النظائر مستقرة من التنميط التمويه الاستقلابية المتوسطة في مرحلة تطوير والكبار انواع معينة ايليجانس

الهدف العام من التجربة التالية هو المراقبة غير الغازية للتغيرات الأيضية في الوقت الفعلي على مستوى الحيوان الكامل ضمن عملية تحلل السكر، وأيض البيروفات، ودورة حمض ثلاثي الكربوكسيل، والتي تنتج عن مسارات أيضية فردية، أو تغيرات جينية، و/أو علاجات دوائية. ويتم تحقيق ذلك عن طريق تغذية الديدان الخيطية الحية بنظائر مستقرة لتوفير إثراء نظيري كافٍ في المزيد من المستقلبات، مما يسمح بقياس التغيرات الجينية و/أو الدوائية في المسارات الأيضية الوسيطة. وكخطوة ثانية، يتم قياس الاندماج النظيري في ثاني أكسيد الكربون الجوي والمذاب بواسطة مطياف كتلة نسبة الغاز، مما يوفر تقييماً أكثر مباشرة للتدفق الأيضي الوسيط على فترات زمنية قصيرة.

تتم معالجة العينات التالية لتحليل الأحماض الأمينية الحرة في الدودة بأكملها باستخدام تقنية HPLC، بالإضافة إلى تحليل الإثراء النظيري في الأحماض الأمينية والأحماض العضوية بواسطة GCMS، وذلك من أجل قياس التغير في التدفق الأيضي في النيماتودا. وبعد التعرض للنظائر المستقرة، تم الحصول على نتائج تظهر تأثيرات المدد الزمنية المتفاوتة للتعرض للنظائر، والتخلص من البكتيريا، وطرق تفتيت الديدان البديلة في الديدان من النوع البري (wild type) لاستقصاء الوفرة النظيرية في النواتج الأيضية الوسطية. ويمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية متعمقة حول الأيض الوسطي.

ويمكن تطبيق هذه الطريقة أيضاً على أنظمتنا، مثل الخطوط الخلوية الثديية والأنسجة. لقد خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما لاحظنا وجود تشوهات مستمرة في تحليل الأحماض الأمينية الحرة في الديدان باستخدام تقنية HPLC، والتي كانت تشير إلى ضعف في تدفق التمثيل الغذائي الوسيط في وظائف التغيرات التنفسية الأولية. لبدء هذا الإجراء.

تُجمع الديدان التي تعرضت لسلف استقلابي مُوسوم بنظير مستقر، سواء أثناء النمو أو في مرحلة البلوغ، في أنبوب طرد مركزي بلاستيكي سعة 1.5 milliliter. وعادةً ما نقوم بتخفيف الديدان لتصل إلى تركيز 1000 دودة لكل one milliliter. يُضاف حمض per chloric بتركيز 60% يحتوي على epsilon aminocaproic acid كمعيار داخلي إلى الديدان، ليصل التركيز النهائي إلى 4% من حمض per chloric و20 nanomolar من المعيار الداخلي.

اترك الديدان تترسب بفعل الجاذبية لمدة خمس دقائق، ثم قم بإزالة السائل الطافي وحفظه في أنبوب آخر. تعد الخطوة التالية أحد أكثر الجوانب حرجاً في هذا الإجراء؛ إذ يجب تفتيت الديدان تماماً عن طريق الغربلة قبل تحليل المستقلبات الحرة. وباستخدام مجانس بلاستيكي ومثقاب آلي، قم بطحن عينات الديدان لمدة 15 ثانية.

تحقق بصرياً من تكسير الديدان باستخدام المجهر الضوئي وأعد عملية الطحن إذا لزم الأمر. في هذه الصورة، تُظهر اللوحتان A وB الديدان قبل الطحن. وفي المقابل، تُظهر اللوحتان C وD الديدان بعد الطحن؛ انقل السائل الطافي الذي تم حفظه مسبقاً إلى أنابيب طرد مركزي بلاستيكية سعة 1.5 milliliter مع جهاز الطرد المركزي الخاص بمجانس الديدان.

قم بطرد العينات مركزياً بسرعة 2,250 RPM وقوة 1300 Gs لمدة خمس دقائق. بعد عملية الطرد المركزي، انقل السائل الطافي إلى أنبوب زجاجي نظيف سعة سبعة ملليلتر. احتفظ بالراسب لاستخدامه لاحقاً في مقايسة تركيز البروتين.

أضف الآن أربعة من هيدروكسيد البوتاسيوم العادي إلى المادة الطافية (SUPERNAT) حتى يتراوح نطاق الرقم الهيدروجيني (pH) للعينات بين سبعة وثمانية، ثم قم بالطرد المركزي للعينات المعاد تعادلها في أنابيب زجاجية سعة 7 mL بسرعة 2,250 RPM وقوة 1300 Gs لمدة خمس دقائق. ولإزالة الأملاح، انقل المادة الطافية من كل عينة إلى أنبوب زجاجي جديد سعة 7 mL. يمكن الآن تحضير العينات المعاد تعادلها لتقدير كمية المستقلبات باستخدام تقنية الكروماتوغرافيا السائلة عالية الأداء (HPLC) أو تقنية الكروماتوغرافيا الغازية المقترنة بمطياف الكتلة (GCMS). وبالنسبة لتقنية HPLC.

افصل 50 µL من كل عينة معادلة للحقن المباشر في جهاز HPLC. يتم تقدير كمية الأحماض الأمينية الحرة باستخدام الاشتقاق المسبق بـ aldehyde والكشف الفلوري. وكما تم وصفه سابقاً، ستخضع العينات المعادلة المتبقية للاستخلاص باستخدام راتنج التبادل الأيوني لـ GCMS لتحديد الإثراء النظائري في الأحماض الأمينية والأحماض العضوية كما هو موضح في القسم التالي.

لتحضير الخرزات، أضف حمض الهيدروكلوريك العادي إلى خرزات G 1 وG 50 بشكل منفصل. في دوارق سعة 1 لتر، حرك كل دورق لمدة 30 دقيقة باستخدام محرك مغناطيسي. بعد ذلك، اغسل الخرزات بالماء منزوع الأيونات 10 مرات حتى تتساوى قيمة pH لغسولات الشطف مع قيمة pH للماء.

بعد ذلك، سنعرض طريقتنا لتحضير أعمدة مخصصة منخفضة التكلفة باستخدام ماصات زجاجية. تتوفر أيضاً أعمدة جاهزة تجارياً. ولتحضير العمود، استخدم ملقطاً لإدخال سدادة قطنية فوق أضيق جزء من طرف ماصة باستور مباشرة، واستخدم حبيبات G 1 لاستخلاص الأحماض العضوية وحبيبات G 50.

لاستخلاص الأحماض الأمينية، املأ كل عمود حتى ثلث ارتفاع العمود تقريباً. إذا كانت العينة ذات pH متعادل بالفعل، فلا يُضاف شيء إلى العينة قبل وضعها في عمود AG one. ولاستخلاص الأحماض العضوية من أجل استخلاص الأحماض الأمينية، أضف 1 mL من حمض الهيدروكلوريك بتركيز 0.1 normal إلى العينة قبل وضعها في عمود AG 50.

الآن، قم بتطبيق العينات التي تم تحييدها مسبقاً على كل عمود. اغسل كل عمود 10 مرات بالماء حتى تصبح نواتج الغسيل متعادلة. بعد اكتمال عملية الغسيل، قم باستخلاص المحتويات من كل عمود في قوارير زجاجية نظيفة مخصصة للعينات سعة أربعة ملليلتر وموسومة. لاستخلاص الأحماض العضوية، أضف ثلاثة ملليلترات من حمض الهيدروكلوريك بتركيز 3 normal إلى عمود AG 1.

يتيح ذلك تحليل إثراء النظائر في العدد الإجمالي للكربونات المسمى بين الأنواع الكربونية الثلاثية، والرباعية، والخماسية، والسداسية. لاستخلاص الأحماض الأمينية، أضف 3 mL من هيدروكسيد الأمونيوم بتركيز 4 Normal إلى عمود G 50. يتيح ذلك تحليل إثراء النظائر في العدد الإجمالي للكربونات المسمى بين الأنواع الكربونية الثلاثية والخماسية.

عند الانتهاء من استخلاص كل من الأحماض العضوية والأحماض الأمينية، توضع قوارير العينات في مبخر reactive app three طوال الليل حتى تجف. بعد ذلك، يتم اشتقاق العينات وتحليلها بواسطة GCMS كما هو مفصل في نص البروتوكول. ابدأ هذا الإجراء بنقل ألف دودة بالغة شابة إلى طبق NGM agri تجريبي بقطر 35 مليمتر يحتوي على جلوكوز مُعلم عالمياً بالكربون 13 وبكتيريا e coli.

ضع بعد ذلك طبق NGM التجريبي بدون غطائه في غرفة زجاجية مخصصة، مزودة بصنبور إيقاف ثلاثي الاتجاهات محكم الغلق للسماح بأخذ عينات من الغلاف الجوي واستبدالها بدقة. غطِّ منطقة الختم حيث يستقر القرص الزجاجي الشفاف بصرياً على الطبق باستخدام شحم تفريغ عالي vacuum grease.

أغلق الغرفة باستخدام القرص الزجاجي. سجل الوقت. باعتبار هذا الوقت هو نقطة الصفر، وبعد مرور 30 دقيقة، استخدم سرنجة سعة 20 milliliter لسحب عينة قدرها 10 milliliters من الغلاف الجوي داخل الغرفة الزجاجية عبر صمام إيقاف ثلاثي الاتجاهات.

أغلق صمام التوقف المؤدي إلى الغرفة. بعد أخذ العينة، انقل العينة إلى أنبوب زجاجي مفرغ من الهواء (من النوع ذو الغطاء الأحمر) يحتوي على 1 ml من بيكربونات الصوديوم في 0.1 M من هيدروكسيد الصوديوم. بعد ذلك، احقن 10 ml من الهواء في الغرفة الزجاجية عبر صمام التوقف ثلاثي الاتجاهات. باستخدام حقنة سعة 20 ml، أغلق صمام التوقف المؤدي إلى الغرفة. بعد إعادة حقن الغلاف الجوي وقبل استئناف التحضين، كرر عملية أخذ عينات من الغلاف الجوي من الغرفة الزجاجية عند 60 و90 و120 دقيقة.

قم بتحليل عينات ثاني أكسيد الكربون الجوي هذه للكشف عن إثراء الكربون المسمى باستخدام مطياف كتلة لنسب الغاز كما هو موضح في نص البروتوكول؛ حيث تم دمج النظائر المستقرة بشكل جيد بعد مرور ساعتين في الديدان البالغة الصغيرة، كما يتضح هنا من خلال قياس الكربون المسمى في ثاني أكسيد الكربون الجوي وثاني أكسيد الكربون المذاب في الديدان التي تمت تغذيتها إما بـ OP 50 e coli حية أو مقتولة بالأشعة فوق البنفسجية. كانت نسبة ثاني أكسيد الكربون-13 إلى ثاني أكسيد الكربون-12 أكبر في جزء ثاني أكسيد الكربون المذاب في الديدان مقارنة بثاني أكسيد الكربون الجوي المنبعث. ولوحظ أن التعرض المطول لنظير مستقر منذ المرحلة اليرقية ثم تنقية الديدان لاحقاً على وسط NGM Aate الخالي من البكتيريا قد أدى إلى زيادة الإثراء النظيري للجلوتامات الحر في الديدان البالغة الصغيرة.

في هذا الرسم البياني، تمثل L1 الديدان التي تغذت على جلوكوز الكربون 13 المسمى عالمياً وبكتيريا OP 50 من المرحلة اليرقية L1 وحتى مرحلة البالغ الشاب 959 خلية، بينما تمثل YA الديدان التي تغذت على جلوكوز الكربون 13 وبكتيريا OP 50 لمدة 48 ساعة بدءاً من وصولها إلى اليوم الأول من مرحلة وضع البيض في سن البلوغ الشاب. يشير المحور السيني (x) إلى العدد الإجمالي لذرات الكربون المسمى في كل نوع من أنواع الجلوتامات، ويشير المحور الصادي (Y) إلى نسبة الإثراء المئوية. وقد تم تنظيف جميع الحيوانات من الوسم النظائري الزائد قبل تحضير العينات اللاحقة.

بالنسبة لتحليلات GCMS، تشير الأشرطة الخضراء إلى الديدان التي تم تنظيفها بعد التعرض للنظائر عن طريق التغذية على بكتيريا OP 50 E coli على أطباق NGM لمدة ساعتين قبل استخلاص PCA. وتشير الأشرطة الزرقاء والرمادية إلى الديدان التي تم تنظيفها بعد التعرض للنظائر على أطباق NGM بدون بكتيريا لمدة ساعتين أو ست ساعات على التوالي قبل استخلاص PCA بغض النظر عن المدى الزمني للتعرض للنظائر. لم يُلاحظ أي فرق معنوي في الإثراء النظائري في المستقلبات الوسيطة عندما تم تنظيف الحيوانات على الأطباق لمدة ساعتين أو ست ساعات.

في كلتا دورتي التعرض للنظائر، لوحظ إثراء نظائري أقل في المستقلبات الوسيطة عندما تم تطهير الحيوانات عن طريق تغذيتها على بكتيريا غير معلمة لمدة ساعتين. وبناءً على ذلك، تم تحديد بروتوكول التطهير الأمثل للديدان التي نمت على أطباق NGM مفرودة البكتيريا مع النظير، وهو التطهير لمدة ساعتين على أطباق NGM غير مفرودة لتحسين نسبة الإثراء في المستقلبات الوسيطة. وذلك بعد المعالجة لمدة 24 ساعة في مزرعة سائلة باستخدام glucose 13 الكربون السداسي بدون بكتيريا.

أُجريت مقارنة بين عينات من الديدان التي تم تكسيرها باستخدام الموجات فوق الصوتية وحدها، أو الموجات فوق الصوتية بالإضافة إلى الطحن، كما هو موضح في هذا الشكل. أظهرت الديدان التي تم تكسيرها باستخدام الموجات فوق الصوتية والطحن إثراءً نظائرياً أكبر من العينات التي تم تكسيرها بالموجات فوق الصوتية فقط؛ وفي النهاية، فإن تغذية الديدان الحية ببادئ نظائري مستقر، إما أثناء النمو من مرحلة L one على الأطباق أو بدءاً من اليوم الأول لوضع البيض كبالغين شباب لمدة 24 ساعة في مزرعة سائلة، تتيح إجراء تحليل دقيق للإثراء النظائري بين المستقلبات الدالة على التدفق عبر تحلل السكر، وأيض البيروفات في دورة حمض التريكربوكسيليك بعد تطورها.

مهدت هذه التقنية الطريق للأبحاث المتعلقة بأمراض الميتوكوندريا لاستكشاف التدفق الأيضي الوسيط في ديدان sea elegance. بعد مشاهدة هذا الفيديو، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء التوصيف النظيري المستقر للأيض الوسيط والتدفق الأيضي في الديدان الخيطية من نوع The elegance.