مزيج من الشريط اللاصق على أساس أخذ العينات والإسفار في الموقع تهجين للكشف السريع عن السالمونيلا على المنتجات الطازجة
أكتوبر 18, 2010
هذا البروتوكول وصف بسيط لاصق الشريط النهج القائم على أخذ عينات من البندورة وغيرها من المنتجات الطازجة السطوح ، تليها السريع كشف الخلية بأكملها السالمونيلا باستخدام مضان في الموقع التهجين (FISH).
الهدف العام من هذا الإجراء هو إقران أخذ العينات القائمة على الشريط اللاصق للمنتجات الطازجة مع الكشف الجزيئي للخلية الكاملة لأنواع السالمونيلا باستخدام التألق السريع في تهجين C two ، المعروف أيضا باسم الأسماك. يتم تحقيق ذلك عن طريق تطبيق شريط لاصق أولا على المادة المرغوبة واستخراج الخلايا المرتبطة بالسطح. يمكن تحليل أشرطة شحن الخلية مباشرة أو إخضاعها لتخصيب الطور الصلب أو السائل.
الخطوة الثانية من الإجراء هي على الشريط ، والتثبيت الذاتي والجفاف في سلسلة من الإيثانول للخلايا المشار إليها أو المخصبة في المرق. تتضمن الخطوة الثانية تثبيت الخلية في التعليق ، متبوعا بتعليق Resus للخلايا في مخزن التخزين المؤقت. تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تنفيذ خطوة تهجين سريعة على الشريط باستخدام كوكتيل مسبار قليل النوكليوتيد الخاص بالسالمونيلا ، متبوعا بإزالة المسبار الزائد بشطف عازلة للغسيل للعينات التي تم تحليلها عبر الفاكس ، ويتم تنفيذ خطوة الأسماك في حالة تعليق ، ويمكن إزالة المسبار الزائد باستخدام خطوة تخفيف بسيطة قبل التحليل.
تتمثل الخطوة الأخيرة من الإجراء في مواجهة تلطيخ الخلايا المرتبطة بالشريط المهجن باستخدام DPI وفحصها باستخدام الفحص المجهري الفلوري. بالنسبة للتحليلات القائمة على الحقائق ، ليست هناك حاجة إلى وصمة عار مضادة. في النهاية ، توفر هذه الطريقة وسيلة للكشف البصري أو القياسي الخلوي لأنواع السالمونيلا التي قد تكون موجودة في المنتجات الطازجة التي تم أخذ عينات منها.
خطرت لي فكرة هذه الطريقة لأول مرة عندما قرأت عن مجموعة إيطالية كانت تستخدم نهجا مشابها لفحص المجتمعات البكتيرية على الآثار الحجرية الرومانية. لكن أنا و r قادنا مناقشة لهذا العمل في فصل كنت أقوم بتدريسه حول الأساليب السريعة في علم الأحياء الدقيقة للأغذية. بعد بضعة أسابيع ، بدأ تفشي السالمونيلا الذي تم إرجاعه إلى المنتجات الطازجة في إصابة ما يقرب من 1500 شخص في 43 ولاية مختلفة.
في حين أن نهجنا التجريبي يوفر وسيلة عملية وفي الوقت المناسب للكشف عن أنواع البكتيريا المحددة على المنتجات الطازجة ، إلا أنه محمول أيضا بما يكفي لتمكين الاختبار في الحقل أو في بيئة إنتاج الغذاء. ابدأ باختيار شريط لاستخدامه في أخذ العينات. تتضمن بعض الخيارات شريط الفطريات المتاح تجاريا أو الملامس وهو معقم ومعبأ أيضا لسهولة الاستخدام.
باستخدام علامة دائمة ، ارسم مربعات سنتيمترا واحدا على الجانب غير المريض من قطعة من الشريط اللاصق بطول 10 سم باستخدام قالب من الألومنيوم المعقم. سيكون هذا بمثابة دليل مرئي لملاحظة أي جزء من الشريط تم استخدامه لأخذ عينات من السطح البيئي أو الطعام الذي يشكل حلقة من الشريط على شكل CS مع الجانب اللاصق المواجه للسطح المراد أخذ عينات منه. للقيام بذلك ، أمسك الأطراف اللاصقة بالإبهام والإصبع الأوسط وضع السبابة مقابل المربع المرسوم على الجزء الخلفي من الشريط.
ضع الشريط على السطح المراد أخذ عينات منه واضغط برفق على المنطقة المحددة على السطح دون تحرير حواف الشريط. استخدم السبابة للتأكد من أن الجانب اللاصق من الشريط ملامس تماما لسطح العينة. تجنب الفقاعات باستخدام حركة متساوية.
اسحب الشريط ببطء بعيدا عن العينة. يؤدي استخراج الميكروبات المرتبطة بالسطح جسديا إلى ربط شحنة الخلية. شريط لاصق الجانب لأعلى على شريحة مجهر زجاجي باستخدام شريط مكتبي شفاف عام ، تأكد من التوتر المناسب وتمدد الشريط بحيث يتم إنشاء سطح مسطح غير مجعد.
سيساعد ذلك في تقليل مشاكل تشوه أو تجعيد الشريط. أثناء التسخين اللاحق. أثناء التهجين ، ضع الشريط ووجهه لأسفل على تقطيع الزيلوز الثلاثة أربعة أو XLT أربعة ألواح زراعية بحيث تكون الخلايا التي تم أخذ عينات منها على اتصال مباشر بالسطح الزراعي لتسهيل الإزالة السهلة للشريط من السطح الزراعي.
بعد التخصيب ، يتم وضع جزء تلامس العينة النموذجي من الشريط متدفقا مع السطح الزراعي ، ويتم لصق أحد طرفي الشريط بشكل فضفاض. يتم قلب الجدار الجانبي لألواح أطباق بتري لتجنب التكثيف وتحضينها عند 35 درجة مئوية. للسماح بالنمو الكافي لأنواع السالمونيلا ، فإن طول فترة الحضانة اللازمة لإثراء الخلايا إلى مستوى يمكن اكتشافه سيعتمد على مستويات التلوث الأولية بالسالمونيلا.
بعد فترة التخصيب المرغوبة ، افتح لوحة الأجار ، وسيحتفظ الشريط بضربته أثناء الحضانة. اضغط برفق على الشريط على الأجار باستخدام السبابة لضمان أقصى قدر من الانتعاش للمستعمرات الدقيقة المتكونة في واجهة شريط أجار ، أمسك الشريط من الحافة المرفقة بجدار طبق بتري وقم بإزالته بحركة بطيئة متساوية. باستخدام شريط مكتبي شفاف عام ، قم بتركيب شريط شحن الخلية اللاصق لأعلى على شريحة مجهر بحيث يتم إنشاء سطح مسطح غير مجعد.
قم بتثبيت خلية الشريط لمدة 30 دقيقة عند 25 درجة مئوية عن طريق تغطية منطقة ملامسة العينة ب 500 ميكرولتر من الفورمين المخزن المحايد بنسبة 10٪. تخلص من المثبت في وعاء قابل للغلق تحت غطاء كيميائي لتقليل التعرض للبخار المهيج أو السام ، اغسل الشريط مرة واحدة في واحد x محلول ملحي مخزن بالفوسفات أو PBS عن طريق إغراق سطح الشريط برفق ب PBS لتجفيف العينة. باستخدام سلسلة الإيثانول التقدمية ، قم بإعداد التهجين المسبق للتهجين وغسل المخازن المؤقتة باستخدام مرشح حلول درجة البيولوجيا الجزيئية التجارية باستخدام حقنة نقطية 22 ميكرومتر وتسخين مخازن التهجين والغسيل إلى 55 درجة مئوية.
أضف مجسات قليل النوكليوتيدات المسماة بالفلورسنت إلى مخزن التهجين المسخن مسبقا للحصول على تركيز مسبار نهائي يبلغ خمسة نانوجرام لكل ميكرولتر ، وتراكب منطقة تلامس العينة النموذجية للشريط ب 300 ميكرولتر من المخزن المؤقت للتهجين الذي يحتوي على كوكتيل المسبار والخلايا المرتبطة بالشريط المهجن في غرفة حضانة رطبة محكمة الغلق مضبوطة على 55 درجة مئوية لحاضنة اتصال مباشر ، مثل أداة وضع الشريحة المهجنة لمدة 15 دقيقة. بعد التهجين ، تتم إزالة الشرائح ويتم التخلص من المسبار الذي يحتوي على تراكب المخزن المؤقت للتهجين. اشطفها لفترة وجيزة وبرفق باستخدام محلول غسيل مسخن مسبقا عن طريق سحب العينات.
يسمح حجم صغير من المخزن المؤقت فوق شريحة مائلة للشرائح بالجفاف في الهواء للكشف عن أنواع السالمونيلا عبر الفحص المجهري الفلوري. قم بتراكب الشريحة بحوالي 10 ميكرولتر من درع المتجه H 1200 ، ووسط التركيب الذي يحتوي على نقطة في البوصة ، وتحتضن البقعة المضادة النووية في الظلام لمدة 10 دقائق. ضع زيت الغاطس على الغطاء ، وانزلق العينات وافحص العينات باستخدام هدف زيت التكبير العالي.
يتم استخدام مرشح DPI لتركيز العينة. ثم يتم تحويل المجهر إلى المرشح المناسب ، ويتم تسجيل خلايا السالمونيلا بصريا وفقا لتألقها الأخضر أو الأحمر ، اعتمادا على الصبغة المستخدمة لتسمية المجسات. نقل الكشف عن السيتريك الأمامي PBS العينات المعلقة إلى خمسة مليلتر من أنابيب أخذ العينات القاعية المستديرة وفحصها باستخدام مقياس التدفق الخلوي مع الإثارة عند 647 نانومتر.
تحليل البيانات باستخدام برنامج FlowJo. يسهل أخذ عينات الشريط اللاصق من terica serovar ، Ty Murium من سطح طماطم ملوثة صناعيا ، التحليل المباشر للأسماك عبر الفحص المجهري أو شحنة خلية قياس التدفق الخلوي. تمت معالجة الأشرطة للتألق السريع في تهجين C two باستخدام مزيج من مجسات الحمض النووي الخاصة بالسالمونيلا وتصنيفها ب Texas Red ، اعتمادا على التركيز المحلي الأولي لخلايا السالمونيلا على الشريط.
أسفر تخصيب المرحلة الصلبة عن نتائج تتراوح من المستعمرات الدقيقة المعزولة إلى النمو المتقارب. يمكن تحليل الخلايا التي تم أخذ عينات منها على الشريط عن طريق قياس التدفق الخلوي المشترك ، إما مباشرة بعد أخذ العينات أو بعد سطح سائل لمدة خمس ساعات. إثراء مزرعة مصغرة عند 35 درجة مئوية.
على الرغم من أننا وصفنا استخدام تقنية السمك الشريطي لسلامة الأغذية ، إلا أن هذه الطريقة لديها أيضا إمكانات جيدة للاستخدام في تخصصات أخرى ، بما في ذلك علم الأحياء الدقيقة البيئي أو علم أمراض النبات أو علم الأحياء الدقيقة السريري. بالتوازي مع هذا الإجراء ، يمكن إجراء تجارب إضافية مثل الاختبارات الكيميائية الحيوية أو تفاعل البوليميراز المتسلسل على تخصيب الطور الصلب أو السائل من العينات المستخرجة من الشريط. يمكن استخدام الاختبارات للإجابة على أسئلة حول السالمونيلا التي قد تكون موجودة ، وهي أسئلة خارج نطاق إجراء الأسماك.
اعرض النص الكامل واحصل على الوصول إلى آلاف الفيديوهات العلمية
نظرة عامة
يصف هذا البروتوكول طريقة لأخذ عينات من أسطح المنتجات الطازجة، مثل الطماطم، باستخدام شريط لاصق. إنه يتيح الكشف السريع عن السالمونيلا من خلال التهجين الموضعي الفلوري (FISH).
مكونات الدراسة الرئيسية
مجال العلم
- علم الأحياء الدقيقة
- سلامة الأغذية
- علم الأحياء الجزيئي
الخلفية
- السالمونيلا هي مُمْرِض غذائي مهم.
- الطرق التقليدية للكشف عن السالمونيلا قد تكون متعبة.
- التهجين الموضعي الفلوري (FISH) يسمح بالكشف السريع.
- أخذ العينات باستخدام شريط لاصق هو نهج جديد لأخذ عينات الأسطح.
هدف الدراسة
- تطوير طريقة بسيطة لأخذ عينات من أسطح المنتجات الطازجة.
- لتمكين الكشف الجزيئي السريع عن السالمونيلا.
- لتحسين بروتوكولات سلامة الأغذية في مناولة المنتجات.
الطرق المستخدمة
- تطبيق الشريط اللاصق لجمع الخلايا المرتبطة بالسطح.
- تثبيت الخلايا وجفافها في سلسلة الإيثانول.
- التهجين باستخدام كوكتيل مسبار أوليgonucletide خاص بـ السالمونيلا.
- غسل وتحليل العينات عبر مجهر الفلورة.
النتائج الرئيسية
- الاستخراج الناجح للسالمونيلا من أسطح المنتجات الطازجة.
- الكشف السريع الذي تم تحقيقه من خلال منهجية FISH.
- فعالية أخذ العينات باستخدام الشريط اللاصق المثبتة.
- إمكانية تعزيز تدابير سلامة الأغذية.
الاستنتاجات
- طريقة الشريط اللاصق هي خيار قابل للتطبيق لأخذ العينات.
- يوفر FISH تقنية كشف سريعة للمُمْرِضات.
- يمكن دمج هذا النهج في ممارسات سلامة الأغذية.
الأسئلة المتداولة
Executive Industry Relevance
Rapid, culture-independent detection of foodborne pathogens like Salmonella on fresh produce surfaces supports early risk assessment in the food safety testing workflow. The adhesive tape-FISH method enables direct sampling and molecular identification without enrichment delays, providing timely data for go/no-go decisions in produce supply chains. This approach enhances predictive confidence in contamination screening and reduces reliance on slower culture-based methods.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of surface-associated microbial presence for hypothesis testing in food safety models.
- Operational Value: Provides a simple, portable sampling technique compatible with field and production environment use.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates quantitative fluorescence readouts via microscopy or flow cytometry for Salmonella detection.
- Operational Value: Supports assay standardization through fixed tape mounting, probe hybridization, and washing steps.
- Strategic Value: Facilitates scalable screening of multiple produce types using the same tape-FISH workflow.
Translational & Preclinical Research
- Scientific Value: Enables disease-relevant system modeling by detecting Salmonella on fresh produce surfaces under controlled conditions.
- Operational Value: Allows seamless transition from sampling to enrichment (solid or liquid phase) and downstream analysis.
- Strategic Value: Supports risk-adjusted advancement decisions by providing early, actionable contamination data.
Pipeline & Workflow Integration
The tape-FISH method fits within the early discovery continuum, supporting initial hazard detection before proceeding to more detailed characterization or enrichment-based workflows.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing regarding surface microbial load and distribution on fresh produce matrices.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative outputs via FISH signal detection, enabling comparison across sampling conditions.
- Analytics: Provides fluorescence-based readouts compatible with microscopy and flow cytometry for single-cell analysis.
- Translational Research: Connects surface sampling to enrichment strategies that model pathogen growth in food-relevant environments.
- Enterprise Reuse: Represents a reusable sampling module applicable across multiple produce types and testing sites.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in pathogen detection through direct, culture-independent molecular identification.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization via fixed sampling areas, controlled fixation, and standardized hybridization.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by reducing time-to-result and enabling rapid screening of high-volume produce lots.
- Portfolio Impact: Informs risk-based prioritization of lots for further testing or release based on rapid Salmonella detection outcomes.
Implementation Considerations
- Requires expertise in fluorescence microscopy or flow cytometry for signal detection and analysis.
- Needs access to hybridization incubators, wash stations, and reagent preparation for probe handling.
- Demands standardized tape application and fixation protocols to ensure consistent cell extraction and retention.
- Involves adaptation considerations for different produce surface textures and topographies.
- Includes practical limitations related to probe specificity and background fluorescence from complex food matrices.
