تطبيق المواصلة NMDA مستقبلات الخلايا العصبية في الدماغ المتوسط ​​الجرذ الدوبامينية باستخدام تقنية المشبك الحيوي

يدرس علماء الأعصاب وظيفة الدماغ من خلال استقصاء كيفية تواصل العصبونات في الدماغ. هنا، يتم استحثاث تغييرات في النشاط الكهربائي لعصبون واحد عند تطبيق موصلية يتم التحكم فيها تجريبياً باستخدام تقنية الكلمب الديناميكي (dynamic clamp). أولاً، يتم قطع شرائح رقيقة من الدماغ وتخزينها في غرفة تحضين مملوءة بسائل دماغي شوكي اصطناعي.

يتم بعد ذلك نقل شريحة إلى منصة تسجيل تثبيت الرقعة (patch clamp). يتم اختيار عصبون ثم تثبيته بقطب تسجيل باستخدام كمبيوتر تثبيت ديناميكي متصل بمضخم التسجيل. يتم تطبيق موصلية مستقبل NMDA داخل الخلية.

تظهر التسجيلات الناتجة دفقات من جهود الفعل، مما يشير إلى أن تنشيط مستقبلات NMDA يمثل إحدى الآليات الخلوية التي يمكن من خلالها للخلايا العصبية الدوبامينية توليد هذه الدفقات. وتكمن الميزة الرئيسية لهذه التقنية مقارنة بالطرق الحالية، مثل حقن التيار المباشر أو العلاج الدوائي، في قدرتنا على التحديد الدقيق لتأثيرات تنشيط مستقبل محدد تجريبياً على النشاط الكهربائي لخلية عصبية حية. وبعد استخراج الدماغ بسرعة من جرذ من سلالة Bragg dolly مخدر، يتم قطع شرائح دماغية أفقية بسمك 240 micrometer باستخدام مقطع مجهري هزاز.

أثناء تقطيع الشرائح، استخدم ماصة نقل لوضعها في غرفة تحضين بدرجة حرارة 32 degree Celsius مملوءة بسائل نخاعي شوكي اصطناعي حتى يحين وقت إجراء تجارب التسجيل. تتكون منصة التسجيل داخل الخلوي من مجهر مزود بعدسات شيئية مُعدة للتصوير بالتباين المتدرج، وشاشة، ونظام تروية (perfusion system)، ومضخم من نوع multi clamp 700 B، ومحول من تماثلي إلى رقمي، ومتحكم دقيق (micro manipulator)، ووحدة رأس (head stage). يقوم جهاز كمبيوتر Mac Pro بتشغيل برنامج الحصول على البيانات Axo Graph X وبرنامج multi clamp commander؛ وبجوار منصة التسجيل داخل الخلوي وجهاز Mac Pro، يوجد جهاز كمبيوتر من شركة Sun Microsystems يعمل بنظام Linux في الوقت الفعلي، مع محوله الخاص من تماثلي إلى رقمي، والذي سيُستخدم مع تقنية المشبك الديناميكي (dynamic clamp technique).

يجب أن يقوم جهاز التسجيل داخل الخلوي بتعطير سائل دماغي شوكي اصطناعي عند درجة حرارة 35 درجة مئوية تقريبًا. إذا تم تحضير الشريحة المراد تسجيلها بشكل أفقي، استخدم ماصة نقل لوضعها في طبق بتري يحتوي على سائل دماغي شوكي اصطناعي، ثم استخدم أداة قطع لتقسيم الشريحة إلى نصفين على طول الخط الناصف. بعد ذلك، ولإجراء التسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية، استخدم ماصة لنقل الشريحة إلى جهاز التسجيل داخل الخلوي.

باستخدام العدسة الشيئية بقوة 40x، قم بمعاينة العصبون المستهدف هنا، حيث يظهر عصبون دوباميني منفرد من المادة السوداء. لاحظ جسم الخلية البيضاوي الشكل مع وجود شجيرتين ممتدتين. باستخدام جهاز سحب الماصات الدقيقة الإلكتروني P 97، اسحب أقطاباً كهربائية بمقاومة طرفية تتراوح من 4 إلى 10 mega ohms.

بعد ذلك، وباستخدام إبرة حقنة دقيقة، املأ القطب الكهربائي بالمحلول الداخلي. أدخل القطب المملوء في نصف الخلية، المتصل بمرحلة الرأس الخاصة بالمضخم، باستخدام حقنة متصلة بنصف الخلية عبر قطعة قصيرة من الأنابيب. طبق مقداراً صغيراً من الضغط الموجب على قطب التسجيل.

تحت التوجيه البصري، قم بخفض القطب الكهربائي على العصبون المستهدف. ستظهر نقرة على سطح الخلية. قم بتطبيق كمية صغيرة من الضغط السلبي لإنشاء ختم جيجا (giga seal) على العصبون المطلوب.

استخدم الشفط بالفم لكسر الختم. يمثل هذا تسجيلاً للخلية الكاملة. بعد كسر الختم، استخدم واجهة برنامج multi clamp commander لضبط المضخم على وضع تثبيت التيار (current clamp mode) الذي لا يمكن فيه حقن أي تيار.

لتطبيق توصيل NMDA في هذه الخلية، ابدأ بتشغيل برنامج RTXI على جهاز كمبيوتر clamp الديناميكي. ثم قم بتحميل نموذج مكتوب خصيصاً يحتوي على مستقبل NMDA في الذاكرة. وبمجرد تحميل النموذج في ذاكرة RTX، سأقوم بحساب التيار الذي سيتم حقنه في الخلية في الوقت الفعلي باستخدام المعادلة الموضحة هنا، حيث G-N-M-D-A هو التوصيل المطلوب بوحدة nanos, Semens ومضبط على صفر nanos.

في إعدادات Semens الافتراضية، يمثل MG تركيز المغنيسيوم. وE-N-M-D-A هو جهد العكس لمستقبل NMDA والذي تم ضبطه على صفر millivolts، بينما يمثل VM جهد غشاء الخلية المقاس بواسطة المضخم بـ millivolts. الآن، باستخدام كابل BNC القياسي، قم بتوصيل المخرج من جهاز كمبيوتر clamp الديناميكي بمدخل الأمر الخاص بالمضخم باستخدام محول تماثلي رقمي.

ضع المضخم في وضع تثبيت التيار القياسي ic باستخدام واجهة برنامج multi clamp commander. لقد تم إعداد RTXI لاستقبال الموصلية المطلوبة GFT من إشارة جهد من برنامج الحصول على البيانات Axo Graph X. نقوم هنا بتنفيذ بروتوكول AXO Graph X بسيط يتم فيه تطبيق خطوة موصلية بقيمة 40 nano Siemens على الخلية لمدة ثانية واحدة.

يتم استثارة دفقة من جهد الفعل استجابةً لخطوة الموصلية باستخدام الإعداد الموصوف في هذا الفيديو، حيث تم إجراء تسجيل جسدي للخلية الكاملة من عصبون دوباميني في المادة السوداء الجزء المدمج. عادةً ما تطلق الخلايا الدوبامينية نبضات تلقائية بمعدلات منخفضة وبنمط يشبه منظم ضربات القلب. ويمكن استثارة دفقة من جهد الفعل من خلال التطبيق الطوري لموصلية مستقبل NMDA باستخدام التثبيت الديناميكي.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تطبيق موصلية NMDA في عصبون دوباميني حي ضمن شريحة دماغية معزولة. ومع ذلك، يمكن استخدام هذه التقنية مع أي نوع من الخلايا التي يمكن تسجيلها باستخدام تقنيات الفيزيولوجيا الكهربائية القياسية. وبالمثل، يمكن توسيع نطاق استخدام الملقط الديناميكي (dynamic clamp) لمحاكاة التأثيرات الكهربائية لمجموعة واسعة من أنواع المستقبلات.

نأمل أن يكون هذا الفيديو مفيداً في توضيح ماهية تقنية المشبك الديناميكي (dynamic clamp) وكيفية استخدامنا لها في مختبرنا. شكراً لكم على المشاهدة.