النظائر مستقرة من التنميط التمويه الاستقلابية المتوسطة في مرحلة تطوير والكبار انواع معينة ايليجانس

الهدف العام من التجربة التالية هو مراقبة التغيرات الأيضية في الوقت الفعلي بشكل غير جراحي على مستوى بأكمله ضمن تحلل السكر ، واستقلاب البيروفات ، ودورة حمض ثلاثي الكربوكسيل التي تسببها مسار التمثيل الغذائي الفردي ، والتغيرات الجينية ، و / أو العلاجات الدوائية. يتم تحقيق ذلك عن طريق تغذية النظائر المستقرة للديدان الخيطية الحية لتوفير إثراء نظائر كافية في المزيد من المستقلبات للسماح بتحديد كمية التغيرات الجينية و / أو الدوائية في مسارات التمثيل الغذائي الوسيطة. كخطوة ثانية ، يتم قياس الاندماج النظيري في الغلاف الجوي وثاني أكسيد الكربون المذاب بواسطة قياس الطيف الكتلي لنسبة الغاز ، مما يوفر تقييما مباشرا أكثر للتدفق الأيضي الوسيط على مدى فترات زمنية قصيرة.

تتم معالجة العينات التالية لتحليل الأحماض الأمينية الكاملة الخالية من الديدان باستخدام HPLC وكذلك عن طريق التخصيب النظاري في الأحماض الأمينية والأحماض العضوية بواسطة GCMS من أجل تحديد تغيير التدفق الأيضي في الديدان الخيطية. بعد التعرض المستقر للنظائر ، يتم الحصول على نتائج تظهر تأثيرات الفترات المتغيرة للتعرض للنظائر ، والتطهير البكتيري ، واضطراب الديدان البديلة في الديدان البرية لاستجواب وفرة النظائر في المستقلبات الوسيطة. يمكن أن توفر الحرب بالطريقة نظرة ثاقبة للإبحار ضد التمثيل الغذائي الوسيط.

يمكن أيضا تطبيقه على أنظمتنا مثل خطوط خلايا الثدييات وأنسجتها. خطرت لنا فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما لاحظنا تشوهات متسقة في تحليل الأحماض الأمينية للديدان الحرة بواسطة HPLC والتي كانت توحي بضعف التدفق الأيضي الوسيط في وظيفة تغيرات الجهاز التنفسي الأولية. لبدء هذا الإجراء.

جمع الديدان التي تعرضت لنظير مستقر يسمى سلائف استقلابية إما أثناء التطور أو في مرحلة البلوغ ، في أنبوب طرد مركزي بلاستيكي سعة 1.5 مل. عادة ما نخفف الديدان إلى تركيز 1000 دودة لكل مليلتر واحد. أضف 60٪ لكل حمض الكلوريك الذي يحتوي على حمض الإبسيلون أمينوكابرويك كمعيار داخلي للديدان إلى تركيز نهائي قدره 4٪ لكل حمض الكلوريك و 20 نانومولار من المعيار الداخلي.

دع الدودة تستقر عن طريق الجاذبية لمدة خمس دقائق ، ثم قم بإزالة المادة الطافية وحفظها في أنبوب آخر. الخطوة التالية هي واحدة من أهم جوانب هذا الإجراء. يجب أن تتعطل الديدان تماما عن طريق الفحص قبل تحليل المستقلب المجاني باستخدام الخالط البلاستيكي والمثقاب الآلي ، قم بطحن عينات الدودة لمدة 15 ثانية.

تأكد بصريا من اضطراب الدودة عن طريق الفحص المجهري الضوئي وكرر الطحن إذا لزم الأمر. في هذه الصورة ، تظهر اللوحان A و B الديدان قبل الطحن. على عكس اللوحة C و D التي تظهر الديدان بعد الطحن ، تنقل المادة الطافية المحفوظة مسبقا إلى أنابيب الطرد المركزي البلاستيكية سعة 1.5 مل مع جهاز الطرد المركزي المتجانس الدود.

العينات في 2 ، 250 دورة في الدقيقة 1300 جم لمدة خمس دقائق. بعد الطرد المركزي ، انقل المادة الطافية إلى أنبوب زجاجي جديد سعة سبعة ملليلتر. احتفظ الحبيبات لاستخدامها لاحقا في فحص تركيز البروتين.

أضف الآن أربعة هيدروكسيد بوتاسيوم طبيعي إلى SUPERNAT حتى يتراوح نطاق الأس الهيدروجيني للعينات من سبعة إلى ثمانية أجهزة طرد مركزي. العينات المعادلة في الأنابيب الزجاجية المليلتر السبعة عند 2 ، 250 دورة في الدقيقة 1300 جم لمدة خمس دقائق لإزالة الأملاح ، انقل المادة الطافية من كل عينة إلى أنبوب زجاجي جديد سعة سبعة ملليلتر. يمكن الآن تحضير العينات المعادلة لقياس كمية المستقلب عن طريق كروماتوغرافيا السائل عالية الأداء أو HPLC وكروماتوغرافيا الغاز أو قياس الطيف الكتلي أو GCMS ل HPLC.

افصل 50 ميكرولترا من كل عينة محايدة للحقن المباشر في HPLC. يتم إجراء القياس الكمي للأحماض الأمينية الحرة باستخدام الاشتقاق المسبق مع الألدهيد والكشف عن الفلورسنت. كما هو موضح سابقا ، ستخضع العينات المعادلة المتبقية للاستخراج باستخدام راتنج التبادل الأيوني ل GCMS لتحديد التخصيب النظيري في الأحماض الأمينية والأحماض العضوية كما هو موضح في القسم التالي.

لتحضير الخرزات ، أضف حمض هيدروكلوريك عادي إلى حبة G واحدة وخرزة G 50 بشكل منفصل. في أكواب لتر واحد ، قلب كل قارورة لمدة 30 دقيقة مع تحريك مغناطيسي. بعد ذلك ، اغسل الخرزات بالماء منزوع الأيونات 10 مرات حتى يصبح الرقم الهيدروجيني للغسيل مساويا لدرجة الحموضة في الماء.

بعد ذلك ، سنعرض طريقتنا في إعداد أعمدة منخفضة التكلفة حسب الطلب باستخدام الماصات الزجاجية. الأعمدة المعدة مسبقا متاحة تجاريا أيضا. لتحضير عمود ، استخدم ملقطا لإدخال سدادة قطنية فوق أضيق جزء من طرف ماصة المراعي مباشرة ، واستخدم حبات G one لاستخراج الأحماض العضوية وخرز G 50.

لاستخراج الأحماض الأمينية ، املأ كل عمود بحوالي ثلث ارتفاع العمود. إذا كانت العينة بالفعل في درجة حموضة محايدة ، فلن تتم إضافة أي شيء إلى العينة قبل تطبيقها على عمود AG الواحد. لاستخراج الأحماض العضوية لاستخراج الأحماض الأمينية ، أضف ملليلتر واحد من 0.1 حمض الهيدروكلوريك العادي إلى العينة قبل تطبيقه على عمود AG 50.

الآن قم بتطبيق العينات المعادلة المعدة مسبقا على كل عمود. اغسل كل عمود 10 مرات بالماء حتى تصبح الغسالات محايدة. بعد اكتمال الغسيل ، قم بتقطيع كل عمود إلى قوارير عينة زجاجية جديدة تحمل علامة أربعة مليلتر لاستخراج الأحماض العضوية ، أضف ثلاثة ملليلتر من ثلاثة حمض هيدروكلوريك عادي إلى عمود AG واحد.

يسمح هذا بتحليل تخصيب النظائر في العدد الإجمالي للكربون المصنف بين ثلاثة أنواع من الكربون ، وأربعة أنواع كربونية ، وخمسة أنواع من الكربون ، وستة أنواع من الكربون. لاستخراج الأحماض الأمينية ، أضف ثلاثة ملليلتر من أربعة هيدروكسيد الأمونيوم العادي إلى عمود G 50. يسمح هذا بتحليل تخصيب النظائر في العدد الإجمالي للكربون المصنف بين ثلاثة أنواع من الكربون وخمسة أنواع من الكربون.

عند الانتهاء من استخراج كل من الأحماض العضوية والأحماض الأمينية ، ضع قوارير العينة في تطبيق تفاعلي ثلاثة مبخر طوال الليل حتى تجف. ثم يتم فحص العينات وتحليلها بواسطة GCMS كما هو مفصل في نص البروتوكول. ابدأ هذا الإجراء عن طريق نقل ألف دودة بالغة إلى صفيحة زراعية تجريبية NGM مقاس 35 ملم تحتوي على الكربون 13 الجلوكوز والإشريكية القولونية المصنفة عالميا.

بعد ذلك ، ضع لوحة NGM التجريبية بدون غطاءها. في غرفة زجاجية مخصصة مزودة بقضيب توقف ثلاثي الاتجاهات مغلق جيدا للسماح بأخذ عينات واستبدال دقيقة للجو. قم بتغطية الختم حيث يجلس القرص الزجاجي الشفاف بصريا على اللوحة بشحم عالي التفريغ.

أغلق الغرفة بالقرص الزجاجي. سجل الوقت. كوقت صفر ، بعد 30 دقيقة ، استخدم حقنة 20 ملليلتر لأخذ عينات من 10 ملليلتر من الغلاف الجوي من الغرفة الزجاجية بواسطة الديك ثلاثي الاتجاهات.

أغلق قضيب التوقف إلى الغرفة بعد أخذ العينات ، انقل العينة إلى أنبوب زجاجي مفرغ بالحوض الأحمر يحتوي على مليلتر واحد من بيكربونات الصوديوم في 0.1 مولي هيدروكسيد الصوديوم. بعد ذلك ، قم بحقن 10 مل من الهواء في الغرفة الزجاجية من خلال قضيب التوقف ثلاثي الاتجاهات. باستخدام حقنة سعة 20 مليلتر ، أغلق قضيب التوقف عن الغرفة بعد إعادة حقن الجو وقبل استئناف الحضانة ، كرر أخذ عينات من الغلاف الجوي من الغرفة الزجاجية في 60 و 90 و 120 دقيقة.

تحليل عينات ثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي هذه لتخصيب الكربون المسمى باستخدام مطياف كتلة نسبة الغاز كما هو موضح في نص البروتوكول ، يتم دمج النظائر المستقرة جيدا بعد ساعتين في الديدان البالغة الصغيرة كما يتضح هنا من خلال الكربون المسمى المقاس بثاني أكسيد الكربون في الغلاف الجوي وثاني أكسيد الكربون المذاب في الديدان التي تتغذى إما على الأشياء الحية أو المشعة بالأشعة فوق البنفسجية المقتولة OP 50 e القولونية. كانت نسبة ثاني أكسيد الكربون 13 إلى ثاني أكسيد الكربون 12 أكبر في جزء ثاني أكسيد الكربون المذاب بالنسبة لثاني أكسيد الكربون المنبعث في الغلاف الجوي. لوحظ أن التعرض المطول لنظير مستقر من فترة اليرقات وبالتالي إزالة الديدان على NGM Aate بدون بكتيريا زاد من إثراء الغلوتامات الحرة في الديدان الشابة البالغة.

في هذا الرسم البياني ، يمثل L one الديدان التي تتغذى على الكربون المسمى عالميا 13 جلوكوز وبكتيريا OP 50 من مرحلة اليرقات L واحدة حتى مرحلة 959 خلية للشباب يمثل YA الديدان التي تتغذى على الكربون 13 الجلوكوز وبكتيريا OP 50 لمدة 48 ساعة بدءا من وصولها إلى اليوم الأول من وضع البيض مرحلة البالغين البالغين. يشير المحور x إلى العدد الإجمالي لذرات الكربون المسماة في كل نوع من أنواع الغلوتامات ، ويشير المحور Y إلى نسبة التخصيب. تم تطهير جميع من التسمية النظيرية الزائدة قبل تحضير العينة النهائية.

بالنسبة لتحليلات GCMS ، تشير الأشرطة الخضراء إلى الديدان التي تم إزالتها بعد التعرض للنظائر عن طريق التغذية ب OP 50 E coli على ألواح NGM لمدة ساعتين قبل استخراج PCA. تشير الأشرطة الزرقاء والرمادية إلى الديدان التي تم إزالتها بعد التعرض النظيري على ألواح NGM بدون بكتيريا لمدة ساعتين أو ست ساعات على التوالي قبل استخراج PCA بغض النظر عن المسار الزمني للتعرض للنظائر. لم يلاحظ أي فرق كبير في التخصيب النظيري في المستقلبات الوسيطة عندما تم تطهير على الأطباق لمدة ساعتين أو ست ساعات.

في كلتا دورتي التعرض للنظائر ، لوحظ إثراء أقل للنظائر في المستقلبات الوسيطة عندما تم تطهير عن طريق إطعام البكتيريا غير المسماة لمدة ساعتين. لذلك ، تم تحديد بروتوكول المقاصة الأمثل للديدان المزروعة على ألواح N GM المنتشرة البكتيرية مع النظائر ليتم تطهيره لمدة ساعتين على ألواح NGM غير المنتشرة لتحسين نسبة التخصيب في المستقلبات الوسيطة. بعد العلاج لمدة 24 ساعة في مزرعة سائلة بستة كربون 13 جلوكوز بدون بكتيريا.

تم إجراء مقارنة لعينات الدودة التي تعطلت بسبب الصوتنة وحدها أو الصوتنة بالإضافة إلى الطحن كما هو موضح في هذا الشكل. الديدان التي تعطلت عن طريق صوتنة بالإضافة إلى الطحن كان لها إثراء نظائر أكبر من العينات التي تعطلت فقط عن طريق الصوتنة وأخيرا تغذية الديدان الحية بسلائف نظيرية مستقرة إما أثناء التطوير من L مرحلة واحدة على الأطباق أو بدءا من اليوم الأول من البيضة ، ووضع الشباب البالغين لمدة 24 ساعة في الثقافة السائلة. السماح بالتحليل الحساس للتخصيب النظيري بين المستقلبات التي تدل على التدفق من خلال تحلل السكر واستقلاب البيروفات في دورة حمض الكربوكسيل بعد تطوره.

مهدت هذه التقنية الطريق لأمراض الميتوكوندريا ، والأبحاث لاستكشاف التدفق الأيضي المتوسط في أناقة البحر. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية أداء النظير المستقر ، وتوصيف التمثيل الغذائي الوسيط والتدفق الأيضي في الديدان الخيطية ، والأناقة.