نموذج الفأر من في الرحم زراعة

الهدف العام من هذا الإجراء هو زرع الخلايا أو الفيروسات في أجنة الفئران. أولا ، قم بعمل شق على الجانب البطني للفأر. بعد ذلك ، قم بإخراج الرحم والأجنة من الخارج ، ثم قم بإجراء الحقن داخل الرحم.

أخيرا ، أعد الرحم برفق إلى التجويف البريتوني وأغلق اللفافة البطنية والجلد. في النهاية ، يمكن الحصول على نتائج توضح النقش الخلوي أو التعبير الجيني من خلال قياس التدفق الخلوي PCR أو الكيمياء المناعية في زرع الخلايا الجذعية للرحم والعلاج الجيني. استراتيجياتنا المبتكرة لعلاج الاضطرابات الخلقية قبل الولادة ، يمكننا الاستفادة من الجهاز المناعي للجنين غير الناضج للحث على تحمل الخلايا الخيفية أو تكوين البروتينات.

يسمح لنا نموذج الفأر لزرع الرحم بدراسة العوامل البيولوجية الفريدة للجنين ، والتي تؤدي إلى تحريض عدم تحمل النقش بنجاح. سيتم الآن عرض هذه التقنية من قبل عامر نيال ، الجراح وزميل ما بعد الدكتوراه في مختبري. يبدأ تحضير ماصات الحقن بسحب الماصات الزجاجية باستخدام مجتذب الماصة الذي تمت معايرته لفصل الماصة.

في غضون 15 ثانية، ضع الماصة في مجتذب الماصة وثبتها في مكانها باستخدام المشابك العلوية والسفلية. بعد ذلك ، اضغط على زر السحب. سوف يسخن الفتيل وتنفصل الماصة.

سيكون للماصة مستدق حيث تفصل عن قطع نهاية الماصة ، بحيث تكون المسافة من بداية المستدقة إلى نهاية الماصة من 1.04 إلى 1.05 سم. لأن طول الماصة يتناسب عكسيا مع عيار فتحة الماصة. سيؤدي صنع ماصة أطول إلى طرف أضعف يكون أكثر عرضة للكسر أثناء الحقن وقد يؤثر على بقاء جنين الفأر المحقون.

لإنشاء شطبة ناعمة ، يجب شحذ طرف الماصة على عجلة شحذ الماس. قم بتشغيل العجلة ثم اخفض الماصة برفق على عجلة الشحذ الدوارة. عندما يتم قطع الماصة في البداية ، فإنها غالبا ما تنكسر بشطبة طبيعية.

عند الطرف، أعد تقييم الماصة بشكل دوري من خلال المجهر المرفق للتأكد من أن الماصة لا تزال تلامس العجلة. لأنه عندما يصبح الشطبة ناعمة ، فإنها ستفقد الاتصال بعجلة الشحذ. بمجرد أن يصبح الشطبة ناعمة ، يجب شحذ طرف الماصة.

ارفع الماصة بحيث لم تعد تلامس عجلة الشحذ. قم بتدويرها في اتجاه عقارب الساعة بمقدار 10 إلى 50 درجة ثم ضع الماصة مرة أخرى على عجلة الشحذ الدوارة لمدة 10 ثوان تقريبا. احرص على عدم وضع الماصة على حافتها لفترة طويلة ، وإلا فقد تظهر لها سطح غير مستو.

اسحب الماصة من عجلة الشحذ وافحص الحافة. عادة ما تحتاج هذه الخطوة إلى التكرار مع العديد من التعديلات الصغيرة لإنشاء حافة حادة. بعد الانتهاء من جانب واحد ، شحذ الحافة المقابلة بنفس الطريقة التي تم توضيحها للتو.

هذا الرسم البياني الشحذ المناسب لماصات الحقن ، ومنظر سفلي لشطبة إبرة حادة بشكل صحيح ، ومنظر جانبي لماصة ذات حافة غير مستوية ، كما هو موضح هنا. أخيرا ، استخدم علامة دائمة لرسم خط محيطي. كل أربعة ملليمترات بدءا من حيث يبدأ تفتق الماصة ، تتوافق هذه الترسيم مع خمسة ميكرولترات من الحجم.

بعد تحضير الحقن والماصات والمواد القابلة للحقن ، يمكنك التحضير للحقن. أولا، قم بتنظيف ماصة الحقن مرتين باستخدام XPBS واحد، واغمر الماصة في PBS واضغط على زر التعبئة حتى يتم شفط كمية كافية من السوائل لملء الماصة. ثم تحقق كل منها من برنامج تلفزيون.

بعد ذلك ، قم بإعداد منطقة الإجراء الخاصة بك ببطانية تدفئة وإضاءة وأدوات جراحية لازمة. سيتم إجراء الحقن باستخدام حلقات تكبير جراحية 2.5 ×. في هذا العرض التوضيحي ، على الرغم من أنه يمكن أيضا استخدام مجهر تشريح ، ضع الفأر المخدر على وسادة تسخين في وضع الاستلقاء وقم بلصق كل طرف بشريط لاصق لتثبيت في مكانه.

بعد قص الفراء ، قم بإعداد البطن باستخدام 10٪ من اليود بوفيدون ، متبوعا بالكحول ، مؤكدا بقرصة إصبع القدم أن مخدر تماما. ثم قم بعمل شق بطول سنتيمتر واحد في أسفل البطن. يجب أن يكون الجانب الأكثر شأنا من الشق حوالي سنتيمتر واحد أعلى من ذلكشق الجلد واللفافة.

احرص على عدم إصابة الأمعاء والمثانة الموجودة مباشرة تحت الطبقة الرقيقة من اللفافة. باستخدام مسحات القطن ، قم بتمديد اللفافة برفق وتوصيل الرحم من خلال الشق. حدد المبيضين الأيمن والأيسر للتأكد من تصور الرحم بأكمله ، ثم احسب العدد الإجمالي للأجنة.

ضع الرحم مرة أخرى في تجويف البطن قبل المتابعة حتى يظل الأجنة دافئة أثناء التحضير للحقن. نظرا لأن المواد القابلة للحقن تكون بحجم صغير بشكل عام ، فإننا عادة ما نضعها في أنبوب صغير صغير لنكون قادرين على ملء الإبرة دون كسر طرف الماصة. نظرا لأن الحقن هي أصعب جانب في هذا الإجراء ، فإن التقنية الجيدة التي تؤدي إلى الحد الأدنى من الصدمة للرحم أمر بالغ الأهمية لنجاح هذه التقنية.

يجب إمساك الأجنة بإحكام ، ولكن برفق بما يكفي لتجنب التلف. من الضروري أيضا أن تكون حركاتك ثابتة أثناء إدخال الماصة بالحقن وسحبها. ارسم الحجم المناسب من المواد لعدد الأجنة التي تخطط لحقنها.

من المهم الاحتفاظ بأطراف الماصة الخاصة بأجهزة التحفيز المتحرك لتجنب شفط العينة في أنبوب الحاقن الدقيق. أمسك الجنين برفق وحدد جزء الجنين الذي تخطط لحقنه. في هذا العرض التوضيحي ، سنقوم بحقن كل جنين في جزء مختلف من الجسم ، أولها هو كبد الجنين.

باستخدام الإبهام والسبابة ، قم بتثبيت الجنين داخل التجويف الأمنيوسي حتى لا يدور أثناء إجراء الحقن. لحقن الكبد ، أدخل الماصة بعناية عبر الرحم والسلى وجلد الجنين ، وفي كبد الجنين. يجب أن تمر الماصة الحادة بسهولة عبر هذه الأنسجة.

حقن الحجم المطلوب في الجنين واسحب الماصة برفق. من الضروري أن تكون حركاتك ثابتة أثناء وقت إدخال الماصة وحقنها وسحبها للحقن داخل الصفاق. يتم إدخال الماصة أيضا من خلال الرحم والسلى وجلد الجنين ، ولكنها موجهة أسفل كبد الجنين قليلا.

حقن الحجم المطلوب للحقن العضلي. ضع الجنين لتحديد الورك وعظم الفخذ وحقن عضلة الألوية. بالنسبة للحقن داخل البطين، من السهل رؤية الغرز الإكليلية لتوجيه الماصة إلى الهدف المناسب لهذه الحقن.

يلزم وجود ماصات من العيار الأكبر قليلا لاختراق الجمجمة دون كسر الماصة. بالنسبة للدراسات التي تتضمن حصاد ما بعد الولادة ، يجب أن تتلقى جميع الأجنة حقنا مثالية من الناحية الفنية حيث لا توجد طريقة لتمييز الأجنة المحقونة والحقن بعد الولادة. إذا تم إجراء الحقن بشكل صحيح ، يجب ألا تتسرب المادة من التجويف الأمنيوسي أو الرحم.

بعد حقن الأجنة ، ضع الرحم بعناية مرة أخرى في تجويف البطن ، وتأكد من أنه غير ملتوي على نفسه أو حول إمداد الأوعية الدموية. قم بتوصيل مليلتر واحد من XPBS واحد في التجويف البريتوني للأم لتعويض أي سائل مفقود أثناء الإجراء. أغلق الشق في طبقتين بخيط قابل للامتصاص مضفر بخمسة أوه.

أولا ، أغلق اللفافة دون إصابة الأمعاء أو المثانة السفلية ، ثم أغلق الجلد. أخيرا ، أعد الأنثى المحقونة إلى قفصها الفردي. ضع القفص على بطانية دافئة وقم بوخز الفراش في القفص.

ضع الماوس في منطقة هادئة من منشأة الماوس حيث لا ينبغي إزعاجه إلا بعد عدة أيام من التسليم. سيؤدي تقليل أي ضغط إضافي على إلى تقليل فرص المخاض المبكر ، والنتائج التمثيلية لنقش المتبرع بعد زرع الخلايا في الرحم موضحة هنا. الجنينيه. تم زرع أجنة اليوم 14 بخلايا جذعية مكونة للدم إيجابية GFP.

ثم تم إجراء أخذ عينات الدم المحيطية في جرو خيميري للكشف عن تعبير GFP للخلايا المانحة باستخدام قياس التدفق الخلوي ، والذي أكد وجود خلايا مانحة. بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية صنع ماصات الحقن وإجراء حقن الرحم. بمجرد إتقان هذه التقنيات الأساسية.

يمكن تعديل هذه الطريقة لحقن الأجنة في مختلف أعمار الحمل لدراسة بيولوجيا النمو والخلايا الجذعية الأساسية.