Name: تقرير من الحامض النووي من الجينات في مطبوع Arabidopsis السويداء (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-01-28T18:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 23 s
Description: اكتشف كيفية تحديد حالة مثيلة الحمض النووي للجينات المطبوعة في السويداء باستخدام Arabidopsis. يوضح هذا البروتوكول عزل السويداء وتحليل المثيلة بتسلسل البيسلفيت لفهم آليات الطبع الوراثي في النباتات.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

الكتاب أشكر السيدة جنيفر M. وميل وتارا Rognan N. لصيانة النباتات Arabidopsis. وأيد هذا العمل من جانب صناديق المبتدئة من جامعة سانت لويس والمعاهد الوطنية للصحة منح 1R15GM086846 - 01 - 01S1 و3R15GM086846 إلى شياو دبليو.

أولا معبر الوراثية 1. يضعف الأصل الإناث من أجل التمييز بين الأم والأب الأليلات باستخدام الحمض النووي تسلسل تعدد الأشكال ، وهما ecotypes مختلفة ، وسيتم اختيار مثل كولومبيا - 0 (العقيد - 0) ، ولير ، والآباء والأمهات من الإناث والذكور. وينبغي أن تكون النباتات من الشباب والأصحاء. يمكن للمرء أن تؤدي إلى إضعاف الوالد الإناث باستخدام مجهر تشريح ، اقي المكبرة ، أو بالعين المجردة. تحديد المرحلة الزهور - 12 (سميث وآخرون ، 1990) ، وإزالة أي الزهور أو siliques فوق وتحت لهم لقطة قاعدة ساق مع المقص. تعقيم بواسطة ملقط غمس قاعدة غيض برفق في كوب من الايثانول 95 ٪ ، مما سيزيل أي حبوب اللقاح على ملقط وقتل حبوب اللقاح كذلك. حدق بلطف بعيدا عن براعم الزهور باستخدام الملقط ، وإزالة بلطف 4 سيبالس ، بتلات 4 و 6 الأسدية ، وترك المدقة العارية وسليمة. في محاولة لتجنب الأضرار التي لحقت كربلات خلال هذه العملية. 2. اختيار الجهة المانحة حبوب اللقاح والاضطلاع التلقيح وanthesed المانحين أفضل لقاح الزهور فتح في المرحلة 14 مع بتلات تمتد بزاوية 90 درجة إلى المدقة (سميث وآخرون ، 1990) ، وفيه الكثير من غبار الطلع ذرف. الاستيلاء على زهرة في القاعدة وعادل فوق ساق ، والذي يؤدي إلى انتشار الزهرة مفتوحة. الغبار وصمة العار التي أعدت من المدقة مع العضو الذكري. بعد التلقيح ، ستتم تغطية وصمة العار مع حبوب اللقاح أصفر ، والتي يمكن ملاحظتها بسهولة تحت المجهر. 3. وسم الصليب بعد تلقيح جميع المدقات عاجزة عن محطة ، ونحن مع التسمية الصليب علامة المجوهرات والمعلومات من الآباء الذكور والإناث والتاريخ. مكان حصة في التربة بالقرب من المصنع ، استخدام سلسلة لادراك التعادل ، تنبع من الإزهار للخطر ، وتغطية التلقيح المدقات بكيس من البلاستيك. II. عزلة مناديل السويداء في Arabidopsis 1. إعداد المواد عادة ما نحصل على المواد اللازمة جاهزة قبل الحصاد والسويداء وأنسجة الجنين : خزان النتروجين السائل والنيتروجين السائل ، ومجهر تشريح ، واثنين من أزواج جديدة من غرامة غيض ملقط (5 INOX بواسطة FST البيولوجيا دومون ، سويسرا) ، الشرائح الزجاجية المجهر ( 3 "X 1" X 1.0 ملم) ، ودرجة الحموضة 5.7 0.3 حل M السوربيتول وزارة التربية والعلم 5 ملم. 2. جمع siliques في 7 -- 8 أو يوما بعد التلقيح (DAP) ، والبذور جاهزة للحصاد في منتصف إلى مرحلة متأخرة من التطور الجنيني نسف والسويداء وتشريح للجنين. في بعض الأحيان ، قد يستغرق 9-10 DAP إذا الزهور عاجزة صغار جدا. 3. عزل السويداء والجنين منذ بذور Arabidopsis ضئيلة ، ونحن استخدام مجهر تشريح لعزل السويداء والجنين. وضع silique 8 - DAP تحت المجهر ، واستخدام زوج من ملقط لعقد عنيقة silique واستخدام غيض من زوج آخر من ملقط لفتح الشريحة silique في الهامش حيث اثنين كربلات الصمامات. استخدام زوج من ملقط لالتقاط بذرة واحدة على 5.7 درجة الحموضة حلول 0.3 M السوربيتول و 5 ملي زارة التربية والعلم ، وجعل قطع صغير في نهاية micropyle تنزلق إلى الجنين ، تضغط على نهاية غير المصقول على طرد السويداء والسويداء منفصلة عن معطف البذور (كينوشيتا وآخرون ، 2004). وضع الجنين والسويداء في microtubes منفصلة في النيتروجين السائل. علينا مواصلة هذا العمل حتى تتراكم الجنين أو السويداء 10-15 siliques وتخزينها ثم الأنبوب في الفريزر -80 درجة مئوية. في بعض الحالات ، السويداء لا بد من فصل من معطف البذور ، أي يمكن للمرء أن عزل الحمض النووي الريبي مجموع من السويداء والبذور مزيج معطف لتحليل البصمة الجينية. III. تسلسل بيسلفيت 1. الكواشف المطلوبة Cetyltrimethyl بروميد الأمونيوم (CTAB) لإعداد الحمض النووي الجيني ، والانزيمات التقييد ، 3 M هيدروكسيد الصوديوم (الطازجة) ، 6،42 م م الصوديوم اليوريا / 4 بيسلفيت (2 ميتابيسلفيت الصوديوم M ، سيغما الدريخ ، S9000 ، Na2S2O5 ، الوزن الجزيئي : 190) ، الهيدروكينون 10 مم ، طقم تنقية الحمض النووي (DNA Promega معالج تنظيف النظام ، القط. # A7280) ، TE العازلة ، 6.3 M هيدروكسيد الصوديوم (الطازجة) ، و 10 M NH 4 OAC ، 20 ميكروغرام / ميكرولتر الحمض الريبي النووي النقال ، والإيثانول بنسبة 100 ٪ . 2. تفاصيل بروتوكول العلاج بيسلفيت <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> عزل الحمض النووي أو السويداء الجينومية الجنين باستخدام إجراء CTAB (روجرز وBendich ، 1988). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 100 نانوغرام هضم -- 2 ميكروغرام من الحمض النووي الجيني في 20 ميكرولتر إلى 100 الحجم الإجمالي ميكرولتر مع تقييد الانزيمات التي تقطع من خارج المنطقة لتحليلها. لالمروج MEA ، ونحن نستخدم XhoI ، NdeI وPstI أو HindIII. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تفسد الانزيمات التقييد غليان الحمض النووي لمدة خمس دقائق ثم تطفئ على الجليد. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 09/01 حجم (2.2 ميكرولتر الحمض النووي لاستيعاب 20 ميكرولتر) من هيدروكسيد الصوديوم واحتضان م 3 عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحل لنقل أنبوب 250 PCR ميكرولتر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حل 7.5 غرام من اليوريا في 10 مل من الماء المقطر المعقم ، ويضاف ببطء 7.6 غرام من الصوديوم ميتابيسلفيت خلال 1-2 ساعات وعادة ما يساعد على حل التدفئة ؛ ضبط الرقم الهيدروجيني إلى 5 الطازجة مع هيدروكسيد الصوديوم M 10 ؛ إضافة الماء المقطر المعقم إلى النهائي إلى حجم 20 مل. هذا هو 6،24 م اليوريا / 4 بيسلفيت الصوديوم حل M. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة اليوريا 6.24 م / 4 بيسلفيت الصوديوم M حل لتركيز النهائي من 5.36 م وM 3.44 ، على التوالي (بولين وآخرون ، 1998). على سبيل المثال ، إضافة 208 ميكرولتر من اليوريا 6.42 م / 4 بيسلفيت الصوديوم M حل لميكرولتر 22.2 أعلاه من الحمض النووي الجينومي متمسخ (شياو وآخرون ، 2003). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة الهيدروكينون 10 ملم الى الحمض النووي في التركيز النهائي من 0.5 مم (12 ميكرولتر الهضم لمدة 20 ميكرولتر). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> علاج السلوك بيسلفيت في جهاز PCR : 30 دورات من 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة وثانية 95 درجة مئوية لمدة 30. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Desalt بيسلفيت الحمض النووي DNA المعالجة باستخدام معالج تنظيف النظام من Promega ومتابعة البروتوكول (جاكوبسن وآخرون ، 2000). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قياس حجم بالضبط TE تعافى من العمود بعد إزالة الملوحة وإضافة هيدروكسيد الصوديوم 6.3 M إلى التركيز النهائي لاحتضان 0.3 م في 37 دقيقة لمدة 15 درجة مئوية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إضافة 10 M NH 4 OAC (الرقم الهيدروجيني 7.0) إلى تركيز النهائي من 3 م ، 2 ميكرولتر من 20 ميكروغرام / ميكرولتر الحمض الريبي النووي النقال ، و 3 مجلدات من الإيثانول بنسبة 100 ٪ ومن ثم المزيج. أجهزة الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة في 14000 دورة في الدقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يغسل مرة واحدة مع بيليه الايثانول 70 ٪ ، لا جهاز للطرد المركزي قصيرة ، وإزالة الايثانول اضافية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بيليه الجافة في speedvac لمدة 5-10 دقائق وresuspend في 25-100 العازلة TE ميكرولتر اعتمادا على المبلغ ابتداء من الحمض النووي. بيسلفيت الصوديوم المعاملة الحمض النووي هو الآن على استعداد لتحليل PCR. </li></ol> 3. PCR التضخيم <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> منذ يتم تحويلها إلى cytosines unmethylated اليوراسيل ، فإنه من الصعب تضخيم شظية كبيرة باستخدام الحمض النووي بيسلفيت المعاملة كقالب. وبالتالي ، فإننا عادة تصميم الاشعال لتضخيم منتج لم يعد من 500 سنة مضت. لتسلسل المروج MEA - 4 كيلوبايت ، قمنا بتصميم مجموعات كثيرة من أجهزة الاشعال وتضخيم 14 شظايا متداخلة لتغطية المنطقة بأسرها (شياو وآخرون ، 2003). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتسلسل الأعلى الجديلة ، في تصميم التمهيدي إلى الأمام ، وأنا) اختيار (G جوانين) المنطقة الغنية من أجل الحصول على أعلى درجة حرارة الصلب دون نكليوتيد اضافية في الاشعال ؛ الثاني) تغيير C (سيتوزين) إلى ص ( البيريميدين) في الفريق الاستشاري والسياقات CNG وتغيير C المتبقية T (الثايمين). في تصميم التمهيدي العكسي ، I) اختيار منطقة C - الغنية ؛ الثاني) لتغيير G R (البيورين) في سياقات CG والغاز الطبيعي المضغوط وتغيير G المتبقية A (الأدنين). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لتسلسل أسفل الجديلة ، في تصميم التمهيدي إلى الأمام ، وأنا) اختيار منطقة C - الغنية ؛ الثاني) لتغيير G R CG في سياقات والغاز الطبيعي المضغوط وتغيير G المتبقية أ في تصميم التمهيدي العكسي ، I) اختر منطقة G - الغنية ؛ الثاني) C لتغيير Y (بيريميدين) في سياقات CG والغاز الطبيعي المضغوط وتغيير C المتبقية إلى T. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> نستخدم عادة 1-2 ميكرولتر من الحمض النووي لمعاملة بيسلفيت الصوديوم كقالب لكل PCR التضخيم (شياو وآخرون ، 2003). PCR المنتج يجب أن يكون عن طريق تحليل الكهربائي للهلام لتأكيد الحجم الصحيح للقطعة ، ثم لابد من تنقية جل والمستنسخة في TOPO TA pCR2.1 ناقلات الاستنساخ (Invitrogen) باعتبارها إدراج. يتم اختيار مستعمرة واحدة حتى والمثقف ؛ الحمض النووي المستخرج البلازميد وأرسلت للتسلسل. </li></ol> 4. تحليل تسلسل مبدأ التسلسل بيسلفيت أنه سيتم تحويلها إلى السيتوزين unmethylated اليوراسيل بسبب نزع الأمين حلمهي بواسطة تركيزات عالية من الصوديوم في بيسلفيت pH5.0 التي سوف تتضخم والثايمين في الناتج PCR ، في حين لن يتم 5 ميثيل سيتوزين يمكن تعديلها بواسطة بيسلفيت الصوديوم ويبقى أن السيتوزين بعد التضخيم PCR (كلارك وآخرون ، 1994 ؛. فرومر وآخرون ، 1992). بعد الحصول على نتيجة التسلسل قارناه مع القالب حبلا الخاصة التي تستخدم لتضخيم PCR. إذا بقايا السيتوزين في قالب يقرأ باعتباره الثايمين في النتيجة التسلسل ، فإنه يشير إلى أن ليس لميثليته السيتوزين. إذا بقايا السيتوزين في قالب يبقى السيتوزين في التسلسل ، فإن ذلك يعني أن ميثليته والسيتوزين. رابعا. ممثل النتائج <img src="/files/ftp_upload/2327/2327fig1.jpg" alt="الشكل 1 /" data-altupdatedat="1787634011000" data-alt="الشكل 1 /"> الشكل 1.

<ol><li>Clark, S. J., Harrison, J., Paul, C. L., Frommer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High+sensitivity+mapping+of+methylated+cytosines%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">High sensitivity mapping of methylated cytosines.</a> Nucleic Acids Res. 22, 2990-2997 (1994).</li>
<li>Cokus, S. J., Feng, S., Zhang, X., Chen, Z., Merriman, B., Haudenschild, C. D., Sriharsa Pradhan, S., Nelson, S. F., Pellegrini, M., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Shotgun+bisulphite+sequencing+of+the+Arabidopsis+genome+reveals+DNA+methylation+patterning%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Shotgun bisulphite sequencing of the Arabidopsis genome reveals DNA methylation patterning.</a> Nature. 452, 215-219 (2008).</li>
<li>Frommer, M., McDonald, L. E., Millar, D. S., Collis, C. M., Watt, F., Grigg, G. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+genomic+sequencing+protocol+that+yields+a+positive+display+of+5-methylcytosine+residues+in+individual+DNA+strands%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">A genomic sequencing protocol that yields a positive display of 5-methylcytosine residues in individual DNA strands.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 89, 1827-1831 (1992).</li>
<li>Gehring, M., Huh, J. H., Hsieh, T. F., Penterman, J., Choi, Y., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Fischer, R. L. D. E. M. E. T. E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+glycosylase+establishes+MEDEA+polycomb+gene+self-imprinting+by+allele-specific+demethylation%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">DNA glycosylase establishes MEDEA polycomb gene self-imprinting by allele-specific demethylation.</a> Cell. 124, 495-506 (2006).</li>
<li>Henderson, I. R., Chan, S. R., Cao, X., Johnson, L., Jacobsen, S. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Accurate+sodium+bisulfite+sequencing+in+plants%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics%22%5BJournal%5D)">Accurate sodium bisulfite sequencing in plants.</a> Epigenetics. 5, 47-49 (2010).</li>
<li>Hsieh, T. F., Ibarra, C. A., Silva, P., Zemach, A., Eshed-Williams, L., Fischer, R. L., Zilberman, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+demethylation+of+Arabidopsis+endosperm%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genome-wide demethylation of Arabidopsis endosperm.</a> Science. 324, 1451-1454 (2009).</li>
<li>Jacobsen, S. E., Sakai, H., Finnegan, E. J., Cao, X., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ectopic+hypermethylation+of+flower-specific+genes+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Biol%22%5BJournal%5D)">Ectopic hypermethylation of flower-specific genes in Arabidopsis.</a> Curr. Biol. 10, 179-186 (2000).</li>
<li>Kinoshita, T., Miura, A., Choi, Y., Kinoshita, Y., Cao, X., Jacobsen, S. E., Fischer, R. L., Kakutani, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((One-way+control+of+FWA+imprinting+in+Arabidopsis+endosperm+by+DNA+methylation%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">One-way control of FWA imprinting in Arabidopsis endosperm by DNA methylation.</a> Science. 303, 521-523 (2004).</li>
<li>Lister, R., O'Malley, R. C., Tonti-Filippini, J., Gregory, B. D., Berry, C. C., Millar, A. H., Ecker, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Highly+integrated+single-base+resolution+maps+of+the+epigenome+in+Arabidopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Highly integrated single-base resolution maps of the epigenome in Arabidopsis.</a> Cell. 133, 523-536 (2008).</li>
<li>Lister, R., Pelizzola, M., Dowen, R. H., Hawkins, R. D., Hon, G., Tonti-Filippini, J., Nery, J. R., Lee, L., Ye, Z., Ngo, Q. -M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+DNA+methylomes+at+base+resolution+show+widespread+epigenomic+differences%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Human DNA methylomes at base resolution show widespread epigenomic differences.</a> Nature. 462, 315-322 (2009).</li>
<li>Paulin, R., Grigg, G. W., Davey, M. W., Piper, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Urea+improves+efficiency+of+bisulfite-mediated+sequencing+of+5%27-+methylcytosine+in+genomic+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl.+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Urea improves efficiency of bisulfite-mediated sequencing of 5'- methylcytosine in genomic DNA.</a> Nucl. Acids Res. 26, 5009-5010 (1998).</li>
<li>Rogers, S. O., &amp, B. endich, J, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Extraction+of+DNA+from+plant+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Molecular+Biology+Manual%22%5BJournal%5D)">Extraction of DNA from plant tissues.</a> Plant Molecular Biology Manual. A6, 1-10 (1988).</li>
<li>Smyth, D. R., Bowman, J. L., Elliot, M., Meyerowitz, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Early+Flower+Development+in+Arab%C3%ADdopsis%5BTitle%5D)+AND+%22Plant+Cell%22%5BJournal%5D)">Early Flower Development in Arabídopsis.</a> Plant Cell. 2, 755-767 (1990).</li>
<li>Xiao, W., Gehring, M., Choi, Y., Margossian, L., Pu, H., Harada, J. J., Goldberg, R. B., Pennell, R. I., Fischer, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Imprinting+of+the+MEA+Polycomb+gene+is+controlled+by+antagonism+between+MET1+methyltransferase+and+DME+glycosylase%5BTitle%5D)+AND+%22Dev.+Cell%22%5BJournal%5D)">Imprinting of the MEA Polycomb gene is controlled by antagonism between MET1 methyltransferase and DME glycosylase.</a> Dev. Cell. 5, 891-901 (2003).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

فمن السهل نسبيا لفصل جنين من السويداء ، ومعطف البذور ، لكنها مملة لفصل السويداء من معطف البذور ، وخاصة بالنسبة للبذور في مرحلة مبكرة أو منتصف الطوربيد ، من مرحلة التطور الجنيني. منذ معطف البذور يساهم سوى كمية صغيرة جدا من الأنسجة ، وبالنسبة لبعض الجينات ، مثل الشرق الأوسط وأفريقيا وFWA ، ونحن لم يكن لديك لفصل السويداء من معطف البذور. وهذا يعني أننا نستطيع عزل الرناوات من خليط من السويداء والأنسجة معطف البذور ، والتحقق من التعبير عن الأليلات الأم والأب من الجينات ، مقارنة ...

لوازم <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح مجهر </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقص </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الملقط تلميح غرامة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> العلامة الحلي </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مصنع ستيكس </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> السلسلة أو تويست ، ربطات عنق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 4 &quot;X 2&quot; X 8 أكياس البولي ايثيلين &quot; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 &quot;X 1&quot; X الشرائح مجهر 1.0 ملم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> النتروجين السائل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حاويات النتروجين السائل </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحرارة بلوك </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> PCR أنابيب </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Thermocycler </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microcentrifuge أنابيب </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Microcentrifuge </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هلام إستشراد مرفق </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Arabidopsis thaliana كولومبيا - 0 النباتات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Arabidopsis thaliana ندسبرغ النباتات عمودي </li></ul> الكواشف <ul style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 70 ٪ إيثانول </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 95 ٪ إيثانول </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإيثانول بنسبة 100 ٪ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 0.3 م و 5 ملي سوربيتول MES - 5.7 درجة الحموضة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cetyltrimethyl بروميد الأمونيوم (CTAB) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الإيثانول بنسبة 100 ٪ </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Cholorform </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تقييد الانزيمات </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 3 M هيدروكسيد الصوديوم </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> هيدروكسيد الصوديوم 6.3 M </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 6.24 M اليوريا / 4 بيسلفيت الصوديوم M </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مقطر معقم H 2 O </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 ملي هيدروكينون </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحمض النووي المعالج تنظيف النظام (Promega) </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 10 M NH 4 OAC </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 20 ميكروغرام / ميكرولتر الحمض الريبي النووي النقال </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> TE العازلة </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وTOPO TA الاستنساخ كيت (Invitrogen) </li></ul>

تقرير من الحامض النووي من الجينات في مطبوع arabidopsis السويداء

Determination of DNA Methylation of Imprinted Genes in Arabidopsis Endosperm

thaliana Arabidopsis هو كائن نموذجا ممتازا لدراسة آليات جينية. أحد الأسباب هو متحولة خالية من خسارة وظيفة من methyltransferases الحمض النووي قابلة للحياة ، وبالتالي توفير نظام لدراسة كيفية فقدان الحامض النووي في الجينوم يؤثر على النمو والتنمية. يطبع التعبير يشير إلى الفرق الأليلات الأم والأب ، ويلعب دورا هاما في عملية التنمية في كل من استنساخ الثدييات والنباتات. الحامض النووي هو أمر حاسم لتحديد ما إذا كان يتم التعبير عن الأب أو الأم الأليلات لجينة مطبوع أو إسكاته. في النباتات المزهرة ، وهناك حدث الإخصاب مزدوجة في الاستنساخ : خلية واحدة يخصب الحيوان المنوي البويضة لتشكيل خلية الجنين والصمامات الحيوانات المنوية الثاني مع الخلية المركزية تثير السويداء. السويداء هو الأنسجة حيث يطبع يحدث في النباتات. MEDEA ، مجموعة مجموعة الجينات Polycomb المجال ، وFWA ، وهو عامل النسخ تنظيم المزهرة ، هم أول اثنين من الجينات أظهرت أن تكون مطبوعة في السويداء والتعبير عنها هي التي تسيطر عليها الحامض النووي ونزع الميثيل في النباتات. من أجل تحديد الوضع يطبع من الجينات ونمط مثيلة في السويداء ، ونحن بحاجة إلى أن تكون قادرة على عزل السويداء الأول. منذ البذور صغيرة في Arabidopsis ، فإنه لا يزال تحديا لعزل السويداء Arabidopsis ودراسة مثيلة لها. في هذا البروتوكول الفيديو ، فإننا تقرير كيفية إجراء عبر الجينية ، لعزل نسيج السويداء من البذور ، وتحديد حالة مثيلة بواسطة التسلسل بيسلفيت.

يطبع ظاهرة التكاثر في النباتات والثدييات. الحامض النووي يلعب دورا مهما في آليات يطبع. عزل وتحديد مركز السويداء مثيلة من الجينات في مطبوع<em&gt; Arabidopsis</em&gt; يمكن أن يكون صعبا. في هذا البروتوكول ، ونحن تصف كيفية عزل السويداء وتحديد التسلسل مثلأيشن بواسطة بيسلفيت.

تقرير من الحامض النووي من الجينات في مطبوع Arabidopsis السويداء

تُعد نبتة *Arabidopsis thaliana* كائناً نموذجياً ممتازاً لدراسة الآليات فوق الجينية. وأحد الأسباب في ذلك هو وجود طفرة خالية من الوظيفة (null mutant) للحمض النووي...

الهدف العام من هذا الإجراء هو تحديد حالة ميثيلة DNA للجينات المطبوعة في السويداء. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق خصي النبات الأبوي الأنثوي، ثم تلقيح الأب الأنثوي بحبوب لقاح من النبات الأبوي الذكري.بعد ذلك، يتم تشريح السويداء من البذرة الملقحة خلطياً. والخطوة النهائية من الإجراء هي إجراء تسلسل البيسلفيت للحمض النووي DNA للسويداء. وفي الختام، يمكن الحصول على نتائج توضح حالة مثيلة DNA للأليل الأمومي أو الأبوي لجين مطبوع من خلال تعدد أشكال تسلسل DNA في الأنماط البيئية المختلفة وتسلسل البيسلفيت.مرحباً، أنا د. يانغ شو من قسم الأحياء في جامعة سانت لويس. مرحباً، أنا ماثيو راي من مختبر د. ج وقسم الأحياء في جامعة سانت لويس. أنا ديمان بانو من مختبر د. ج.سنعرض لكم اليوم إجراءً لتشريح rugby officer وتحديد حالة مثيلة الـ DNA عن طريق تسلسل sulf FAR. نحن نستخدم هذا الإجراء في مختبرنا لدراسة البصم الجيني الذي يتم تنظيمه بواسطة مثيلة الـ DNA وإزالة المثيلة. لذا، فلنبدأ.لبدء هذا الإجراء، اختر نمطين مظهرين بيئيين مختلفين من نبات Arabidopsis ليعملا كأبوين (أنثى وذكر)، وذلك من أجل تمييز الأليلات الأمومية والأبوية باستخدام تعدد أشكال تسلسل DNA. هنا، تم اختيار Columbia zero وLandsberg Erecta كأبوين أنثى وذكر على التوالي. احرص على اختيار نباتات صغيرة وسليمة.قم بإزالة الأعضاء الذكرية من النبات الأم باستخدام مجهر تشريحي. حدد الأزهار في المرحلة 12 وقم بإزالة أي أزهار أو براعم زهرية (LICs) تقع فوقها أو تحتها عن طريق قص قاعدة الحامل باستخدام المقص. قم بتعقيم الملاقط عن طريق غمس طرفها برفق في بيكر يحتوي على 95%ethanol.سيؤدي ذلك إلى إزالة أي حبوب لقاح عالقة بالملقط وقتل حبوب اللقاح. افصل براعم الأزهار برفق باستخدام الملقط وأزل بعناية أربعة سبلات، وأربع بتلات، وستة أسدية، مع ترك المتاع عارياً وسليماً. حاول تجنب إلحاق الضرر بالكرابل خلال هذه العملية.تتمثل الخطوة التالية في اختيار المتبرع باللقاح وإجراء عملية التلقيح؛ وأفضل المتبرعين باللقاح هي الأزهار المتفتحة في المرحلة 14 التي تمتد بتلاتها بزاوية 90 درجة بالنسبة للميسم، حيث يتم تساقط كمية كبيرة من اللقاح. أمسك الزهرة من القاعدة ومن فوق السويقة مباشرةً، مما سيؤدي إلى تفتح الزهرة؛ ثم قم بتلقيح ميسم الميسم المُجهز باستخدام المئبر.بعد عملية التلقيح، ستتغطى الميسمة بحبوب لقاح صفراء، والتي يمكن ملاحظتها بسهولة تحت المجهر. بعد تلقيح جميع المداق منزوعة الأسدية في النبات، قم بتمييز عملية التهجين باستخدام بطاقة مجوهرات. قم بتدوين التاريخ ومعلومات الأبوين الأنثوي والذكري.ضع وتداً في التربة بالقرب من النبات. استخدم خيطاً لربط ساق النبات بالوتد، ثم قم بتغطية المياسم الملقحة بكيس بلاستيكي. بعد مرور سبعة أو ثمانية أيام من التلقيح (DAP)، تكون البذرة جاهزة للحصاد في المرحلة الطوربيدية المتوسطة إلى المتأخرة من تكوين الجنين، ومن ثم يتم تشريحها.بالنسبة للسويداء والجنين، ضع ثمرة salic عمرها ثمانية DAP تحت المجهر التشريحي. وباستخدام ملقط، أمسك بخلية EK P واستخدم طرف ملقط آخر لفتح الفتحة الموجودة في الحافة حيث يلتحم الكربولان. استخدم ملقط BPS لالتقاط بذرة واحدة ووضعها على شريحة زجاجية.بعد ذلك، قم بإجراء قطع صغير عند طرف الكومة الدقيقة لإخراج الجنين. اضغط على الطرف غير المقطوع لدفع السويداء وإخراجها وفصلها عن غلاف البذرة. بعد ذلك، ضع الجنين والسويداء في أنابيب دقيقة منفصلة وفي نيتروجين سائل.استمر في هذه العملية حتى يتم تجميع كمية كافية من الجنين أو السويداء من 10 إلى 15 CLICs. بعد ذلك، تُخزن الأنابيب في مجمد عند درجة حرارة -80 °C قبل البدء بمعالجة البيسلفيت. قم بعزل الحمض النووي الجينومي للسويداء أو الجنين باستخدام إجراء trimethyl ammonium bromide أو CTAB دقيق.بمجرد عزل الحمض النووي الجينومي (gDNA) للسويداء، قم بهضم 100 nanograms في تفاعل بحجم إجمالي قدره 20 µL باستخدام إنزيمات القطع التي تقطع خارج المنطقة المراد تحليلها. بالنسبة لإنزيمات القطع الخاصة بمروج ME، يتم استخدام xh و O one ND one و PST one. قم بمسخ إنزيمات القطع عن طريق غلي الحمض النووي لمدة خمس دقائق.ثم قم بإيقاف التفاعل على الثلج. أضف جزءًا واحدًا من تسعة من الحجم أو 2.2 µL من هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 3 M واحضن الخليط عند 37 °C لمدة 15 دقيقة. بعد الحضن، انقل المحلول إلى أنبوب PCR سعة 250 µL.بعد ذلك، قم بتحضير محلول يوريا بتركيز 6.24 مولار ومحلول ميتاكبريتيت الصوديوم بتركيز 4 مولار عن طريق إذابة 7.5 جرام من اليوريا في 10 ملليلتر من الماء المقطر المعقم، ثم أضف ببطء 7.6 جرام من ميتاكبريتيت الصوديوم على مدار ساعة إلى ساعتين مع تسخين المحلول وتحريكه. وبمجرد الذوبان، اضبط قيمة pH إلى 5 باستخدام هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 10 مولار المحضر حديثاً.أضف ماءً مقطراً معقماً حتى يصل الحجم النهائي إلى 20 milliliters. انقل 208 microliters من هذا المحلول إلى 22.2 microliters من الحمض النووي الجينومي (genomic DNA) لنسيج السويداء الممسخ. ثم أضف 12 microliters من الهيدروكينون (hydroquinone) بتركيز 10 millimolar المحضر حديثاً إلى الحمض النووي.أجرِ معالجة البيسلفيت في جهاز PCR لـ 30 دورة عند 55 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة، تليها 95 درجة مئوية لمدة 30 ثانية. بعد ذلك، قم بإزالة الأملاح من الـ DNA المعالج بالبيسلفيت باستخدام نظام wizard، DNA cleanup من شركة Promega. ووفقاً لتعليمات الشركة المصنعة، قم بقياس الحجم الدقيق لمحلول TE المسترجع من العمود بعد عملية إزالة الأملاح.ثم يُضاف هيدروكسيد الصوديوم بتركيز 6.3 مولار ليصل التركيز النهائي إلى 0.3 مولار. يتم تحضين الخليط عند 37 درجة مئوية لمدة 15 دقيقة. وبعد التحضين، يُضاف خلات الأمونيوم بتركيز 10 مولار ليصل التركيز النهائي إلى 3 مولار، و 2 µL من TRNA بتركيز 20 µg/µL، وثلاثة أحجام من الإيثانول بتركيز 100%.اخلط العينة ثم قم بطردها مركزياً لمدة 15 دقيقة بسرعة 14,000 RPM. اغسل الراسب مرة واحدة باستخدام ethanol بتركيز 70%، يليه طرد مركزي قصير لإزالة الإيثانول الزائد. وأخيراً، جفف الراسب في جهاز SpeedVac لمدة خمس دقائق ثم أعد تعليقه في 25 microliters من منظم TE buffer.أصبح الحمض النووي DNA المعالج بـ sodium BI cite جاهزاً الآن لتحليل PCR. لتسلسل منطقة مروج Madea البالغ طولها أربعة كيلوباز، صمّم عدة مجموعات من البادئات وقم بتضخيم 14 قطعة متداخلة لتغطية المنطقة بأكملها. ابدأ بتصميم بادئ أمامي لتسلسل الشريط العلوي.أولاً، اختر منطقة غنية بالجوانين من أجل الحصول على درجة حرارة تلدين أعلى دون الحاجة إلى نوكليوتيدات طويلة جداً في البادئات. بعد ذلك، قم بتغيير السيتوزين إلى بيريميدين في سياقات CG و C NG. ثم قم بتغيير أي سيتوزين آخر إلى ثايمين.عند تصميم بادئ عكسي، اختر منطقة غنية بالسيتوزين. قم باستبدال الغوانين بالبيورين في سياق CG وCNG، وأي غوانين أخرى بالأدينين. لتسلسل الشريط السفلي مرة أخرى، ابدأ بتصميم بادئ أمامي.اختر منطقة غنية بالسيتوسين وقم بتغيير الغوانين إلى بيورين في سياقات CG و CNG. قم بتغيير الغوانينات الأخرى إلى أدينين. عند تصميم البادئ العكسي، اختر منطقة غنية بـ AINE.قم بتحويل السيتوزين إلى باريدين في سياقات CG و CNG، وحوّل السيتوزينات المتبقية إلى ثايمين. بمجرد تصميم البادئات، قم بتحضير تفاعل PCR باستخدام 2 µL من الحمض النووي DNA المعالج ببيسلفيت الصوديوم كقالب لكل عملية تضخيم PCR. قم بتشغيل تفاعل PCR وتحليل الناتج بواسطة الفصل الكهربائي للهلام للتأكد من الحجم الصحيح للقطعة.الهلام التالي. قم بتنقية ناتج PCR واستنساخه في ناقل الاستنساخ in vitrogen topo TA cloning vector PCR 2.1. كقطعة مدرجة وقم بتسلسل المستنسخات الفردية؛ حيث تعتمد آلية التسلسل باستخدام البيسلفيت على تحويل السيتوزين غير الميثيلي إلى يوراسيل نتيجة لإزالة الأمين المائية بواسطة تركيز عالٍ من sodium by sulfite عند pH 5.0.وعلى العكس من ذلك، فإن 5-methyl cytosine لن يتأثر بمعالجة sodium bisulfite. وسيتم تضخيم Uracil على هيئة thymine في ناتج PCR، بينما سيظل methylated cytosine كما هو cytosine بعد تضخيم PCR. وبعد الحصول على نتيجة التسلسل، قارنها بالقالب المحدد للسلسلة المستخدم في تضخيم PCR.إذا ظهرت بقايا السيتوزين في القالب كـثيمين في نتيجة التسلسل، فإن ذلك يشير إلى أن السيتوزين غير ميثيلي. أما إذا بقيت بقايا السيتوزين في القالب سيتوزين في نتيجة التسلسل، فهذا يعني أن السيتوزين ميثيلي. وتوضح النتائج حالة الميثيلة لأليل MEA الأموي في منطقة 500 زوج قاعدي سالبة من محفز MEA لخمسة مواقع CpG ميثيلية في النسائل المتسلسلة من تهجين Columbia, g Clarus مع endosperm RLD، حيث يُشار إلى السيتوزينات الميثيلية بدوائر سوداء ممتلئة والسيتوزينات غير الميثيلية بدوائر بيضاء فارغة. وبالمثل، تظهر حالة الميثيلة لأليل Madea الأموي من تهجين Columbia, Gladys مع embryo RLD.لقد عرضنا لكم للتو كيفية عزل السويداء وإجراء التسلسل باستخدام السلفيت عند تطبيق هذا الإجراء. ومن المهم تذكر اتباع البروتوكول بشكل صحيح. هذا كل شيء.شكراً للمشاهدة، وتمنياتنا لكم بالتوفيق في تجاربكم.

determination-dna-methylation-imprinted-genes-arabidopsis

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

ويرد تبسيط العمل لدراسة الحامض النووي والتغيرات في التعبير الجيني في وقت مبكر على الحياة التوتر. بدءا من فصل الأمهات من الفئران حديثي الولادة والعزلة من أنسجة المخ المنفصلة، ​​التي نمثلها بروتوكول لعزل في وقت واحد DNA و RNA من اللكمات أنسجة المخ لتسلسل بيسلفيت اللاحقة وتحليل RT-PCR.

الأمثل تحليل الحامض النووي والتعبير الجيني من المناطق، الصغيرة تشريحيا المعرفة من الدماغ

ونحن التقرير وسيلة فعالة وبسيطة لعزل الأجنة في المراحل الأولى من التطوير...

العزلة الفعالة والسريعة من الأجنة المبكرة مرحلة من<em&gt; thaliana نبات الأرابيدوبسيس</em&gt; بذور

نقدم الإجراء لتجميع البذور الفراش معطف مقايسة (SCBA) من بذور نبات الأرابيدوبسيس thaliana. وقد أظهرت SCBA أن تكون أداة قوية لاستكشاف وراثيا في المختبر وكيفية إنبات البذور الضوابط السويداء في البذور نائمة واستجابة لمنبهات الضوء. وSCBA هو من حيث المبدأ المعمول بها تحت أي الحالة التي يشتبه السويداء على التأثير في النمو الجنيني.

معطفا البذور الفراش الفحص لاستكشاف وراثيا<em&gt; في المختبر</em&gt; كيف إنبات البذور في الضوابط السويداء<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس thaliana</em

نحن نقدم هنا بروتوكول فعالة وموثوق بها لالمناعية، مضان التهجين في الموقع، وتلطيخ DNA تليها الكمية، التصوير ذات الدقة العالية في نبات الأرابيدوبسيس البويضات thaliana كله جبل. وقد استخدم هذا الأسلوب بنجاح لتحليل التعديلات لونين والهندسة المعمارية النووية.

وسيلة فعالة للالكمي، التحليل خلية واحدة من لونين تعديل والعمارة النووية في جبل لالجامع بويضات في<em&gt; نبات الأرابيدوبسيس</em

مناعي لونين هي تقنية قوية لتحديد المواقع DNA من البروتينات في الجسم الحي نبات الأرابيدوبسيس ملزمة. ويشمل هذا الإجراء لونين عبر ربط والتشرذم، مناعي مع الأجسام المضادة انتقائية ضد البروتين من الفائدة، وتحليل QPCR من الحمض النووي ملزمة. نحن تصف مقايسة الشذرة بسيط الأمثل لمحطات نبات الأرابيدوبسيس.

مناعي لونين الفحص لتحديد نبات الأرابيدوبسيس التفاعلات-DNA البروتين<em&gt; في فيفو</em

ويحدد هذا البروتوكول وسيلة لمراقبة امبريوجينيسيس في نبات عن طريق إزالة ovule متبوعاً بالتفتيش على تشكيل نمط الجنين تحت مجهر.

أسلوب لوصف امبريوجينيسيس في نبات

المكتشفة حديثا المؤكسد أشكال 5-ميثيلسيتوسيني (أوكسي-mCs)، 5-هيدروكسيميثيلسيتوسيني (5hmC)، 5-فورميلسيتوسيني (إف سي 5) و 5-كاربوكسيلسيتوسيني (5caC) قد تمثل تعديلات الحمض النووي متميزة مع أدوار وظيفية فريدة من نوعها. هنا هو وصف سير عمل شبه كمي للتصور oxi-الإشراف على التوزيع المكاني والتنميط كثافة إشارة كولوكاليزيشن.

إيمونوستينينج لإدخال تعديلات على الحمض النووي: التحليل الحسابي للصور [كنفوكل]

ميثيل الحمض النووي الريبي ميثيل المناعة المقايسة هو طريقة تعتمد على الأجسام المضادة المستخدمة لإثراء لشظايا الحمض النووي الريبي الميثيل. إلى جانب التسلسل العميق ، فإنه يؤدي إلى تحديد النصوص التي تحمل تعديل M5C.

ميثيل الحمض النووي الريبي الفحص المناعي لدراسة m5C التعديل في arabidopsis

تصف هذه الدراسة سير العمل لإدارة بيانات مثيلة الحمض النووي التي تم الحصول عليها بواسطة تقنيات microarray . يوضح البروتوكول الخطوات من إعداد العينات إلى تحليل البيانات. يتم وصف جميع الإجراءات بالتفصيل ، ويعرض الفيديو الخطوات المهمة.

إعداد عينة لتحليل المعلوماتية الحيوية لمثيلة الحمض النووي: استراتيجية جمعية السمنة ودراسات السمات ذات الصلة

يصف هذا البروتوكول تحضير عينات سليمة من طبقة خلايا السويداء في بذور نبات الأرابيدوبسيس ثاليانا . لا تتطلب هذه الطريقة سوى معدات مختبرية شائعة ، مثل إبرة الحقن والملقط الدقيق ، وتتيح تصوير الخلايا الحية الفلورية عالية الدقة لخلايا السويداء في كل من البذور النامية والناضجة.

تحضير الأنسجة السليمة للتحليل المجهري لطبقة خلايا السويداء في بذور نبات الأرابيدوبسيس النامية والناضجة

اكتشف كيفية تحديد حالة مثيلة الحمض النووي للجينات المطبوعة في السويداء باستخدام Arabidopsis. يوضح هذا البروتوكول عزل السويداء وتحليل المثيلة بتسلسل البيسلفيت لفهم آليات الطبع الوراثي في النباتات.

تقرير من الحامض النووي من الجينات في مطبوع Arabidopsis السويداء

استكشف المزيد من الفيديوهات