النمذجة الأغشية البيولوجية مع لوحات الدوائر الكهربائية وقياس الاشارات في محاور عصبية : تمارين مختبر طالبة

الهدف العام من هذا الإجراء هو توضيح كيفية فهم الأغشية البيولوجية باستخدام النماذج الكهربائية، وبيان إجراءات تسجيل جهود الفعل من الحبل العصبي البطني لجراد البحر. يستخدم هذا العرض التوضيحي أولاً مكونات دائرة على لوحة تجارب لتمثيل الخصائص الكهربائية للأغشية. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في تغيير المقاومة والسعة في دائرة نموذجية لرؤية التأثيرات على تتبعات الجهد.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تطبيق المفاهيم المكتسبة من دائرة نموذجية على تحضير عصبي حي. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي تسجيل جهود الفعل المركبة وفهم خصائص فترات الجموح العتبية والنقل التشابكي. وفي النهاية، تظهر النتائج كيف يمكن أن تكون دراسة نماذج الدوائر الكهربائية للأغشية البيولوجية وخصائص الأعصاب الحية أدوات تعليمية مفيدة، كما تم توضيحه من خلال تغيير مكونات الدائرة النموذجية وتنويع تحفيز العصب الحي.

يمكن لهذه الطريقة أن توفر رؤية حول كيفية فهم الأغشية البيولوجية من حيث النماذج الكهربائية. كما يمكن تطبيقها على أنسجة أخرى مثل العضلات البصرية. ويعد استعراض هذه الطريقة أمراً بالغ الأهمية، حيث إن عملية تشريح الحبل العصبي البطني وإعداد جهاز التسجيل قد تكون صعبة في البداية، ويجب توخي الحذر لتجنب إتلاف الأعصاب من أجل الحصول على إعداد جيد لتحفيز الحبل العصبي والتسجيل منه.

في الجزء الأول من التجربة، تُستخدم المقاومات والمكثفات لمحاكاة النشاط الكهربائي لغشاء الخلية العصبية. تحتوي الدائرة الأولية على مقاومات فقط، ثم تُضاف المكثفات في خطوة لاحقة.

تُمثَّل الخصائص المقاومة السلبية لغشاء العصب بواسطة الدائرة الموضحة هنا. تم إعداد لوحة التجارب (breadboard) بمقاومات على التوازي بقيمة 33 kilo ohms، لتمثيل مقاومة الغشاء المستعرض، ومقاومات على التوالي بقيمة 10 kilo ohms لتمثيل المقاومة داخل الخلوية. تفترض هذه الدائرة أن مقاومة السائل الخارجي ضئيلة مقارنة بالمقاومتين داخل الخلوية والمستعرضة للغشاء.

عندما تكتمل خلية النموذج، قم بتوصيل أسلاك المخرجات من مختبر الطاقة إلى لوحة التجارب (breadboard). يقوم مختبر الطاقة بتوليد المنبه ويحتوي على مسبار قياس لتسجيل الجهد الكهربائي. بعد ذلك، قم بتوصيل مختبر الطاقة بجهاز الكمبيوتر.

يُستخدم الكمبيوتر لعرض الإشارات الكهربائية المسجلة من لوحة التجارب (breadboard). الخطوة التالية هي إعداد برنامج الكمبيوتر الذي سيتحكم في المنبه المرسل من جهاز PowerLab إلى خلية العصب النموذجية. افتح برنامج LabChart من سطح المكتب.

اختر ملفاً جديداً (new file)، ثم اختر الإعداد (setup)، وبعد ذلك إعدادات القنوات (channel settings). حدد قناة واحدة ليتم عرضها، ثم اختر لوحة المحفز (stimulator panel). يتطلب الأمر نبضات طويلة بجهد 1.5 volts.

بالنسبة لهذا الجزء من التجربة، اضبط السعة على فولت واحد. سيصدر مختبر الطاقة (power lab) جهداً يتأرجح بين 0.5 فولت موجبة وسالبة، مما يؤدي إلى تحفيز ذروة يبلغ فولت واحد. اضبط التردد على 0.75 hertz ومدة النبضة على ثانية واحدة.

بالنسبة لإعدادات القناة، اختر القناة الأولى للمراقبة، وانقر فوق مضخم الإدخال (input amplifier)، وفي المربع، انقر فوق زر التفاضلي (differential) واضبط المدى على خمسة فولتات ثم اختر موافق. الخطوة التالية هي تطبيق إشارة كهربائية على نموذج الخلية العصبية وفحص فقدان الإشارة على طول النموذج. قم بتطبيق جهد كهربائي عند أحد طرفي الدائرة بين A و B بالنقر فوق بدء (start) في الكمبيوتر.

قم بقياس الجهد الكهربائي لطول الوحدة الأول على طول محور الخلية النموذجي وراقبه على جهاز الكمبيوتر. اترك السلك الأحمر لمسبار قياس الجهد ثابتاً عند النقطة A على لوحة التجارب (breadboard) بينما تقوم بنقل السلك الآخر إلى مواقع مختلفة بين المقاومات المتصلة على التوالي. لاحظ انخفاض الجهد عند المواقع الأكثر بعداً.

الآن، أوقف التسجيل بالضغط على زر الإيقاف في الكمبيوتر. قم بقياس فروق الجهد المحفوظة في المخططات المخزنة على الكمبيوتر باستخدام المؤشر لنقل المخطط إلى كل نبضة تم تسجيلها. استخدم مؤشر العلامة M الموجود في الزاوية السفلية اليسرى لتحديد قاع المخطط، وضع المؤشر الحر عند قمة المخطط لقياس فرق الجهد.

اقرأ قياس فرق الجهد من الشاشة ودونه في دفتر ملاحظاتك لكل موقع قياس على طول الدائرة الكهربائية. الخطوة التالية هي حساب ثابت الطول للخلية النموذجية، والذي يُستخدم لوصف الاضمحلال الأسي للإشارة عبر المسافة. قم بتمثيل كل قيمة لفرق الجهد على رسم بياني يوضح فرق الجهد مقابل المسافة من المصدر، حيث تُعتبر مقاومات الغشاء وحدة واحدة.

بصرف النظر عن الرسم البياني الخاص بك، قم بتحديد ثابت الطول لهذه الدارة. يُعرَّف ثابت الطول لليف العصبي بأنه المسافة التي ينخفض عندها فرق الجهد عبر الغشاء إلى 37% من قيمته الأصلية عند نقطة المنشأ. ومن أجل محاكاة الخصائص السلبية للكابل في الألياف العصبية والعضلية بشكل أفضل، سيتم توسيع نموذج الخلية العصبية ليشمل كلا المكونين المقاوم والمكثف.

لا تقتصر مقاومة غشاء الخلية العصبية على المقاومة المستعرضة فحسب، بل توجد أيضاً سعة غشائية سطحية تؤدي إلى تشويه إشارة الخلية العصبية. ولمحاكاة ذلك، قم بتوصيل مكثفات بسعة 10 micro fert على التوازي مع الغشاء المستعرض. تتوفر المقاومات على لوحة التجارب (breadboard) الموجودة بجوار الكمبيوتر.

اضبط المحفز لاستخدام ثانية واحدة، وبجهد فولت واحد، وهو ما يمثل إعداد سعة يبلغ 0.5 فولت ونبضات بتردد 0.75 هرتز. وأيضاً، في الجانب العلوي الأيمن من اللوحة، اضبط معدل الاستحواذ على 20K في الثانية. بعد ذلك، انقر فوق القناة الأولى في الجانب الأيمن من الشاشة.

انقر فوق مضخم الإدخال في المربع. انقر فوق زر التفاضلي واضبط المدى على خمسة فولتات. انقر فوق موافق.

لحفظ هذه التغييرات، انقر فوق "بدء" (start) للبدء في جمع البيانات. قم بقياس البيانات عند النقاط نفسها على لوحة التجارب (breadboard). بعد جمع البيانات، استخدم نافذة التكبير لتوسيع وقت الصعود (rise time) في إحدى النبضات المربعة.

كرر عملية التكبير حسب الحاجة لتوسيع المخطط. قم بقياس الوقت الذي تستغرقه الإشارة للارتفاع من خط الأساس إلى قمة مخطط الجهد، وذلك عند وصولها إلى مرحلة الاستقرار تماماً.

راقب المخطط الزمني للتغير في الجهد وتشوه النبضات المربعة. لاحظ أيضاً ما إذا كان الجهد المقاس يتجاوز 0.2 فولت باستخدام المؤشر M والمؤشر الحر كما سبق، واقرأ التغير في الجهد وسجل البيانات في دفتر ملاحظاتك، مع افتراض أن جهد العتبة هو 0.2 فولت. قم بقياس الوقت الذي استغرقه الجهد للوصول إلى العتبة عند كل مقاومة غشائية.

قم بتمثيل نتائجك برسم بياني يوضح الزمن مقابل المسافة، علماً بأن الزيادة في سمك غمد الميالين تؤدي إلى انخفاض في سعة الغشاء. قم بمحاكاة ذلك عن طريق استبدال مكثفات 10 micro ferd الموجودة على لوحة التجارب بمكثفات أصغر بسعة 0.1 micro ferd. ثم كرر التجربة السابقة.

لاحظ التغير في الوقت اللازم للوصول إلى العتبة عند مقاومة مختارة. قم بمطابقة هذه البيانات مع بيانات المكثفات الأكبر على الرسم البياني السابق للوقت مقابل المسافة. تتيح زيادة سمك غمد الميالين للإشارات الكهربائية أن ترتفع وتنخفض بسرعة أكبر في الخلية العصبية، مما يؤدي إلى زيادة سرعة التوصيل.

في الجزء التالي من التجربة، سيتم فحص الخصائص الكهركيميائية للمحاور العصبية في الحبل العصبي البطني لجراد البحر. كما تُلاحظ خصائص انتشار التيار السلبي الموضحة في الدارات النموذجية في التحضيرات الحية. ومع ذلك، هناك حاجة إلى جهد فعل كلما دعت الحاجة إلى نقل إشارة عبر مسافة تبلغ بضعة مليمترات، لأن الخصائص الكهربائية السلبية للخلايا ستؤدي إلى تخميد الإشارات عبر هذه المسافة.

عندما تنتقل الإشارات على طول الحبل العصبي البطني لجراد البحر بسرعات توصيل مختلفة، فإن الإشارات الأسرع هي التي ستُرصد أولاً، تليها الإشارات الأبطأ بفارق زمني بسيط. وستتراكم بعض هذه الإشارات في التسجيل بناءً على مجموعة المحاور العصبية ذات سرعات التوصيل المتشابهة. ويُشار إلى هذه الإشارة الكهربائية المتراكمة الناتجة عن محاور عصبية متعددة باسم جهد الفعل المركب.

تركز السلسلة التالية من التجارب على تسجيل جهود الفعل المركبة من أعصاب جراد البحر للحصول على الحبل العصبي البطني لجراد البحر. أولاً، قم بتجهيز أدوات التشريح الخاصة بطبق الأعصاب والمحاليل الملحية. ضع جراد البحر على الثلج لمدة خمس دقائق تقريباً لتخديره.

بمجرد تخدير جراد البحر، لفه بمنشفة ورقية رطبة وأمسكه بإحدى يديك بحيث تكون المخالب بين الإبهام والسبابة. وباستخدام اليد الأخرى، قم بإجراء شق بالمقص عبر الرأس (rostrum) بين المحجرين. قص لأسفل من موقع الشق حتى يتم فصل الرأس تمامًا.

أزل المخالب وأرجل المشي. قم بإجراء شق عند قاعدة الصدر الرأسي فوق البطن وافصل الصدر الرأسي. أزل الذيل والزعانف السابحة.

أجرِ قطعاً على كلا الجانبين من الجهة البطنية للبطن. كن حذراً لضمان عدم إتلاف الأنسجة العميقة. قم بإزالة الجزء المتحرر من الهيكل الخارجي وصولاً إلى قاعدة مروحة الذيل وذلك للكشف عن الحبل العصبي البطني.

باستخدام حافة الملاقط، قم بإزالة الحبل العصبي البطني بعناية من الطرف. احذر من شد أو سحق الحبل العصبي. أي عقد تُلاحظ على الحبل العصبي هي عقد عصبية خاصة باستاكوزا المياه العذبة.

ضع الحبل العصبي فوق القضبان المعدنية في غرفة العصب. من الضروري الحفاظ على رطوبة الحبل العصبي البطني. ولتحقيق ذلك، أضف كمية كافية من محلول ملحي لسرطان البحر إلى غرفة العصب حتى يصل المستوى إلىما يوازي القضبان المعدنية العرضية.

بعد ذلك، اسحب كمية كافية من محلول ملحي لسرطان البحر باستخدام الماصة بحيث يلامس مستوى السائل الجزء السفلي من القضبان فقط. وبمجرد استقرار الحبل العصبي في مكانه، قم بتوصيل كابل المحفز الذي يحتوي على طرفي خطاف صغير بغرفة العصب. قم بتوصيل الطرف الأحمر الموجب بإحدى الحلقات المعدنية الخارجية القريبة من نهاية الحبل العصبي، وقم بتوصيل الطرف الأسود السالب بالحلقة المعدنية المجاورة التي تلامس الحبل العصبي أيضاً.

استخدم الملاعب (manipulator) لوضع قطب الشفط بالقرب من نهاية العصب في الجهة المقابلة للأقطاب السالبة والموجبة. قم بشفط طرف الحبل العصبي البطني بعناية داخل قطب التسجيل. قم بتوصيل القطب بمسبار مرحلة الرأس (head stage probe) عن طريق توصيل سلك واحد من قطب الشفط بالمدخل الموجب للمسبار والسلك الآخر بالمدخل السالب.

لا يهم أي سلك يتصل بأي مدخل. يمكن تأريض المسبار بقفص فاراداي أو بحمام المحلول الملحي باستخدام سلك كلوريد الفضة، أو توصيله بمدخل التأريض في المضخم التفاضلي لتقليل ضجيج التردد 60 hertz. قم بتوصيل المسبار بالمضخم التفاضلي، ثم صل المضخم بجهاز PowerLab.

تحقق من إعدادات المضخم RS الموضحة في الجدول الموجود في المقالة المرفقة. استخدم كابل USB لتوصيل PowerLab بجهاز الكمبيوتر. افتح برنامج Scope الموجود على سطح مكتب الكمبيوتر في الجزء العلوي الأيمن من الشاشة.

اختر القناة الثانية ثم قم بإيقاف تشغيلها. اضبط الشاشة بحيث تظهر القناة الأولى فقط عن طريق سحب الشريط الموجود في المنتصف إلى أسفل الشاشة. تحقق من مضخم الإدخال وفقاً للإعدادات الواردة في الورقة البحثية المرفقة.

بعد ذلك، من قائمة الإعداد (setup) في أعلى الشاشة، اختر المحفز (stimulator) وقم بإيقاف تشغيل الجذع المعزول (isolated stem)، ثم اضبط التأخير (delay) على 5 milliseconds، والمدة (duration) على 1 millisecond، وعدد النبضات على نبضتين، والفترة الزمنية (interval) على 15 milliseconds، والنطاق (range) على 5 volts، والسعة (amplitude) على 0.5 volts. لبدء تحفيز الحبل العصبي البطني، انقر فوق زر البدء (start) في أسفل يسار الشاشة. يجب أن يظهر جهد فعل محدد بوضوح في مربع جمع بيانات المجهر (scope data collection box).

ارسم الشكل العام لجهد الفعل في دفتر ملاحظاتك. قم بخفض الجهد تدريجياً باستخدام التبويب الموجود في أعلى يسار الشاشة. يجب أن يتناقص مقدار جهد الفعل حتى يختفي نمط الموجة المميز له.

يؤدي خفض الجهد الكهربائي إلى تقليل عدد العصبونات التي يتم استنفارها للمساهمة في جهد الفعل المركب؛ ولعكس هذا التأثير، يتم زيادة الجهد تدريجيًا. ومع استنفار المزيد من العصبونات، تزداد سعة موجة جهد الفعل المركب. يوضح هذا التمرين حقيقة أن العصبونات الفردية تمتلك عتبات مختلفة يتم عندها استحثاث جهود الفعل الخاصة بها.

عندما لا تؤدي الزيادة الإضافية في جهد التحفيز إلى زيادة جهد الفعل المركب، فهذا يعني أنه تم استنفاد جميع العصبونات، ويجب أن يظهر ذروتان متمايزتان في موجة جهد الفعل على شاشة الكمبيوتر. يتناول الجزء التالي من التجربة فترة الجموم للمحاور العصبية. قم بتغيير التأخير بين النبضات باستخدام التبويب الموجود في الزاوية العلوية اليسرى من الشاشة.

استمر في تقليل مدة التأخير حتى لا يمكن استحثاث جهد فعل مركب ثانٍ. تُعرف فترة الجموع المطلقة بأنها التأخير الزمني بين النبضات الذي لا يمكن عنده استحثاث جهد فعل ثانٍ. أما فترة الجموع النسبية، فتُعرف بأنها الفترة الممتدة من نهاية فترة الجموع المطلقة حتى الوقت الذي يؤدي فيه إعطاء محفز ثانٍ إلى توليد جهد فعل ثانٍ بسعة كاملة.

يمكنك الآن استقصاء خصائص مثبط الوصلات الفجوية مثل hept ethanol. ويمكن مقارنة الاختلافات في جهد الفعل المركب لنفس إعدادات التحفيز لتحديد الإشارات التي يتم نقلها عبر الوصلات الفجوية على طول الحبل العصبي البطني. كما يمكنك أيضاً استخدام محلول ملحي بارد أو دافئ وقياس الاختلافات في سرعات التوصيل لمختلف الكيانات التي تشكل جهد الفعل المركب.

يظهر هنا جهدان فعل مركبين تم تسجيلهما من الحبل العصبي البطني لسرطان البحر. يوضح هذا الشكل فترة العصر النسبية، وهي الوقت الذي يلي جهد فعل مركب كامل حيث يؤدي تحفيز ثانٍ إلى استثارة جهد فعل مركب أصغر. كما يوضح هذا الشكل تأثيرات استخدام الهبتانول على جهد الفعل المركب بعد اتباع هذا الإجراء.

يمكن تغيير مكونات دائرة الغشاء البيولوجي للإجابة على أسئلة إضافية، مثل تأثير تغيير كثافة قنوات التسريب في الغشاء أو وظيفة القنوات المبوبة بالجهد بعد تطويرها. وتُمهد هذه التقنيات والإجراءات الطريق للباحثين في مجال الفسيولوجيا لاستكشاف كيفية عمل الخلايا كدوائر كهربائية وكيفية عمل الموصلات الفجوية في الأنسجة الحية لدى الحيوانات.