الأليل محددة التعبير الجيني الفحص لفحص الأسس الفنية للجمعيات الوراثية

الهدف العام من التجربة التالية هو اختبار ما إذا كان متغير معين من الـ DNA، مثل ذلك المرتبط بمرض ما، له تأثير على تعبير جين معين. ويتم تحقيق ذلك عن طريق اختيار خطوط خلوية متباينة الزيجوت (heterozygous) لكل من هذا المتغير وتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (snip) المشفرة في الجين المستهدف. وكخطوة ثانية، يتم استخلاص الـ DNA والـ RNA من الخلايا ثم استخدامهما كقالب لتفاعل التمديد الأولي النوعي للأليل (allele specific primary extension reaction).

بعد ذلك، يتم تحليل نواتج التمديد الأولية بواسطة مطيافية الكتلة من أجل تقدير الوفرة النسبية للأليلين. وتُستخلص النتائج التي توضح ما إذا كان متغير DNA الأصلي المرتبط بمرض معين يرتبط أيضاً باختلاف في التعبير الجيني بناءً على قياسات كمية محددة للأليلات بواسطة مطيافية الكتلة. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها، على عكس مقايسة الجين المراسل لـ luciferase، لا تتطلب تلاعباً جزيئياً وتقيس المستويات الداخلية للتعبير الجيني.

علاوة على ذلك، يمكننا مقارنة مستويات التعبير بين الأليلين بطريقة تعتمد على ضوابط داخلية، مما يقلل من بعض المتغيرات التجريبية. وتساعدنا هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال الوراثة البشرية، مثل الآليات الجزيئية الكامنة وراء الارتباطات الجينية. وقد تبلورت فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما حددنا ارتباطاً جينياً يمتد عبر ثلاثة جينات ولم نتمكن من حصر الإشارة في جين واحد.

عن طريق المزيد من التخطيط الجيني. يجب أن تعبر الخلايا المستخدمة في هذا المقايسة عن الجين المستهدف بالإضافة إلى تلبية مطلبين نمطيين جينيين أساسيين. يجب أن تكون الخلايا متغايرة الزيغ لكل من تسلسلات DNA المرتبطة بالمرض وعلامات DNA، والتي يمكنها تمييز النسخ بناءً على أصلها الكروموسومي. في استراتيجية اختيار الخطوط الخلوية الموضحة هنا، يكون الخطان الخلويان A و B، حيث يكون A متغاير الزيغ بالنسبة لعلامة تشفير منسوخة ممثلة بمثلثات.

ومع ذلك، فإن خط خلايا Omnicell A متباين الزيغات بالنسبة لتسلسل DNA المرتبط بالمرض، وهو ما يسمى بمتغير DNA الخطورة المتمثل في الدوائر. ويرتبط الأليل الأزرق لمتغير الخطورة بمستوى أقل من النسخ. بعد اختيار مزرعة الخط الخلوي، والخلايا في قارورة وفقاً لمواصفات المورد، سنستخدم الخلايا الليفية في هذا العرض التوضيحي. وبالرغم من أن هذا المقايسة قابلة للتطبيق بالتساوي على أنواع الخلايا الأخرى، بما في ذلك الخلايا الأولية، قم بتجهيز طبقين بتري بقطر 10 سنتيمتر لاستخلاص DNA وRNA على التوالي.

عندما تصل الخلايا إلى 80% من درجة الالتحام، يمكن حصادها لاستخلاص DNA و RNA باستخدام الطرق القياسية، بما في ذلك الأطقم المتاحة تجاريًا والمناسبة لنوع الخلايا المختار. قبل إجراء هذا المقايسة، صُمم زوجان من بادئات PCR لكل علامة DNA، زوج لتضخيم DNA الجينومي والآخر لتضخيم CDNA؛ حيث يتم وضع البادئات الأمامية والعكسية لتضخيم CDNA في إكسونات مختلفة لتجنب التلوث الجينومي. صُممت البادئات للحصول على ناتج PCR يتراوح طوله بين 100 إلى 500 base pairs لكل خط خلوي. يتم تحضير تفاعلات PCR بحجم 8 µL، بحيث تشمل أربعة تفاعلات مستقلة لتضخيم DNA الجينومي وأربعة تفاعلات مستقلة لتضخيم CDNA في كل مرة.

يحتوي المزيج الخاص بتفاعل PCR على DNA القالب، وNTPs، والبادئات، وكلوريد المغنيسيوم، وإما DNA جينومي أو cDNA. قم بتشغيل تفاعلات PCR وفقاً للظروف المثلى لكل زوج من البادئات، مع الحفاظ على عدد الدورات ضمن المرحلة الخطية للتضخيم. وبمجرد اكتمال تفاعلات PCR، قم بإزالة بادئات PCR والـ dNTPs الزائدة عن طريق إضافة exonuclease one وshrimp alkaline phosphatase SAP إلى كل ناتج PCR والتحضين عند 37 درجة مئوية لمدة 20 دقيقة، تليها 15 دقيقة عند 85 درجة مئوية.

قم بنقط كل ناتج PCR مرتين على لوحة تحتوي على 384 بئراً، بحيث تتوفر ثماني قياسات لكل عينة. إجمالي 16 نقطة لاختبار التمديد الأولي. صمم بادئ التمديد باستخدام برنامج تصميم الاختبار بحيث يمكن استخدام البادئ نفسه لكل من نواتج genomic و C-D-N-A-P-C-R.

حدد طول البادئ في نطاق يتراوح من 14 إلى 18 زوجاً قاعدياً. قم بإجراء تفاعل التمديد الأولي باستخدام المزيج المناسب من ثلاثة من منهيات الديوكسي نوكليوتيد ومنهي ديوكسي نوكليوتيد واحد. يتضمن تفاعل التمديد الأولي النموذجي خطوة بدئية عند 94 °C لمدة دقيقتين، تليها 40 دورة عند 94 °C لمدة خمس ثوانٍ، و52 °C لمدة خمس ثوانٍ، و72 °C لمدة خمس ثوانٍ.

أخيرًا، يتم تقدير كمية قليلات النوكليوتيد الممتدة عن طريق مطيافية الكتلة بوقت الطيران مع التأين بامتزاز الليزر بمساعدة المصفوفة باستخدام مطياف كتلة قارئ طيفي. وتتمثل النقطة الجوهرية في هذا البروتوكول في استخدام استراتيجيات متعددة للتحكم في الضجيج التجريبي لاستبعاد النتائج الزائفة. ومن المهم جدًا تكرار التجربة ثلاث مرات على الأقل.

أفضل ضابط للتجربة هو استخدام خط خلوي متغاير الزيجوت في اختبار قص الطلاء (coating snip assay) للتمديد الأولي، بشرط ألا يحمل الأليل المرتبط بالمرض. بالإضافة إلى ذلك، ينبغي تصميم اختبارات لعلامات ترميز بديلة من الحمض النووي المنسوخ. وفي حال عدم توفر هذه العلامات، يمكن توفير ضابط إضافي من خلال استخدام أزواج بديلة من بادئات PCR تستهدف إكسونات مختلفة لاختبار التمديد الأولي.

يمكن توفير ضابط داخلي من خلال تصميم بادئات تمديد تلتصق بكل من الشريطين الأمامي والعكسي. يظهر هنا مثال على تحليل التعبير الجيني الخاص بالأليل مع أمثلة على آثار مطيافية الكتلة. يوضح هذا الشكل نتائج تحليل أربعة نواتج تمديد أولية خاصة بالأليل تم إجراؤها على أربعة قوالب مختلفة.

يمثل الرسمان البيانيان العلويان النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل الحمض النووي الريبوزي منقوص الأكسجين (genomic DNA) لسلالتين خلويتين مختلفتين، وكلاهما متغاير الزيجوت بالنسبة لتعدد أشكال تشفيري منسوخ. ومع ذلك، فإن السلالة الخلوية A وحدها هي متغايرة الزيجوت بالنسبة لتباين الحمض النووي المرتبط بالمخاطر. أما الرسمان البيانيان السفليان فيمثلان النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل الـ CDNA الناتج عن السلالات الخلوية نفسها نتيجة لخطأ تجريبي.

تكون القمة الأولى دائماً أعلى من القمة الثانية، حتى في التحليل الجينومي. وبناءً على ذلك، تُستخدم نتائج التحليل الجينومي لمعايرة بيانات CDNA. ويتم إجراء التحليل الإحصائي عن طريق استخراج تقرير نمط ELO كاملاً ضمن برنامج mass array.

يوفر هذا التقرير بيانات حول مساحة القمة، ونعرض هنا مثالاً يتعلق بخطين خلويين، الخلية A والخلية B، وكلاهما متغاير الزيجوت لـ snip مشفر، ولكن الخلية A فقط هي متغايرة الزيجوت لعلامة مرتبطة بالمرض. يتم إنشاء الأعمدة المظللة باللون الرمادي مباشرة بواسطة البرنامج، بينما يتم اشتقاق الأعمدة المظللة باللون الأخضر يدوياً لكل خلية. هناك ثمانية قياسات لكل من CDNA و DNA الجينومي.

سيقوم البرنامج بحساب المساحة الواقعة تحت كل ذروة في الطيف، والتي تمثل وفرة كل من الأليلين. ويتم حساب نسبة الأليل عن طريق قسمة مساحة الأليل الأول على مساحة الأليل الثاني لكل عينة من الـ CDNA والعينات الجينومية. كما يتم حساب المتوسط والخطأ المعياري عبر القياسات الثمانية.

يشير الخطأ المعياري المرتفع الذي يتجاوز 0.1 إلى أن القياسات غير متسقة ويجب تجاهلها. وأخيراً، يتم تطبيع متوسط نسبة CDNA باستخدام متوسط نسبة DNA الجينومي لتقدير الانحراف عن النسبة واحد، وهي النسبة المتوقعة عند عدم وجود اختلاف في التعبير الجيني الخاص بالأليل. وبما أن النسبة المطبّعة تختلف عن الواحد في الخلية A، بينما تقترب من الواحد في الخلية B، فإن البيانات تشير إلى أن الخط الخلوي A يحمل متغيراً في DNA متوافقاً في الطور مع الأليل الذي تم قياسه بواسطة الذروة الثانية، مما يقلل من تعبير الجين قيد التحليل.

يوفر الخط الخلوي B ضابطاً سالباً ملائماً للغاية. وبينما تعد محاولة تنفيذ هذا الإجراء أمراً بالغ الأهمية لتحديد المتغيرات الجينية ذات الدلالة وتحديد الضوابط التجريبية المناسبة باتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى مثل الترسيب المناعي للكروماتين الخاص بالنمط الفرداني، والتي تساعدك في الإجابة على أسئلة مثل الحالات التي يوجد فيها متغير جيني لا تتوفر له علامات منسوخة يمكن استخدامها لتحليل التعبير الجيني الخاص بالأليل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل الـ RNA بطريقة محددة للأليل، وكيفية استخدام ذلك لفهم المتغيرات الوظيفية ذات الأهمية الوراثية.