكول تصنيع مصفوفة ميكرومشغل لأعمدة متوضعة عموديًا، مما يتيح زراعة الخلايا الميكانيكية الديناميكية عالية الإنتاجية في نماذج ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد.
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- الهندسة الطبية الحيوية
- تقنيات زراعة الخلايا
- التصنيع المصغر
الخلفية
- التحفيز الميكانيكي للخلايا ضروري لفهم استجابات الخلايا.
- يمكن أن توفر مصفوفات الميكرومشغل بيئات ميكانيكية خاضعة للتحكم لزراعة الخلايا.
- يمكن أن تظهر ثقافات ثنائية الأبعاد وثلاثية الأبعاد سلوكيات خلوية مختلفة.
- يمكن استخدام تقنيات تحليل الصور لتقييم تأثيرات الضغط الميكانيكي على الخلايا.
غرض الدراسة
- لتصنيع الأجهزة التي تحفز الخلايا ميكانيكيًا في الثقافة.
- لتطبيق ضغط متحكم فيه على الخلايا باستخدام مصفوفة أعمدة ميكروية.
- للتحقيق في تأثيرات التحفيز الميكانيكي على سلوك الخلايا في بيئات ثقافة مختلفة.
الطرق المستخدمة
- تقنية صب وتسوية الرقائق المتعددة الطبقات لتصنيع الأشياء الدقيقة.
- تعديل مصفوفات الأعمدة الميكروية لتمديد أفلام الثقافة.
- تطبيق التحفيز الميكانيكي على هياكل المواد الحيوية المرتبة.
- تحليل الصور للعلامات الضمانية الفلورية لتقييم تطبيق الضغط.
النتائج الرئيسية
- تصنيع ناجح لأعمدة ميكروية مفعلة عموديًا.
- تطبيق متحكم فيه للضغط ثنائي الأبعاد وثلاثي الأبعاد.
- تشير النتائج إلى استجابات خلوية كبيرة للتحفيز الميكانيكي.
- تم تحقيق قدرات عالية الإنتاجية لزراعة الخلايا الديناميكية.
الاستنتاجات
- تكون مصفوفة الميكرومشغل فعالة لدراسة التأثيرات الميكانيكية على الخلايا.
- يمكن أن تتقدم هذه التقنية البحث في ميكانيكا الخلية وهندسة الأنسجة.
- قد تشمل التطبيقات المستقبلية الطب الشخصي والعلاجات التجددية.
الأسئلة الشائعة
Executive Industry Relevance
Mechanically dynamic cell culture platforms enable systematic interrogation of cellular responses to diverse mechanical stimuli, addressing a critical gap in early discovery and tissue engineering workflows. High-throughput microfabricated arrays facilitate predictive assessment of mechanobiological effects, supporting target validation and de-risking in preclinical model development. This capability enhances portfolio decision-making by providing quantitative, reproducible data on mechanotransduction pathways relevant to drug discovery and regenerative medicine.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables controlled application of mechanical forces to probe cellular mechanotransduction mechanisms.
- Supports functional target validation by quantifying cell responses to defined mechanical environments.
- Facilitates mechanistic de-risking through multiplexed screening of mechanical stimuli.
- Provides predictive confidence for pathway prioritization in tissue engineering and disease modeling.
Screening & Assay Development
- Prepares validated 2D and 3D culture systems for downstream compound screening.
- Delivers standardized, reproducible mechanical stimulation across high-throughput arrays.
- Enables quantitative measurement of strain fields via image analysis of fiduciary markers.
- Supports scalable assay development for evaluating mechanosensitive targets.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro mechanical environments with disease-relevant tissue mechanics.
- Maintains translational continuity from discovery through preclinical validation of mechanobiological hypotheses.
- Reduces biological risk by enabling risk-adjusted advancement of mechanosensitive targets.
- Provides a platform for biomarker discovery linked to mechanical stimulation.
Pipeline & Workflow Integration
This microfabricated platform integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling hypothesis-driven mechanobiology studies, assay development, and translational model validation.
- Discovery Biology: Supports null hypothesis testing of mechanotransduction pathways and target engagement.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs for compound or condition comparison.
- Analytics: Provides image-based strain quantification for robust statistical analysis.
- Translational Research: Bridges in vitro findings to preclinical models with disease-relevant mechanical cues.
- Enterprise Reuse: Offers a modular, adaptable platform for diverse mechanobiology applications across R&D teams.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in target validation.
- Operational Value: Standardizes mechanical stimulation protocols for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions and capital allocation by providing robust mechanobiological data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of mechanosensitive targets and models.
Implementation Considerations
- Requires expertise in microfabrication, cell culture, and image-based analytics.
- Demands access to specialized instrumentation for device fabrication and strain measurement.
- Necessitates cross-team standardization of mechanical stimulation parameters and data analysis workflows.
- Adaptable to both 2D and 3D culture systems with protocol modifications.
- Device cleanliness and precise alignment are critical for reproducibility and data integrity.
Biopharma FAQs
Chapters in this video
0:05
Title
1:05
Introduction
1:31
Sandwich Mold Fabrication
3:27
Constructing the Multilayer Device
6:45
Microactuator Modification for Active 2D Substrates
10:01
Device Modifications for Active 3D Hydrogels
12:11
In Situ Polymerization
13:51
Representative Results for Device Fabrication, Characterization, and Operation
14:57
Conclusion
