الأليل محددة التعبير الجيني الفحص لفحص الأسس الفنية للجمعيات الوراثية

الهدف العام من التجربة التالية هو اختبار ما إذا كان لمتغير معين في DNA، مثل ذلك المرتبط بمرض ما، تأثير على تعبير جين معين. ويتم تحقيق ذلك من خلال اختيار خطوط خلوية تكون متباينة الزيجوت (heterozygous) لكل من هذا المتغير وتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (snip) المشفر في الجين المستهدف. وكخطوة ثانية، يتم استخلاص DNA وRNA من الخلايا ثم استخدامهما كقالب لتفاعل تمديد أولي محدد للأليل.

بعد ذلك، تُحلل نواتج التمديد الأولية عن طريق مطيافية الكتلة من أجل تقدير الوفرة النسبية للأليلين. ويتم الحصول على نتائج تبين ما إذا كان متغير DNA الأصلي المرتبط بمرض معين مرتبطاً أيضاً باختلاف في التعبير الجيني بناءً على قياسات كمية محددة للأليل بواسطة مطيافية الكتلة. وتتمثل المزايا الرئيسية لهذه التقنية في أنها لا تتطلب تلاعباً جزيئياً على عكس مقايسة جين مراسل لـ luciferase، كما أنها تقيس المستويات الداخلية للتعبير الجيني.

علاوة على ذلك، يمكننا مقارنة مستويات التعبير بين الأليلين بطريقة ذات تحكم داخلي، مما يقلل من بعض التباينات التجريبية. وتساعدنا هذه الطريقة في الإجابة عن أسئلة رئيسية في مجال الوراثة البشرية، مثل الآليات الجزيئية الكامنة وراء الارتباطات الجينية. وقد تبلورت فكرة هذه الطريقة لدينا عندما حددنا ارتباطاً جينياً يمتد عبر ثلاثة جينات ولم نتمكن من حصر الإشارة في جين واحد.

من خلال المزيد من رسم الخرائط الجينية. يجب أن تعبر الخلايا المستخدمة في هذا المقايسة عن الجين المستهدف بالإضافة إلى استيفاء مطلبين نمطيين جينيين أساسيين. إذ يجب أن تكون متغايرة الزيجوت لكل من تسلسلات DNA المرتبطة بالمرض وعلامات DNA، والتي يمكنها تمييز النسخ بناءً على أصلها الكروموسومي. في استراتيجية اختيار الخطوط الخلوية الموضحة هنا، تكون الخطوط الخلوية A وB، وA متغايرة الزيجوت لعلامة تشفير منسوخة ممثلة بمثلثات.

ومع ذلك، فإن سلالة Omnicell A متباينة الزيجوت بالنسبة لتسلسل DNA المرتبط بالمرض، والذي يسمى متغير DNA الخطر والمتمثل بالدوائر. ويرتبط الأليل الأزرق لمتغير الخطر بمستوى أقل من النسخ. بعد اختيار استزراع السلالة الخلوية، والخلايا في قارورة وفقاً لمواصفات المورد، سنستخدم الخلايا الليفية في هذا العرض التوضيحي. وبالرغم من أن هذا المقايسة قابلة للتطبيق بالتساوي على أنواع الخلايا الأخرى، بما في ذلك الخلايا الأولية، قم بتجهيز طبقين بتري بمقاس 10 سنتيمتر لاستخلاص DNA و RNA على التوالي.

عندما تصل الخلايا إلى 80% من درجة التلاقي، يمكن حصادها لاستخلاص DNA و RNA باستخدام الطرق القياسية، بما في ذلك الأطقم المتوفرة تجارياً والمناسبة لنوع الخلايا المختار. قبل إجراء هذا المقايسة، صُمم زوجان من بادئات PCR لكل علامة DNA، زوج لتضخيم DNA الجينومي والآخر لتضخيم CDNA؛ يتم وضع البادئات الأمامية والعكسية لتضخيم CDNA في إكسونات مختلفة لتجنب التلوث الجينومي. صُممت البادئات للحصول على ناتج PCR يتراوح طوله بين 100 إلى 500 زوج قاعدي لكل خط خلوي. يتم تحضير تفاعلات PCR بحجم 8 µL، بحيث تكون هناك أربعة تفاعلات مستقلة لتضخيم DNA الجينومي وأربعة تفاعلات مستقلة لتضخيم CDNA في كل مرة.

يحتوي المزيج الخاص بتفاعل PCR على DNA القالب، وNTPs، والبادئات، وكلوريد المغنيسيوم، وإما DNA جينومي أو cDNA. يتم تشغيل تفاعلات PCR وفقاً للشروط المثلى لكل زوج من البادئات، مع الحفاظ على عدد الدورات ضمن المرحلة الخطية للتضخيم. وبمجرد اكتمال تفاعلات PCR، يتم إزالة بادئات PCR وdNTPs الزائدة عن طريق إضافة exonuclease one وshrimp alkaline phosphatase SAP إلى كل ناتج PCR وتحضينه عند 37 °C لمدة 20 دقيقة، تليها 15 دقيقة عند 85 °C.

ضع كل ناتج PCR مرتين على لوحة ذات 384 بئراً، بحيث يتوفر ثمانية قياسات لكل عينة. بإجمالي 16 نقطة لاختبار الامتداد الأولي. صمم بادئ الامتداد باستخدام برنامج تصميم الاختبار بحيث يمكن استخدام البادئ نفسه لكل من نواتج genomic و C-D-N-A-P-C-R.

حدد طول البادئ في نطاق يتراوح من 14 إلى 18 زوجاً قاعدياً. قم بإجراء تفاعل التمديد الأولي باستخدام المزيج المناسب من ثلاثة من ملقنات ديوكسي نوكليوتيد واحد من ديوكسي نوكليوتيد. يتضمن تفاعل التمديد الأولي النموذجي خطوة بدئية عند 94 °C لمدة دقيقتين، تليها 40 دورة تتكون من 94 °C لمدة خمس ثوانٍ، و 52 °C لمدة خمس ثوانٍ، و 72 °C لمدة خمس ثوانٍ.

أخيرًا، يتم تقدير كمية قليلات النيوكليوتيد الممتدة بواسطة مطيافية الكتلة لزمن الطيران بالتأين بامتزاز الليزر المساعد بالمصفوفة باستخدام مطياف كتلة قارئ طيفي. تكمن النقطة الأساسية في هذا البروتوكول في استخدام عدة استراتيجيات للتحكم في الضوضاء التجريبية لاستبعاد الشوائب الاصطناعية. ومن المهم جدًا تكرار التجربة ثلاث مرات على الأقل.

تتمثل أفضل ضابطة للتجربة في استخدام خط خلوي متغاير الزيجوت لمقايسة snip الخاصة بالطلاء من أجل التمديد الأولي، ولكن بشرط ألا يحمل الأليل المرتبط بالمرض. بالإضافة إلى ذلك، يجب تصميم مقايسات لعلامات تشفير بديلة منسوخة من DNA. وفي حال عدم توفرها، يمكن توفير ضابطة إضافية باستخدام أزواج بديلة من بادئات PCR تستهدف إكسونات مختلفة لمقايسة التمديد الأولي.

يمكن توفير ضابط داخلي من خلال تصميم بادئات تمديد ترتبط بكل من السلاسل الأمامية والعكسية. يظهر هنا مثال على تحليل التعبير الجيني الخاص بالأليل مع نماذج من آثار مطيافية الكتلة. يوضح هذا الشكل نتائج تحليل أربعة نواتج تمديد أولية خاصة بالأليل تم إجراؤها على أربعة قوالب مختلفة.

يمثل الرسمان البيانيان العلويان النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل DNA الجينومي لسلالتين خلويتين مختلفتين، وكلاهما متغاير الزيجوت فيما يتعلق بتعدد أشكال تشفيري منسوخ. ومع ذلك، فإن السلالة الخلوية A فقط هي متغايرة الزيجوت بالنسبة لتباين DNA المرتبط بالمخاطر. أما الرسمان البيانيان السفليان فيمثلان النتائج التي تم الحصول عليها من تحليل cDNA الناتج عن السلالات الخلوية نفسها نتيجة لخلل تجريبي.

تكون القمة الأولى دائمًا أعلى من القمة الثانية، حتى في التحليل الجينومي. وبناءً على ذلك، تُستخدم نتائج التحليل الجينومي لمعايرة بيانات الـ CDNA. ويتم إجراء التحليل الإحصائي عن طريق استخراج تقرير أنماط ELO الكامل ضمن برنامج mass array.

يوفر هذا التقرير بيانات حول مساحة القمة، ونعرض هنا مثالاً يتعلق بخطين خلويين، الخلية A والخلية B، وكلاهما متغاير الزيجوت لـ snip مشفر، ولكن الخلية A فقط هي متغايرة الزيجوت لعلامة مرتبطة بمرض ما. يتم توليد الأعمدة المظللة باللون الرمادي مباشرة بواسطة البرنامج، بينما يتم اشتقاق الأعمدة المظللة باللون الأخضر يدوياً لكل خلية. هناك ثمانية قياسات لكل من CDNA و DNA الجينومي.

سيقوم البرنامج بحساب المساحة الموجودة تحت كل قمة في الطيف، والتي تمثل وفرة كل من الأليلين. ويتم حساب نسبة الأليلات عن طريق قسمة مساحة الأليل الأول على مساحة الأليل الثاني لكل عينة من cDNA والعينات الجينومية. كما يتم حساب المتوسط والخطأ المعياري عبر القياسات الثمانية.

يشير الخطأ المعياري العالي الذي يتجاوز 0.1 إلى أن القياسات غير متسقة ويجب تجاهلها. وأخيراً، يتم تطبيع متوسط نسبة CDNA باستخدام متوسط نسبة DNA الجينومي لتقدير الانحراف عن نسبة واحد، وهي النسبة المتوقعة عند عدم وجود فرق في التعبير الجيني الخاص بالأليل. وبما أن النسبة المطبعة تختلف عن واحد في الخلية A، ولكنها قريبة من واحد في الخلية B، فإن البيانات تشير إلى أن الخط الخلوي A يحمل متغيراً في DNA مترافقاً مع الأليل الذي تم قياسه بواسطة القمة الثانية، مما يقلل من التعبير عن الجين قيد التحليل.

يوفر الخط الخلوي B ضابطاً سالباً ملائماً للغاية. وبينما تُعد محاولة تنفيذ هذا الإجراء أمراً بالغ الأهمية لتحديد المتغيرات الجينية المعلوماتية وتحديد الضوابط التجريبية المناسبة باتباع هذا الإجراء، يمكن استخدام طرق أخرى مثل الترسيب المناعي للكروماتين النوعي للنمط الفرداني، والتي تساعدك في الإجابة على أسئلة مثل تحديد مكان وجود متغير جيني لا تتوفر له علامات منسوخة يمكن استخدامها لتحليل التعبير الجيني النوعي للأليل.

بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية تحليل RNA بطريقة محددة للأليل، وكيفية استخدام ذلك لفهم المتغيرات الوظيفية ذات الأهمية الوراثية.