الفسيولوجية تسجيلات NMJs المخرجات العالية والمنخفضة على العضلة الباسطة جراد البحر الساق

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية كشف وتمييز النهايات الحركية المرحلية والتوترية باستخدام الصبغ المورفولوجي والتسجيل الفيزيولوجي الكهربائي في العضلة الباسطة لسرطان البحر. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق فصل الرجل الماشية الأولى أو الثانية من سرطان بحر متوسط الحجم، ثم قص القشيرة وإزالة العضلة القابضة في الجزء المفصلي، مما يؤدي إلى كشف العضلة الباسطة وحزمة الأعصاب.

تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في صبغ التحضير باستخدام ethyl amino sterile الرباعي وmethyl peritoneum iodide، أو 4D2asp لتصوير المحاور العصبية والنهايات العصبية. والخطوة الثالثة من الإجراء هي تحفيز الخلايا العصبية التوترية (tonic) و/أو الطورية (phasic) بشكل انتقائي، مع إجراء تسجيلات داخل خلوية متزامنة لجهد ما بعد التشابك الاستثاري (EPSPs) في الليف العضلي. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي استخدام قطب كهربائي بؤري لتسجيل أحداث qu التلقائية والمستثارة من النهايات العصبية.

في نهاية المطاف، يمكن الحصول على نتائج تفصل بين النهايات العصبية التوترية (tonic) والطورية (phasic)، مورفولوجياً ووظيفياً من خلال مجهر الفلورة المناعية والفيزيولوجيا الكهربائية. ويمكن لهذه الطريقة أن تساعد في الإجابة على الأسئلة الجوهرية في مجال الفيزيولوجيا التشابكية في مجالات مثل التعب العضلي، والاكتئاب التشابكي، والتداخل التشابكي. تبدأ التجربة بالتقاط جراد البحر بعناية لتجنب مخالبه.

افصل الساق عن الجسم عند قطعة الـ isia pod. تؤدي القرصة القوية عند قطعة الـ isia pod إلى تحفيز جراد البحر على القيام بعملية البتر الذاتي أو كسر ساق المشي الأولى بشكل طبيعي. سيتوقف جراد البحر عن النزيف ثم يُعاد وضعه في حوض الاحتجاز الخاص به.

لا يتم التضحية بجراد البحر. ضع الساق على قطعة من ورق المناديل بحيث يمكن تدوير التحضير بسهولة أثناء إجراء القطوع. أدر الساق حتى يصبح الجانب الخارجي، وهو الجانب الوحشي، مواجهاً للأعلى على لوحة التشريح.

يكون الجانب المقوس عادةً موجهاً للأعلى. وباستخدام شفرة حلاقة حادة مثبتة في أداة كسر شفرات المشرط، قم بكشط الجلد في قطاع الـ meite باتباع النمط الموضح في الشكل. يجب توخي الحذر حتى لا يتم القطع بعيداً جداً في الاتجاه القاصي عند إجراء القطع من الناحية الظهرية إلى الناحية البطنية على طول مفصل الـ meite carpod.

ينتج عن هذا القطع نافذة في الـ meite فوق عضلات الساق الكامنة. اترك القشيرة في مكانها حالياً. ضع التحضير في طبق تشريح يحتوي على محلول ملحي فسيولوجي لسرطان البحر.

في هذه المرحلة، ضع دبوساً في منتصف قطعة الـ carpod وفي الجانب الظهري من قطعة الـ ischia pod، وباستخدام ملقط دقيق، ارفع النافذة المقطوعة في القشيرة قليلاً من الطرف القاصي، وباستخدام الشفرة، اقطع ألياف العضلة الثانية عن القشيرة. استمر في القطع من الاتجاه القاصي إلى الاتجاه الداني، وفي النهاية ارفع نافذة القشيرة بعيداً. ولكشف العضلة الباسطة، يجب إزالة العضلة القابضة التي تعلوها.

افصل وتر العضلة القابضة عن طريق إزاحته عن العضلة القابضة باستخدام دبوس. ثم اقطع الوتر عند مفصل Mari poddy carpod. وكما هو موضح، كن حذراً جداً في سحب الوتر بعيداً عن تجويف الساق قبل إجراء القطع، واحرص على قطع الوتر فقط وليس العصب الرئيسي للساق الموجود على الجانب الداخلي من الوتر.

امسك الوتر من مكان قطعه باستخدام الملاقط، ثم اسحب العضلة القابضة بعيداً عن الساق عن طريق رفعها في اتجاه مائل. وللكشف عن العصب المتجه إلى العضلة الباسطة، اقطع العصب الرئيسي للساق عند المفصل الرسغي الساعدي (merepod carpod joint)، ثم اسحب العصب الرئيسي للساق للخلف بعناية فوق العضلة الباسطة. ويمكن تعزيز فصل العصب المتجه إلى العضلة الباسطة عن العصب الرئيسي للساق عن طريق سحب الطرف القاصي للعصب الرئيسي للساق برفق إلى جانب العينة. وعند سحب العصب الرئيسي للساق للخلف فوق العضلة الباسطة، قد يتطلب الأمر قطع تفرعات صغيرة من المحوار المثبط.

يمكن تصور الحزمة العصبية باستخدام صبغ ميثيلين الأزرق. ومع ذلك، لن يتم استخدام ميثيلين الأزرق للتسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية في هذه الصورة العلوية. تشير الأسهم الحمراء إلى المسار العصبي المطلوب.

حزمة الأعصاب المستهدفة هي الحزمة الأكبر التي تتفرع من عصب الساق الرئيسي بالقرب من الطرف الداني لموقع الميريبود (merepod). لاحظ تفرع المحوار والمحوارين المرئيين بوضوح داخل العصب. الآن بعد تعريض العصب والعضلة، قم بتجهيز الجهاز المستخدم في التجربة.

يتم إجراء التسجيلات داخل الخلايا وخارجها باستخدام مرحلة رأس ومضخم قياسيين. نستخدم مضخمًا من طراز axon clamp two B ومرحلة رأس one XLU. يلزم وجود ثلاثة أقطاب كهربائية، واحد للتسجيل داخل الخلوي واثنان للتسجيل خارج الخلوي.

سيتم استخدام القطبين الكهربائيين خارج الخلية لتحفيز العصب وتسجيل أحداث القنوات التشابكية المستثارة والتلقائية. قم بصقل الأقطاب البؤرية باللهب وثنِها قليلاً فوق عنصر تسخين. بعد ملء القطب البؤري بالمحلول الملحي، ضعه في حامل القطب المحفز وأدخل سلك المحفز بحيث يلامس المحلول الملحي.

يتم توصيل هذا بجهاز عزل للتحفيز من نوع grass P 15، والذي يتصل بدوره بمحفز grass S 88. أثناء التسجيلات الفيزيولوجية الكهربائية، تُستخدم صبغة D two ASP الحيوية لتصوير المحاور العصبية وصبغها؛ حيث يتم استبدال محلول الملحي في الحمام بمحلول ملحي يحتوي على 5 µM من صبغة four D two as per لمدة خمس دقائق. بعد مرور خمس دقائق، يُعاد ملء الطبق بالمحلول الملحي الفيزيولوجي الخاص بسرطان البحر (crayfish)، ثم يوضع التحضير تحت المجهر مع استخدام عدسة Forex الشيئية.

وعند استخدام عدسة عينية بقوة 10x، حرك قطب التحفيز إلى المنطقة المستهدفة. الخطوة التالية هي وضع تجويف قطب التحفيز ذو الرقعة الكبيرة (macro patch) على المحوار الطوري (phasic) أو المحوار التوتري (tonic). وتُظهر هذه الصورة لتحضير مصبوغ بصبغتين من أربعة أصباغ أن المحوار التوتري يبدو أكثر سطوعاً بسبب زيادة محتوى الميتوكوندريا.

تظهر النهايات التوترية (tonic terminals) العديد من التورمات (varicosities)، بينما تكون النهايات الطورية (phasic terminals) ذات طبيعة أدق تحت المجهر الفلوري. وباستخدام الشيئية 20x، يتم وضع القطب الكهربائي على المحور العصبي التوتري أو المحور العصبي الطوري. في هذه الحالة، يتم وضع القطب الكهربائي على المحور العصبي التوتري.

ضع القطب الكهربائي داخل الخلوي في الميكرومناور الخاص به، ثم أدخل القطب الكهربائي داخل الخلوي في خلية عضلية باسطة. سيُستخدم هذا لتسجيل الجهود postsynaptic الاستثارية داخل الخلوية أو EPSPs. لتسجيل qual EPSPs.

ضع القطب البؤري الثاني في المِتلاعب الدقيق (micro manipulator). يتم ذلك عن طريق إزالة القطب داخل الخلوي وحامله السابق واستبدالهما بحامل قطب نظيف. استخدم المِتلاعب الدقيق لوضع تجويف القطب البؤري الثاني مباشرة فوق تورم مشبكي (synaptic varicosity).

يتم تحديد مقاومة القطب والسداد عن طريق تمرير نبضات تيار اختبار عبر القطب. في تجاربنا، تراوحت مقاومة السداد من 0.3 إلى 1 ميجا أوم، بينما تراوحت مقاومة القطب من 0.5 إلى 1 ميجا أوم. ويمكن مراقبة مقاومة السداد طوال فترة التسجيل.

عند الاستعداد لبدء التحفيز، قم بتشغيل برنامج scope 5.0 وابدأ بتحفيز المحوار المعزول. في الحزمة العصبية، يتم تحفيز المحوار التوترِي بواسطة قطب الشفط، ويتم تسجيل جهود ما بعد التشابك الاستثارية (EPSPs) للألياف العضلية باستخدام قطب كهربائي داخل خلوي أو خارج خلوي. يتم تسجيل الـ EPSPs على جهاز كمبيوتر عبر واجهة power lab forest.

بعد تحفيز المحور العصبي التوترى (tonic axon)، يمكن نقل قطب التحفيز إلى المحور العصبي الطوري (phasic axon) وتكرار التجربة بعد تحفيز العصب. ويقوم القطب داخل الخلوي بتسجيل جهود ما بعد التشابك الاستثارية (EPSPs) المتولدة استجابةً لنشاط العصبون الحركي التوتري والطوري معاً. ويعتمد التسهيل التشابكي للوصلات العصبية العضلية التوترية على تردد تحفيز العصب، كما هو موضح هنا لسلسلة متتالية من التحفيزات، يبلغ عدد كل منها حوالي 20 تحفيزاً بتردد 60 hertz.

لاحظ التسهيل الذي يحدث مع وجود محفزات متعددة. يقارن هذا الشكل سعات جهد ما بعد التشابك الاستثاري (EPSPs) الناتجة عن تحفيز العصب التوتري بترددات 20 هرتز باللون الأزرق، و40 هرتز باللون الأخضر، و60 هرتز باللون الأحمر؛ لاحظ التسهيل الملحوظ الموضح عند ترددات التحفيز الأعلى. تتسم النهايات التوترية بكفاءة تشابكية منخفضة، ولكنها تظهر استجابات تسهيلية دراماتيكية كما هو موضح.

تظهر هنا جهود ما بعد التشابك الاستثارية (EPSPs) التوترية بمفردها، ثم تظهر الاستجابات الطورية متراكبة عليها وبنفس المقياس. وبخلاف النهايات التوترية، تتميز النهايات الطورية بكفاءة كمية عالية، ولكنها تظهر تثبيطاً تشابكياً عند التحفيز بترددات عالية. ويرتبط التثبيط التشابكي في النهايات الطورية أيضاً بتردد التحفيز كما هو موضح هنا.

يؤدي التحفيز المستمر بتردد 5 هرتز لمدة 30 دقيقة إلى تثبيط الاستجابة في الوصلة العصبية العضلية. ومع زيادة تردد التحفيز، ستثبط العينة بشكل أسرع عند التعرض للتحفيز المناسب. وتنتج الوصلة العصبية العضلية في جراد البحر جهوداً استثارة بعد مشبكية (EPSPs) غير نبضية.

يمكن استخدام هذه الجهود ما بعد التشابكية الاستثارية (EPSPs) لاستقصاء الخصائص النوعية التي تشكل الإشارات الكهربائية المتدرجة في هذه العضلات. تظهر هنا الاستجابات التشابكية النوعية للنهاية التوترية. لاحظ أن ليس كل تجارب التحفيز تؤدي إلى حدث نوعي.

يمكن إجراء العد المباشر للأحداث الكمية (qual events) عند استخدام تحفيز منخفض التردد لكل استجابة مستثارة. كما يمكن تحديد عدد الأحداث الكمية بسهولة بالنسبة للنهايات التوترية (tonic terminals). ومن خلال عد الأحداث الكمية، يمكن تسجيل الاستجابات التشابكية من العصبون الحركي المرحلي (phasic motor neuron) بنفس الطريقة.

ومع ذلك، فإن الاستجابات المستحثة تكون متعددة الكمونات (multi qual) بطبيعتها. ويتم تقدير متوسط محتوى الكمونات (mean qual content) باستخدام متوسط سعة أو مساحة الانحرافات جنبًا إلى جنب مع متوسط سعة الذروة أو مساحة الأحداث التلقائية. وتذكير أخير، يجب توخي الحذر عند إزالة العضلة القابضة لتجنب إتلاف العصب أثناء انتظار العضلة الباسطة.

هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة، ومع تمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.