بروتوكول للفحوصات رني في البعوض الكبار (A. الغامبية)

أنا ليندسي جارفر وأنا طالب دكتوراه في مختبر الدكتور جورج ديموبولوس في كلية جونز هوبكنز للصحة العامة. وسأوضح لكم كيفية القيام بإسكات الجينات بوساطة الحمض النووي الريبي باستخدام تقنية الحقن. لذا فإن الخطوة الأولى هي جمع البعوض الذي سنقوم بحقنه.

هذه مجرد مخزون غابي بشكل فظيع. إنه مزيج من الذكور والإناث. وهذا هو شفاطنا الذي يعمل بالبطارية.

يحتوي على مروحة بالداخل ، مما يؤدي إلى الشفط ، مما يسحب البعوض من خلال هذه الفوهة إلى هذا الخزان. لذلك نحن نفصل. لدينا باب وصول صغير ، والذي يتم تسجيله عادة لإبقاء البعوض في الداخل ، لكننا نفتحه وندخل الفوهة ونشغلها ونستخدمها للتجميع.

بمجرد أن يكون لدينا البعوض في الداخل ، نقوم بتوصيل الجزء العلوي من الفوهة ، ونرى البعوض هناك في الخزان. ثم نريد تخدير هذه البعوض. لذلك ندفن هذا الخزان في دلو ثلج نغطيه بالثلج وننتظر نزول البعوض.

حسنا، الخطوة التالية هي حقن البعوض واستخدامه سنستخدم هذا، وهو عبارة عن نفاثة نانوية اثنين. يتكون من جزء من العصا ، والذي سأحمله وسيحتوي هذا على الإبرة التي ستوزع السائل في البعوض.

لوحة التحكم ، التي تحتوي على أزرار التعبئة والفارغة وهي مسؤولة عن سحب السائل داخل وخارج الإبرة. ثم هذا هو القدم. سيتم وضع هذا على الأرض.

ودفع هذا بقدمي سيؤدي إلى توزيع قطرة واحدة من الحجم المناسب في البعوض. لذلك أثناء وجود البعوض على الجليد ، نقوم بإعداد محطة العمل عن طريق ضبط كتلة باردة على صفر درجة إلى درجتين مئويتين. تحتوي هذه الكتلة الباردة على ملحق مسطح ، ثم يحتوي على شريحة زجاجية مثبتة عليها.

وهذا سيمنع البعوض من التحرك بينما نحاول التلاعب به. سآخذ أيضا واحدة من هذه الإبر الشعرية الزجاجية. هذا مجرد أنبوب شعري زجاجي عادي تم تسخينه وسحبه في المنتصف لإنشاء إبرة.

وهذا ما سيحتفظ بسوائلنا. ثم هذا ما سنستخدمه لحقن البعوض وتوزيع السائل. لذا فإن الشيء التالي الذي يتعين علينا فعله هو وضع الإبرة الشعرية على عصا الحقن.

نزيل قطعة الأنف. تأكد من أن الحلقات الداخلية موجودة وفقا لتعليمات الشركة المصنعة. حرك الإبرة الزجاجية لأسفل في قطعة الأنف ، مع الحذر من الحافة حتى لا تكسرها.

بمجرد أن يصبح ذلك آمنا ، حرك إبرة العصا في الإبرة الشعرية وقم بربط قطعة الأنف بإحكام. الشيء التالي هو التأكد من أن إبرة الأنبوب الشعري هي عرض جيد للحقن. هذه نقطة مهمة حقا لأن الإبرة الرقيقة جدا لن توزع الكمية الصحيحة من السائل وستؤدي السميكة جدا لنقطة الإبرة إلى إصابة البعوض وربما تسبب الوفاة.

هذا شيء يتطلب الكثير من الممارسة ، ولكن العرض الجيد أمر بالغ الأهمية في الواقع للحقن السليم وبقاء البعوض. ما أفعله هو استخدام ملقطك ذو الرؤوس الدقيقة لكسر طرف الإبرة بحيث تظل الإبرة متوافقة ولكنها مستقرة. نحن بحاجة إلى عينة الحمض النووي الريبي المزدوجة التي تقطعت بها السبل.

تم إعداد هذه العينة باستخدام مجموعة. هناك مجموعة متنوعة من المجموعات في السوق التي يمكن أن تولد RNAs محددة مزدوجة المعايير للجين محل الاهتمام. نستخدم الحمض النووي الريبي الخاص بنا بتركيز ثلاثة ميكروغرام لكل ميكرولتر ، ولدينا مجموعة حقن النانو الخاصة بنا بحيث توزع الحقنة الواحدة 69 نانولترا.

يضع الأنبوب الإبرة في السائل ويستخدم زر التعبئة الموجود على إخراج n لسحب السائل إلى الإبرة. تتناسب كمية السائل التي ستحتاجها في الإبرة طرديا مع عدد البعوض الذي ستحقنه. حسنًا؟ ونحن الآن بحاجة إلى تحضير البعوض.

لذلك نأخذ طبقنا البلاستيكي P ونقوم بتضمينه في دلو الثلج. نتحقق من أن البعوض لا يتحرك وننشره بشكل رقيق على طبق بتري البارد. هذا يضمن أنه أثناء عملنا ، لا يتحرك البعوض ولا يطير.

ثم نضع البعوض على منزلقنا الزجاجي ، والذي يبلغ الآن صفر درجة مئوية. وتحديد موقع البعوض أمر بالغ الأهمية لكيفية حقننا. لذلك تريد أن يصطف البعوض بشكل منظم حتى تعرف أيها تم حقنه وأيها لم يتم حقنه.

وتريد أيضا أن يكون هناك مسافة كافية بين البعوض حتى تتمكن من الوصول إليه باستخدام الحاقن. لذلك نقوم بنقل البعوض الفردي من طبق peewee إلى الشريحة ، مع الحرص على التعامل معه من أرجله. هذا يتجنب سحق الجثث ويؤدي إلى بقاء أكبر.

حتى الآن نحن على استعداد للحقن. نستخدم ملقط الطرف الناعم لدعم البعوض على جانب واحد ، وأنا أعاني ، لذلك أستخدمها في يدي اليسرى. ثم نقوم بالحقن من الجانب الآخر لإدخال طرف الإبرة في جانب الصدر ، بحيث يتم وضع صدر البعوض بين أطراف الملقط ونقطة الإبرة وتدخل نقطة الإبرة.

بمجرد أن تصبح نقطة الإبرة داخل الصدر ، اضغط على دواسة القدم ، ستسمع صوتا وسيتم توزيع السائل في صدر البعوض. ثم تنتقل إلى التالي وتكرر. من حين لآخر عندما تسحب الإبرة ، سترى قطرة من السائل خرجت من موقع الدخول.

وإذا حدث هذا ، فيمكنك الانتظار حتى يتم إعادة امتصاص السائل في موقع الدخول. إذا حدث ذلك ، فلا بأس بذلك. إذا لم يتم إعادة امتصاص القطرة ، إذا بقيت القطرة على السطح الخارجي للصدر ، فيجب التخلص من تلك البعوضة وتقوم بحقن واحدة أخرى في مكانها.

من المهم أيضا التأكد من أن الإبرة تذهب فقط إلى الصدر حسب الحاجة. لا تريد أن تخترق الجانب الآخر أو تسمح بمرور الكثير من عرض الإبرة. سوف يتعرض بقاء الصدر أو البعوض للخطر.

لذلك نواصل هذا الإجراء لجميع البعوض حسب الحاجة. لذلك لتخزين البعوض المحقون ، استخدمنا كوبا مبطنا بالشمع من الورق المقوى لتر واحد مغطى بشبكة شبكية رفيعة ومثبتة بشريط مطاطي وغطاء من الورق المقوى. فتحنا باب الوصول المغطى بشريط لاصق وأضفنا بعوضنا بعناية لمساعدة البعوض على البقاء على قيد الحياة.

يجب عليك إضافة كرة قطنية مربوطة بمحلول سكروز بنسبة 10٪ يعمل كمصدر غذاء للبعوض أثناء وجوده هنا. ومنشفة ورقية مطوية رطبة. نظرا لأن البعوض الجريح يميل إلى الجفاف ، فإن هذا سيساعد في الحفاظ على الرطوبة ويساعد على بقاء البعوض المحقون.

نضع غطاء بتري لاحتواء الرطوبة حتى تظل المنشفة الورقية وكرات القطن مبللة. ثم نحتضن هذا في ظل ظروف طبيعية خاضعة للرقابة البيئية. لذا فإن الحركية الجزيئية لإسكات الجينات بوساطة الحمض النووي الريبي تختلف قليلا من جين إلى آخر.

وهكذا بالنسبة لبعض الجينات ، يمكن أن يحدث الإسكات في غضون يوم واحد وبالنسبة للجينات الأخرى ، لن يحدث الإسكات الفعال لعدة أيام. يمكن قياس الاختلافات بين كل جين باستخدام تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي في الوقت الفعلي ، وسيراقب هذا مستويات النسخ داخل البعوض وسيخبرك متى حققت إسكاتا فعالا. لذلك أوصي بتخصيص اثنين من البعوض المحقون لهذا الغرض.

سيساعدك هذا أيضا في تحديد مدى كفاءة الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل بشكل عام ، سواء كان بإمكانك تحقيق إسكات فعال ، سواء كان بإمكانك ، الحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل ، تحقيق إسكات فعال. وإذا كنت في الواقع تتدخل في مستويات النسخ ، فقد عرضت عليك للتو إجراء إسكات الجينات بوساطة الحمض النووي الريبي لبعوض غامبيا الشاذ. يتضمن هذا الإجراء الحقن الدقيق للحمض النووي الريبي المزدوج الذي تقطعت به السبل في صدر بعوض أنول غابي.

هذا الإجراء مهم لأنه أحد أسهل النفايات وأكثرها فعالية للتلاعب بالجينات الفردية في البعوض.