السلوكي الصيدلة في الإشراط الكلاسيكي للاستجابة ملحق خرطوم في نحل العسل ( أبيس mellifera)

الهدف العام من هذا الإجراء هو دراسة الآليات الجزيئية الكامنة وراء التعلم وتكوين الذاكرة. وفي نحل العسل، تتمثل الخطوة الأولى في جمع النحل الطائر بحرية من خليته. بعد ذلك، يتم تثبيت النحل في أنابيب بلاستيكية.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في إجراء الإشراط الكلاسيكي. ويمكن حقن الأدوية في نقاط زمنية محددة حول عملية الإشراط لدراسة تأثيرها على التعلم وتكوين الذاكرة. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي اختبار استبقاء الذاكرة.

وفي نهاية المطاف، قد تكشف التغيرات في السلوك بعد العلاج الدوائي عن الآليات الجزيئية الكامنة وراء التعلم وتكوين الذاكرة في نحل العسل. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على أسئلة رئيسية في مجال التعلم والذاكرة من خلال كشف الآليات الجزيئية لتكوين الذاكرة.

بشكل عام، سيواجه الباحثون الجدد في هذه الطريقة صعوبات لأن توقيت تقديم المثيرات أثناء عملية الإشراط واسترجاع الذاكرة يجب أن يكون دقيقاً. كما أن نظام التغذية يعد أمراً بالغ الأهمية. سيتم توضيح الإجراء من قبل cutting gearing و Johannes faberg لطلاب الدراسات العليا في مختبري. في اليوم السابق للتجربة، يتم جمع النحل بين الساعة 2:00 و 4:00 مساءً باستخدام هرم من البلكسي جلاس المنفذ للأشعة فوق البنفسجية UV.

بمجرد العودة إلى المختبر، ضع الهرم على قاعدته وقم بتغطية الجدران بمنشفة مع ترك القمة مكشوفة. افتح القمة وأمسك بقارورة زجاجية فوق الفتحة، مع السماح لنحلة واحدة بالانتقال إلى القارورة قبل إغلاقها مرة أخرى. استمر في هذا الإجراء حتى يتم نقل جميع النحل إلى قارورة زجاجية في فصلي الخريف والشتاء.

عندما لا تطير النحل في الخارج، يتم الاحتفاظ بخلية النحل داخل دفيئة زراعية في شبكة، ويتم صيد النحل بشكل فردي مباشرة من الشبكة. باستخدام قارورة زجاجية واحدة لكل نحلة، يتم تثبيت النحلة عن طريق تبريد القارورة على الثلج لمدة تتراوح بين دقيقتين ونصف إلى ثلاث دقائق ونصف. يجب مراقبة النحلة بعناية وإخراجها من الثلج بمجرد توقفها عن الحركة.

قم بتثبيت النحلة المخدرة في أنبوب بلاستيكي صغير باستخدام شريط لاصق. تأكد من أن النحلة قادرة على تحريك منطقة الـ osis بحرية، ولكن ليس رأسها أو صدرها أو أرجلها. من المهم أيضًا عدم الضغط على الرقبة.

بمجرد تحضير النحلة، ضع الأنبوب في ثقب مرقم على الحامل، وذلك لتسهيل التعامل معه وتحديده.

تُعاد الأنابيب دائمًا إلى نفس الثقب. بعد التعامل معها، يتم تغذية النحل بين الساعة 4:00 و6:00 مساءً في موقع منفصل عن موقع التهيئة. يتم تحفيز استجابة تمدد الخرطوم أو PER عن طريق لمس النحل وقرون الاستشعار.

باستخدام محلول السكروز، اسمح للنحلة باستهلاك قطرة واحدة تبلغ حوالي 4 µL من محلول SRAs. تأكد من عدم تلطيخ قرون استشعار النحلة، أو أجزاء الفم، أو الأنبوب البلاستيكي. قم بتغذية كل نحلة حتى تتوقف عن الاستهلاك.

أظهر استجابة سريعة وموثوقة لمنعكس التوجيه (PER) عند ملامسة قرون الاستشعار للمحلول. وفي الأمسيات اللاحقة من التجربة، قم بتغذية كل نحلة أربع مرات بقطرة واحدة من محلول السكروز. املأ وعاءً بلاستيكيًا بارتفاع يتراوح تقريبًا بين 0.5 إلى 1 سم بمياه الصنبور.

ضع رف النحل المقيد في الوعاء باستخدام أطباق lysa كمنصة. غطِّ الوعاء بقطعة من الورق المقوى واحفظه في درجة حرارة الغرفة طوال الليل. يخضع النحل للتكييف الشمي في حوالي الساعة 10:00 صباحاً في اليوم التالي لعملية الجمع.

قبل 30 دقيقة من بدء التجربة، ضع رف نحلاطّواع (harness bees) بالقرب من موقع التكييف، ولكن بعيداً عن فتحة أنبوب العادم حيث سيتم تدريب النحل. بعد ذلك، قم بتحضير محفز التكييف أثناء العمل داخل غطاء سحب الأدخنة (hood).

استخدم طرف ماصة مرشح لسحب 4 µL من زيت القرنفل ووضعه على ورقة ترشيح مستديرة. ضع ورقة الترشيح المعطرة داخل محقنة سعة 20 mL ثم أدخل المكبس. قم بضبط مشغل الصوت الذي سيصدر إشارة صوتية للمجرب.

يضمن ذلك التوقيت الدقيق للمنبه، وبداية المنبه، ونهايته، ومدته، وموضعه. استعد لتسجيل سلوك النحلة طوال فترة الإشراط. تُمنح درجة إيجابية إذا قامت النحلة ببسط الـ SSIS الخاصة بها بين بداية المنبه الشرطي وتقديم المنبه غير الشرطي.

عبور خط افتراضي بين الفكين المفتوحين. لبدء تجربة اكتساب، اختر النحلة المراد تدريبها وضعها أمام مخرج الهواء لمدة 10 ثوانٍ. وقبل نهاية هذه الفترة الزمنية البالغة عشر ثوانٍ بوقت قصير، ضع السرنجة التي تحتوي على الرائحة على بُعد ثلاثة سنتيمترات من قرون استشعار النحل. قم بتقديم الرائحة على مدى خمس ثوانٍ عن طريق دفع 20 milliliters من الهواء عبر السرنجة.

بعد مرور ثلاث ثوانٍ، يتم تقديم المثير غير الشرطي عن طريق لمس الجزء البطني من السوط الطرفي لكلتا قرني الاستشعار باستخدام محلول سكروز، وعود أسنان رطب. مع الحرص على عدم ترسيب المحلول على النحل وقرون الاستشعار، يُترك النحل بعد ذلك ليلعق عود الأسنان. يستمر هذا المثير المركب لمدة أربع ثوانٍ، ثم يُزال النحل من سياق التدريب ويُعاد وضعه في الحامل.

تستغرق محاولة التدريب الواحدة 28 ثانية، وذلك بعد 13 ثانية من تقديم المثير الشرطي. أعد النحلة إلى موقع التدريب بعد فترة فاصلة بين المحاولات مدتها 10 دقائق. قم بإجراء المحاولة الثانية من أصل ثلاث محاولات كما تم توضيحه سابقاً، وانتظر 10 دقائق إضافية قبل إجراء عملية الاقتران النهائية.

بعد اكتمال التدريب لهذا اليوم، أعد الرفوف إلى الوعاء. تذكر تغذية كل نحلة أربع مرات بقطرة واحدة بحجم 4 µL من محلول السكروز بين الساعة 4:00 و6:00 مساءً. وكما تم توضيحه سابقاً، يمكن إجراء اختبارات الاستبقاء في أي فاصل زمني يتراوح من دقائق إلى أيام بعد التدريب. استعد لاختبار الذاكرة عن طريق وضع رف النحل بالقرب من موقع التكييف لمدة 30 دقيقة.

ابدأ الاختبار بوضع نحلة أمام مخرج العادم لمدة 10 ثوانٍ. قدّم منبه الحالة لمدة خمس ثوانٍ وسجّل حدوث استجابة تباعد الأجنحة (PER). بعد اكتمال الاختبار لهذا اليوم، أعد الرفوف إلى الوعاء.

تذكر تغذية كل نحلة أربع مرات بقطرة واحدة بحجم 4 µL من محلول السكروز بين الساعة 4:00 و6:00 مساءً كما تم توضيحه سابقاً؛ وفي نهاية التجربة بأكملها، تحقق من أن النحلة لا تزال قادرة على بسط خرطومها عن طريق لمس قرن الاستشعار بمحلول SRAs ليتم إدراجها في التحليل. يجب أن تنجو النحلات طوال فترة التجربة وأن يكون لديها استجابة تمدد الخرطوم (PER) سليمة. وفي بعض الدراسات، تُستخدم الحقن الجهازية لدراسة تأثير التدخلات الدوائية على الذاكرة الشمية، ويمكن إعطاء هذه الحقن في أوقات مختلفة اعتماداً على تصميم التجربة.

للبدء، اصنع ثقباً صغيراً في جدار القشيرة بالجزء الخلفي من S scootin بالقرب من شق S scootle فوق عضلة الطيران، وذلك باستخدام إبرة تحت الجلد مخصصة للاستخدام مرة واحدة. بعد ذلك، املأ أنبوباً شعرياً زجاجياً بمقدار 1 µL من المحلول المراد اختباره. أدخل الأنبوب الشعري في الثقب الموجود في القشيرة ثم احقن المحلول في عضلة الطيران.

يستطيع المجربون المدربون حقن B واحدة كل 30 ثانية، مما يسمح بتوقيت دقيق للحقن والاشتراط. يتم عرض تجربتين هنا؛ حيث تدرس التجربة الأولى تأثير الحقن الجهازي للمحلول الملحي الذي يُعطى قبل التدريب على تعلم الذاكرة.

هناك ثلاث مجموعات في هذه الدراسة: المجموعة A التي لم تتلقَّ أي علاج، ومجموعة تلقت حقناً جهازياً بحجم 1 µL من المحلول الملحي الموقّت بالفوسفات، ومجموعة وهمية. تم إعطاء هذه العلاجات قبل 30 دقيقة من التدريب الموضح هنا على اليسار. وقد ارتفعت نسبة الحيوانات التي أظهرت الاستجابة الشرطية خلال مرحلة الاكتساب عبر تجارب التدريب الثلاث، دون وجود فروق بين المجموعات.

تظهر الرسوم البيانية العمودية على اليمين أن كلاً من حقن PBS والآفة الوهمية لم تؤثرا على الاحتفاظ بالذاكرة. بعد 24 ساعة من التدريب في التجربة الثانية، أُعطيت الحقن بعد 40 دقيقة من التدريب، حيث قُسمت النحلات إلى مجموعة تلقت محلولاً ملحياً ومجموعة أخرى تلقت 1 µL من مثبط تخليق البروتين Anisomycin؛ وتظهر الرسوم البيانية العمودية على اليمين انخفاضاً واضحاً في الاحتفاظ بالذاكرة لدى النحلات التي تلقت Anisomycin. تسلط هذه النتائج الضوء على أهمية تخليق البروتين في تكوين الذاكرة الشمية.

بعد اتباع هذا الإجراء، يمكن إجراء تسجيلات كهرومغناطيسية وكهربية للإجابة على أسئلة إضافية، مثل ما هو الأساس الفيزيولوجي العصبي لتكوين التعلم والذاكرة بعد تطوره؟ لقد مهدت هذه التقنية الطريق للباحثين في مجال أبحاث التعلم والذاكرة لاستكشاف الآليات الجزيئية والفيزيولوجية العصبية في تكوين الذاكرة لدى نحل العسل.