التنميط وغيره من Methyltransferases S - adenosyl - _L - الهموسيستين ملزم البروتينات المركبة من قبل التقاط الطيف الكتلي (CCMS)

الهدف العام من التجربة التالية هو تحليل ملف ميثيل ترانسفيراز (methyl transferases) من خلائط بروتينية معقدة باستخدام مطيافية الكتلة بمركب الالتقاط أو CCMS. يتم عزل ميثيل ترانسفيراز وظيفياً بواسطة مركبات التقاط ثلاثية الوظائف تحمل مثبط ناتج ميثيل ترانسفيراز العام، S adenyl, L homocystine short، والمعروف بـ SAH، كوظيفة اختيارية في سير العمل الموضح هنا؛ حيث يتم تحقيق العزل الوظيفي عن طريق تحضين محلول خلوي مع مركب الالتقاط لإنشاء توازن ارتباط عكسي بين الوظيفة الاختيارية لمركب الالتقاط والبروتينات المستهدفة كخطوة ثانية. ثم يتم تعريض الخليط للأشعة فوق البنفسجية (UV light) داخل صندوق الالتقاط (capra box).

تعمل عملية التشعيع الضوئي على تنشيط وظيفة التفاعلية للمركب الالتقاطي. ويؤدي ذلك إلى تكوين رابطة تساهمية تشابكية غير عكسية بين المركب الالتقاطي والبروتينات المستهدفة. بعد ذلك، يتم فصل مترافقات البروتين الخاصة بالمركب الالتقاطي من المستخلص الخلوي وغسلها جيداً ثم تحريرها من الدعامة الصلبة ومعالجتها بإنزيم التربسين من أجل تحديد البروتينات الملتقطة عن طريق تحليل الببتيدات الناتجة باستخدام مطياف الكتلة؛ وتظهر النتائج التي تم الحصول عليها العزل والتعريف المباشر لإنزيمات ميثيل ترانسفيراز من مستخلص خلوي لبكتيريا Escherichia coli بناءً على مطياف الكتلة للمركب الالتقاطي.

مرحباً، أنا توماس لنتز من مختبر CaTECH في قسم الكيمياء الحيوية. أنا ماتياس ريجا، أيضاً من مختبر CaTECH للكيمياء الحيوية. أنا مير لينسكي من قسم التحليلات.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لالتقاط ناقلات الميثيل (methyl transferases) باستخدام خرزات "on beat" من مستخلص خلوي متكافئ. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة التفاعلات بين البروتينات والجزيئات الصغيرة. يتيح هذا الإجراء عزل وتحديد البروتينات الوظيفية الفرعية (sub proteomes)، مثل الكيناز (kinase)، والميتالوبروتينيز (metalloproteinase)، وبروتينات GTPases، على سبيل المثال لا الحصر.

نستخدم هذا النهج أيضاً لاكتشاف الأهداف الدوائية. لذا، دعونا نبدأ. بالنسبة لتجارب الالتقاط، يتم استخدام مجموعة snail L homocystine caper kit أو مجموعة short SAH caper kit.

تتضمن هذه العدة مركب التقاط SAH وSAH الحر كمنافس. كما تشتمل أيضاً على حبيبات مغناطيسية مغلفة بالستريبتاديفين بقطر ميكرون واحد، ومحلول التقاط مركز خمس مرات، ومحلول غسيل مركز خمس مرات. باستخدام أنابيب مختلفة من شريط أنابيب PCR سعة 200 microliter، قم بتحضير الحبيبات المغناطيسية المغلفة بالستريبتاديفين والمحملة بمركب التقاط SAH عن طريق خلط 50 microliters من الحبيبات المغناطيسية المغلفة بالستريبتاديفين بتركيز 10 milligrams per milliliter مع 25 microliters من مركب التقاط SAH بتركيز 100 micromolar لكل عينة، مع الرج بقوة.

رُج المعلقات الناتجة في درجة حرارة الغرفة لمدة دقيقتين للسماح بارتباط شق البيوتين في مركب الالتقاط ببروتين الستريبتةفيدين الموجود على سطح الخرزات المغناطيسية. بعد ذلك، اجمع خرزات capra مغناطيسياً في أغطية أنابيب PCR باستخدام capra mag، وتخلص من الطافي، ثم أعد تعليق خرزات capra الناتجة في 200 µL من محلول الغسيل بتركيز 1x. مرة أخرى، اجمع خرزات capra مغناطيسياً في أغطية شرائط أنابيب PCR وتخلص من الطافي.

ثم أغلق الأنابيب لتجنب جفاف الخرزات. بعد ذلك، قم بوضع الملصقات على أنابيب جديدة لاختبار الالتقاط والضوابط الضرورية، بما في ذلك ضابط التنافس. قم بسحب ضابط التنافس للسحب، واختبار الالتقاط المدمج مع السحب، ثم ضع الأنابيب المسمى في صندوق "capra" لتنظيم درجة الحرارة عند صفر إلى أربعة درجات Celsius.

بعد ذلك، قم بسحب حجم من ماء milli Q المحسوب ليكون الحجم النهائي للتفاعل 100 µL، وأضف 20 µL من منظم الالتقاط (capture buffer) بتركيز 5x. لكل تفاعل، أضف 0.26 mg من مستخلص خلايا E. coli DH5α الكاملة إلى كل أنبوب، وامزجها برفق عن طريق القلب. وبالنسبة لضابط التنافس وضابط التنافس لعملية السحب (pull down)، أضف 20 µL من محلول المنافس SAH بتركيز 10 mM.

بالنسبة لمقايسة الالتقاط، ومقايسة السحب، ومقايسة الالتقاط المدمجة مع السحب، أضف 20 µL من مياه milli Q بدلاً من محلول SAH، ثم اخلط جميع الأنابيب برفق عن طريق القلب وقم بطرد مركزي سريع. بعد ذلك، قم بتعليق خرزات capra في المستخلص الخلوي المناسب واحضنها لمدة ثلاث ساعات عند درجة حرارة 4 °C. حافظ على تعليق الخرزات عن طريق التدوير للسماح بالارتباط العكسي لبروتينات الارتباط بـ SAH بوظيفة انتقائية SAH الموجودة في مركب التقاط SAH.

بعد انتهاء فترة الحضن، قم بإجراء طرد مركزي سريع ثم ضع المعلقات في صندوق كابرا (capra box). افصل الأنابيب وأخرج المعلقات المخصصة لعملية السحب (pull down) وضابط المنافسة لعملية السحب وضعها على الثلج. اترك المعلقات المتبقية لضابط منافسة مقايسة الالتقاط ومقايسة الالتقاط المشتركة.

ثم اسحب المقبض لأسفل في صندوق capra لتسليط الأشعة فوق البنفسجية (UV) على العينات مع تبريدها في آن واحد. قم بتسليط الأشعة على العينات لمدة إجمالية قدرها 30 دقيقة، مع فترات تشعيع مدتها 2.5 دقيقة في أنابيب مغلقة عند درجة حرارة تتراوح بين 0 و 4 °C. ستؤدي هذه العملية إلى تكوين رابطة تساهمية متقاطعة بين الوظيفة التفاعلية لمركب التقاط SAH وبروتينات ربط SAH.

أخرج المعلقات من صندوق Capra بعد فترة تشعيع مدتها 2.5 minutes. بردها في ماء مثلج لمدة 15 seconds تقريبًا، وامزجها عدة مرات عن طريق القلب. بعد ذلك، قم بطرد مركزي سريع للعينات لإزالة أي معلق متبقٍ في الأغطية، ثم أعد وضعها في صندوق Capra لفترة التشعيع التالية.

بعد ذلك، قم بتضمين المعلقات الخاصة بالترسيب المناعي (pull down) وضابط المنافسة للترسيب المناعي، وأضف 20 µL من محلول SAH بتركيز 10 mM إلى اختبار الالتقاط الخاص بضابط المنافسة. أما بالنسبة لضابط منافسة الترسيب المناعي واختبار الالتقاط المدمج مع الترسيب المناعي، فأضف 20 µL من مياه milli Q. قم بتحضين المعلقات لمدة 10 دقائق عند درجة حرارة 4 °C، مع الحفاظ على الخرز والمعلق في حالة دوران في اختبار الالتقاط. سيتم إزاحة بروتينات ربط SAH غير المرتبطة تشابكياً بمركب التقاط SAH.

بعد انتهاء فترة الحضن، قم بجمع حبيبات capra من المعلقات باستخدام capra mag وتخلص من السائل الطافي. بعد ذلك، اغسل الحبيبات عن طريق إعادة تعليقها في 200 microliters من محلول غسيل منظم (wash buffer) بتركيز واحد مرة، ثم اجمع الحبيبات عن طريق الفصل المغناطيسي. كرر عملية الغسل هذه خمس مرات، ثم أعد تعليقها في 200 microliters من ماء milli Q واجمع الحبيبات عن طريق الفصل المغناطيسي.

أعد تعليق الحبيبات في 200 µL من أسيتونيتريل بتركيز 60% واجمع الحبيبات باستخدام capri mag. كرر عملية الغسل بالأسيتونيتريل مرتين. استخدم الموجات فوق الصوتية إذا تعذر إعادة تعليق الحبيبات بسهولة.

بعد ذلك، قم بتحرير البروتينات الملتصقة من الخرزات بإضافة 200 µL من محلول 60% acetyl nitrile و 0.2% Tri Fluor acetic acid المحضر حديثاً، يليه تحضين لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة مع الرج الشديد. ومرة أخرى، استخدم الموجات فوق الصوتية إذا تعذر إعادة تعليق الخرزات بسهولة.

أخيرًا، قم بجمع الخرزات مغناطيسيًا وتخلص منها. قم بقص شريط الأنابيب إلى أنابيب منفردة، واثقب الأغطية وبخّر الطافي حتى يجف. باستخدام مبخر طرد مركزي في هذه المرحلة، يمكن إما إخضاع البروتينات المقتنصة لـ SDS page أو معالجتها عن طريق مطيافية الكتلة كما هو موضح في القسم التالي، قم بإذابة البروتينات المقتنصة والمنطلقة من الخرزات المغناطيسية في 10 µL من بيكربونات الأمونيوم بتركيز 50 mM.

ضع العينات في حمام موجات فوق صوتية، ثم قم برج العينات بجهاز الفورتكس. بعد ذلك، أضف 1 µL من trypsin بتركيز 0.5 µg/µL في 1 mM HCL، ثم قم بإجراء طرد مركزي سريع وتحضين المحلول عند 37 °C طوال الليل. بعد التحضين الليلي، قم بإزالة الأملاح من المحلول الذي يحتوي على ببتيدات التريبتيك للبروتينات التي تم التقاطها باستخدام مادة C 18 مثل stage tips بحجم 20 µL من شركة biosystems وفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، ثم استخلص الببتيدات مرتين باستخدام 10 µL من 50% methanol و 5% formic acid.

بعد ذلك، قم بتبخير المذيب باستخدام مبخر طرد مركزي، لتبقى الببتيدات منزوعة الملوحة جافة، ثم أذب الببتيدات في 5.5 µL من حمض الفورميك بتركيز 0.1% عن طريق تطبيق الموجات فوق الصوتية في حمض مائي للموجات فوق الصوتية والخلط الدوامي. وأخيراً، قم بتحليل العينة بواسطة الكروماتوغرافيا السائلة ذات التدفق النانوي المقترنة بمطياف الكتلة الترادفي كما هو موضح في البروتوكول المكتوب. ولتحليل بيانات MS/MS، استخدم خوارزمية لتحديد البروتين مثل seaquest المدمجة في متصفح bioworks الإصدار 3.3 0.1، أو SP one، أو X tandem المدمجة في برنامج scaffold three.

يتم إجراء البحث الآلي في قاعدة البيانات مقابل أحدث قاعدة معرفية لموارد البروتينات العالمية. قاعدة بيانات Swiss Pro المتاحة عبر www.uniprot.org للكائن الحي قيد الدراسة.

قاعدة البيانات المستخدمة في الدراسة الحالية هي سلالة coli. K12 release 57 dash 11 ضمن Seaquest، حيث تم إعداد البحث الآلي في قاعدة البيانات بتفاوت مسموح قدره خمسة أجزاء في المليون لسلف الببتيد، وتفاوت قدره وحدة كتلة ذرية واحدة لأيونات الشظايا، مع خصوصية كاملة لـ trypsin تسمح بما يصل إلى انقسامين مفقودين.

اضبط تعديلات المتغيرات للسماح بالفسفرة عند السيرين والثريونين والتيروزين، وأكسدة الميثيونين، والدياميداسيون عند الأسباراجين والجلوتامين، والأسيتلة عند اللايسين والسيرين، والفورميللا عند اللايسين، والميثيلة عند الأرجينين واللايسين والسيرين والثريونين والأسباراجين. لا تستخدم التعديلات الثابتة في البحث في قاعدة البيانات. قم بتحميل ملفات DTA أو SRF التي تم إنشاؤها بواسطة Seaquest في برنامج Scaffold 3، والذي يقوم بتقييم احتمالية تعيينات الببتيد وتحديد البروتينات من خلال دمج عمليات البحث في قواعد البيانات الخاصة بـ seaquest و x tandem. يُعد برنامج Scaffold مفيداً لمقارنة قوائم البروتينات من عدة عينات والتحقق من صحتها وتصورها بسهولة.

اضبط المعايير داخل برنامج scaffold three لقبول تحديد البروتين فقط ولإظهار النتائج كضربات متميزة. اضبط الضربات بحيث تحتوي على ببتيد مميز واحد على الأقل اجتاز التحقق من الاحتمالية. وبناءً على تحليل scaffold three، خذ في الاعتبار فقط الببتيدات التي تبلغ احتماليتها 95% أو أكثر وفقاً لما حددته خوارزمية peptide profit داخل برنامج scaffold.

حددت ثلاثة برامج احتمالات تعريف البروتين لتعيينات الببتيدات المتعددة بنسبة أكبر من أو تساوي 95% وفقاً لخوارزمية protein prophet. وبالنسبة لتعريفات البروتين ذات الببتيد الواحد، تم تحديد احتمالية البروتين تعسفياً بنسبة أكبر من أو تساوي 50% مع فحص الببتيد المقابل يدوياً. تقوم البرمجيات بتجميع البروتينات في أطياف Ms ms التي تتكون من ببتيدات متشابهة ولا يمكن التمييز بينها بناءً على تحليل Ms MS وحده، وذلك تماشياً مع مبادئ الاقتصاد (parsimony).

يمكن تحديد معدل الاكتشاف الكاذب التقديري لتحديدات الببتيد باستخدام نهج قاعدة بيانات البروتين المعكوسة، ويجب أن يكون أقل من 1% هنا. يظهر تحليل SDS page والصبغ الفضي للبروتينات السليمة التي تم التقاطها في مقايسة الالتقاط. تمت إضافة كمية زائدة من SAH الحر بعد خطوة التشعيع بالأشعة فوق البنفسجية لضمان عزل البروتينات التي ترتبط بها مركبات الالتقاط تساهمياً عن طريق وظيفة التفاعل الضوئي فقط.

تم تحديد البروتينات بواسطة MS من نطاقات جل البروتين المقطوعة بعد عملية هضم Ingel Triptych. وللمقارنة، يظهر المسار الموجود في أقصى اليسار 0.25% من محلل الخلايا الكاملة لـ e coli DH five alpha التي عُزلت منها البروتينات في مقايسة الالتقاط. وتبرز هذه المقارنة الحد الهائل في تعقيد العينة الذي تحقق بفضل تقنية مركبات الالتقاط.

أجريت الضوابط في مركز الهلام وشملت ضابط المنافسة الخاص بالمقايسة. يحتوي هذا الضابط على كمية زائدة من SAH الحر كمنافس قبل خطوة التشعيع بـ UVI لمنع ارتباط البروتينات بمركب التقاط SAH عبر وظيفة انتقائية SAH. ويعد ضابط المنافسة ضرورياً لتحديد أي بروتينات تم التقاطها بشكل غير نوعي ولا ترتبط بـ SAH.

وبذلك، تكون البروتينات التي تم تحديدها في مقايسة الالتقاط، ولم تظهر في ضابط المنافسة، هي بروتينات محددة مرتبطة بـ SAH. كما تضمن ذلك تجربة سحب (pull down) بدون تشعيع بالأشعة فوق البنفسجية وبدون إضافة SAH حر.

كما أن عينة الضبط للمنافسة في عملية السحب (pull down) لا تتعرض للإشعاع، ولكنها تحتوي على SAH كمنافس. وأخيراً، يتم تعريض اختبار الالتقاط المدمج مع عملية السحب للأشعة فوق البنفسجية (UV)، ولا يتم إضافة أي SAH حر أثناء سير العمل. ومن الواضح أن الربط المتقاطع الضوئي يعزز العائد وحساسية التجربة، كما يمكن اختبار النوعية بسهولة في تجارب المنافسة باستخدام كمية فائضة من SAH الحر بدلاً من تحليل البروتينات السليمة الملتقطة بواسطة SDS page.

يمكن تحليل المزيج الكامل من البروتينات التي تم التقاطها دفعة واحدة بواسطة تقنية الكروماتوغرافيا السائلة ذات التدفق النانوي المقترنة بمطياف الكتلة الترادفي بعد عملية الهضم بالتربتيك. يمثل هذا النهج الحقيقي لتقنية CCMS وهو أكثر حساسية بكثير من التحليل باستخدام الفصل الكهربائي للهلام بـ SDS. تظهر إنزيمات METHYLTRANSFERASES وبروتينات أخرى مختارة تم تحديدها بواسطة تجارب CCMS في هذا الجدول.

تشير الأرقام المذكورة إلى تعداد الطيف الببتيدي غير المرجح لكل بروتين، حيث تم تحديد عدد أكبر بكثير من إنزيمات ناقلة الميثيل وبروتينات أخرى ترتبط بـ SAH في مقايسة الالتقاط مقارنة بطريقة السحب. كما تظهر خصوصية SAH من خلال الغياب شبه الكامل لهذه البروتينات في ضابط المنافسة. وقد تم جدولة العدد الإجمالي للبروتينات المحددة في عمليات CCMS والتداخل البروتيني بين هذه العمليات.

يتم تقديم عدد البروتينات التي تم تحديدها ببيبتيدين على الأقل بين قوسين. ويمكن استنتاج القابلية العالية لتكرار الطريقة من التداخل البروتيني العالي، وبشكل أساسي للبروتينات غير النوعية، بين التجارب المماثلة، وخاصة في البروتينات التي تم تحديدها بقوة ببيبتيدين على الأقل هنا. تصف مخططات فن تداخل البروتينات المحددة في مقايسة الالتقاط، وعينة التحكم في التنافس، وعملية السحب (pull down)، بينما تظهر أعداد جميع البروتينات المحددة على اليمين مع وضع أعداد البروتينات المحددة ببيبتيدين على الأقل بين قوسين، وتظهر أعداد ناقلات الميثيل وSAH nuclease على اليسار.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية عزل وتحديد ميثيل ترانسفيرازات (methyl transferases) أو أي مجموعات فرعية وظيفية أخرى من البروتينات من نواتج تحلل خلايا e coli أو من نواتج تحلل أنسجة أو خلايا أخرى باستخدام قياس الطيف الكتلي للمركبات الالتقاطية (CCMS). عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر تجنب تعريض المركب الالتقاطي للضوء المرئي لفترات طويلة، والحفاظ على برودة العينات، وتحضير محلول TFA Aceto Nitrile حديثاً لاستخدامه في تحرير البروتينات الملتقطة من الحبيبات المغناطيسية، وتجنب تلوث التجارب بمصادر بروتينية خارجية مثل الكيراتين الناتج عن الغبار أو عن الشخص القائم بالتجربة.

كذلك، وجدنا أن الأمر يعتمد على الإعداد المحدد، سواء كان التكوين غير النمطي، أو ما إذا كان تكوين الربط المتقاطع الضوئي يحدث بين المركب السابق للاسترداد والبروتينات والمحلول، أو ما إذا كان التكوين النمطي الموصوف حالياً هو الذي يحقق أداءً أفضل. هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.