مستضد محددة في فيفو الفحص باستخدام خلايا القتل المستهدف CFSE إعتبر

الهدف العام من التجربة التالية هو تقييم الجودة الوظيفية للخلايا التائية الموجبة لـ CD8 استجابةً لمستضد معين، وذلك من خلال استقصاء قدرتها على قتل الخلايا المستهدفة داخل الجسم الحي. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق استحثاث الخلايا التائية المؤثرة الموجبة لـ CD8 النوعية للمستضد عبر تحصين الفئران المستقبلة. وفي خطوة ثانية، يتم إكساب الخلايا المستهدفة الأولية النوعية أو معالجتها بطريقة أخرى، مما يستكمل إنشاء نظام الخلايا المستهدفة والمؤثرة النوعي.

بعد ذلك، يتم إعطاء الخلايا المستهدفة للفئران المستقبلة عن طريق النقل التبني عبر الحجاج. ومن أجل دراسة القتل الفعال داخل الجسم الحي، تم الحصول على نتائج توضح ما إذا كانت الخلايا المؤثرة قد قتلت أيًا من الخلايا المستهدفة بناءً على تحليل قياس التدفق الخلوي للخلايا المصبوغة بـ CF SE. مرحباً، اسمي مارينا وارد.

أنا طالب دراسات عليا في مختبر Gary Splitter بجامعة Wisconsin Madison. ستوفر هذه الطريقة رؤية متعمقة حول قتل الخلايا التائية السامة للخلايا (CTL)، ويمكن تطبيقها أيضاً على تكاثر الخلايا وبقائها. سيقوم الدكتور Jerome Harms، وهو عالم من مختبري، بتوضيح إجراء النقل التكيفي. ابدأ بشكل استراتيجي بتحديد نظام هدف مؤثر محدد.

على سبيل المثال، في مقايسة تقليدية للخلايا التائية السامة للخلايا (CTL) داخل الجسم الحي، يتم استخدام تحصين ببتيدي منقى لاستثارة خلايا T إيجابية CD8 محددة، ويُستخدم الببتيد نفسه لتحفيز الخلايا المستهدفة المتماثلة جينياً، مما يؤدي إلى إيجاد تأثير محدد على النظام المستهدف. يتم تطهير سطح العمل في كابينة السلامة البيولوجية لضمان تعقيم الحقن. يتم تحضير التحصين الببتيدي عن طريق وضعه أولاً في أنبوب سعة 2 mL.

50 µg من الببتيد المُنقّى في 100 µL من 10% DMSO في PBS لكل فأر. بعد ذلك، أضف كمية مساوية من unju الحر غير المكتمل البارد جداً مع حبيبات بحجم 1 mm لخلطهما. أحكم إغلاق غطاء الأنبوب باستخدام البارافورم واحفظ المستضد المناعي على الثلج حتى وقت الحقن.

استخدم جهاز خلط الخرز (bead beater) مضبوطاً على أقصى عدد دورات في الدقيقة لخلط المستحلب لمدة ثلاث دقائق، مع وضع المستحلب على الثلج فوراً بعد الخلط. يجب أن يكون قوام المستحلب الناتج مشابهاً لقوام المايونيز. اترك المستحلب في درجة حرارة 4 °C طوال الليل أو لمدة تصل إلى أسبوع، مع إجراء مزيد من الخلط إذا لوحظ أي انفصال في وقت التحصين.

حدد الفئران المخصصة لهذا الجزء من التجربة. استخدم حقنة سعة 1 مل وإبرة بقياس 20 gauge لسحب المستحلب، مع الحرص على عدم سحب أي خرزات من أجل تحضير الخلايا المستهدفة.

تُستخدم الفئران السنجينية الساذجة (naive syngeneic mice) ثم يتم القضاء عليها رحيمًا وفقًا للمعايير المعتمدة من A-A-A-L-A-C. رُش المنطقة ذات الصلة من الفأر بـ 70%ethanol لتقليل فرص التلوث من شعر الفأر أو الملوثات الخارجية الأخرى، ثم استخدم مقص التشريح لإجراء شق صغير في الجلد على الجانب الأيسر من الفأر.

اسحب السديلة الجلدية للكشف عن الكيس الصفاقي والأعضاء الداخلية. قم بالقطع عبر الصفاق مع الحرص على عدم إلحاق الضرر بأي من الأعضاء الموجودة تحته. حدد موقع الطحال الذي يكون قريباً من السطح وذو لون أحمر داكن.

أخرج الطحال بعناية وضعه فوراً في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter يحتوي على 10 milliliters من وسط RPMI المُحضّر على الثلج. كرر العملية مع بقية الفئران. انقل الطحال والوسط إلى مجانس أنسجة زجاجي (glass tissue homogenizer).

اطحن الطحال حتى يفقد النسيج لونه بالكامل. مرر النواتج المتجانسة عبر مرشح خلايا بمقاس 70 micron في أنبوب مخروطي سعة 50 milliliter. اشطف المجانس مرة واحدة بوسط غذائي جديد واخلطه مع متجانس الطحال عن طريق صبه عبر المرشح، ثم قم بطرد عينات المركز في درجة حرارة 4 °C وبسرعة 1,300 rotations per minute.

لمدة سبع دقائق، قم بصب السائل الطافي والتخلص منه. أعد تعليق الكتلة الخلوية في 10 milliliters من محلول reagents وحضنها عند 37 degrees Celsius لمدة سبع دقائق. أكمل الحجم إلى 50 milliliters باستخدام medium طازج، ثم اجمع الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

كرر عملية الغسل هذه. قم بعد الخلايا وتوزيع 10 million خلية في كل بئر، وذلك في طبق زراعة أنسجة بـ 96 بئراً ذات قاع مستدير.

يُحضن المزيج عند درجة حرارة 4 °C لمدة ساعة ونصف. ثم يُنقل إلى الحضانة عند درجة حرارة 37 °C خلال الـ 30 دقيقة الأخيرة. قم بتحضير كاشف CFSE طازج وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، ثم خففه ليصل إلى تركيز عمل يتراوح بين 0.5 و 25 µM.

قم بتحضير محلولين من CFSE يختلفان في التركيز بمقدار عشرة أضعاف. قم بموازنة درجات حرارة محلولي CFSE ذوي التركيز المنخفض والعالي عند 37 درجة مئوية قبل عملية الوسم. أخرج لوحة الـ 96 بئراً التي تحتوي على الخلايا المستهدفة من الحاضنة وقم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي.

في درجة حرارة الغرفة، قم بنقر اللوح لإزالة السائل الطافي (SUP). أعد تعليق الخلايا في 200 µL من محلول CFSE سواء بتركيز منخفض أو مرتفع، ثم حضنها لمدة 15 دقيقة في حاضنة عند درجة حرارة 37 °C. قم بترسيب الخلايا عن طريق الطرد المركزي في درجة حرارة الغرفة، ثم انقر اللوح لإزالة السائل الطافي (SUP). أعد تعليق الخلايا في 200 µL من الوسط الطازج وحضنها لمدة 30 دقيقة عند درجة حرارة 37 °C. قم بترسيب الخلايا مرة أخرى عن طريق الطرد المركزي، وتخلص من السائل الطافي، ثم أعد تعليق الرواسب في 50 µL من PBS. احتفظ بجزء من الخلايا الموصومة لاستخدامها كضوابط عدم النقل (non-transfer controls) أثناء تحليل البيانات، وأيضاً لتشغيلها على جهاز قياس التدفق الخلوي (flow cytometer) من أجل النقل التكيفي.

أضف بئراً واحداً من الخلايا الموصومة بـ CFSE ذات التركيز المنخفض إلى بئر واحد من الخلايا الموصومة بـ CFSE ذات التركيز العالي لكل فأر. وبذلك، تتكون الحقنة الناتجة من 50% من الأهداف النوعية و50% من الخلايا غير ذات الصلة في 0.1 milliliter. ولتسهيل عملية النقل التبني، قم بتخدير الفئران المحصنة بالببتيد واحقن 0.1 milliliter من الخلايا المستهدفة الموصومة عن طريق الحقن خلف المدار في المتلقي.

بعد مرور ست ساعات، يتم قتل الفئران المتلقية رحمةً لجمع الخلايا، ثم يتم عزل طحال الفأر وتنقية المجموعة الخلوية باتباع البروتوكول ذاته الذي استُخدم مسبقاً. وعند تحضير خلايا الطحال المستهدفة، توضع الخلايا في طبق زراعة أنسجة ذي قاع مستدير مكون من 96 بئراً بمعدل مليون خلية لكل بئر، ثم تُثبّت الخلايا المستعادة وغير المنقولة باستخدام البارافورمالدهيد، وتُمرر العينات عبر جهاز قياس التدفق الخلوي لتحليل البيانات. ويتم عرض النتائج النموذجية لعملية القتل النوعية للخلايا بطريقتين.

تشير الذروة النوعية للمحدد المستضدي المنخفضة في مخطط توزيع FACS والقيمة المحسوبة إلى التحلل الخلوي النوعي. هنا تشير الأرقام إلى النسبة المئوية للخلايا ذات النمط الظاهري لـ CFSE المرتفع أو المنخفض في الخلايا الملحقة بـ CFSE في مجموعة التحكم غير المنقولة والمستخرجة من فأر متلقٍ تم تحصينه بـ PBS، والخلايا الملحقة بـ CFSE والمستخرجة من فأرين متلقيين نوعيين لببتيدين مختلفين. لاحظ الذروات النوعية للمحدد المستضدي المنخفضة التي تدل على القتل الخلوي النوعي.

بدلاً من ذلك، يمكن عرض النتائج بيانياً للإشارة إلى التحلل الخلوي المحدد لكل مجموعة من الفئران: PBS، والببتيد A، والببتيد B. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطوير اختبار قتل CTL الخاص بك في الجسم الحي باستخدام الفئران.