رصد خلايا المناعة الاتجار نيون بريون قضبان وبعد ساعات من العدوى داخل الصفاق

الهدف الأساسي من هذا الإجراء هو مراقبة امتصاص البريونات وانتقالها بواسطة الخلايا المناعية خلال ساعات من العدوى. للبدء، يتم تنقية وعمل وسم فلوري لقضبان البريون المتكتلة من دماغ مصاب، ثم يتم حقن قضبان البريون هذه في التجويف البريتوني للفئران. وبعد مرور ساعتين، تُجمع الخلايا من البريتون والطحال وأيضاً من العقد اللمفاوية المنصفية والمساريقية. وأخيراً، تُصبغ الخلايا المستخلصة بعلامات نمطية مناعية وتُحلل للتحقق من احتجاز البريونات.

على سبيل المثال، يمكن استخدام نتائج قياس التدفق الخلوي لإظهار أن قضبان البريون يتم الاحتفاظ بها ونقلها بشكل أساسي بواسطة الخلايا البلعمية والخلايا التغصنية، وبشكل ثانوي بواسطة الخلايا الوحيدة، وبشكل ثالث بواسطة الخلايا البائية. لقد صُمم هذا النظام التجريبي لتسليط الضوء على مستودعات البريون والأهداف العلاجية المحتملة من خلال الإجابة على أسئلة رئيسية مثل: ما هي الخلايا التي تلتقط PreOn مباشرة بعد العدوى؟ وإلى أين تنقلها؟ وما مدى سرعة وصولها إلى هناك؟

ستقوم كريستال، م.ت. وبرادي مايكل، طلاب الدراسات العليا في مختبري، بشرح هذا الإجراء من أجل جمع بروتينات PreOn. يتم تجنيس 100 milligrams من أنسجة الدماغ المصابة بـ PreOn في 900 milliliters من محلول التجنیس المنظم المبرد بالثلج لمدة دقيقة واحدة بأقصى سرعة في خلاط تجاري، ثم يوضع فوراً على الثلج لمدة دقيقتين. تكرر هذه العملية ثلاث مرات لزيادة حصيلة البروتين.

قم بطرد المتجانس مركزياً لمدة 10 دقائق عند 3000 Gs ودرجة حرارة أربع درجات Celsius. قم بإزالة السائل الطافي وحفظه على الثلج. أعد تعليق الراسب في لتر واحد من hp وكرر خطوات التجانس والطرد المركزي.

الآن، قم بتجميع الرواسب وجهاز الطرد المركزي لمدة 60 minutes عند 100,000 GS ودرجة حرارة 0 °C. تخلص من الطافي. ثم أعد تعليق الراسب في 100 milliliters من TBST.

قدّر تركيز البروتين باستخدام مقايسة برادفورد (Bradford Assay) واضبط الحجم ليكون خمسة مليغرام لكل مليليتر من البروتين في محلول TBST. برد العينة على الثلج لمدة 30 دقيقة. ثم قم بالطرد المركزي مرة أخرى لمدة 30 دقيقة عند 100,000 GS في درجة حرارة صفر درجة مئوية.

تخلص من الـ SNA واغسل الراسب أولاً بـ 50 milliliters من TBST. ثم قم بإعادة تعليق الراسب الناتج في 100 milliliters من 1X PBS يحتوي على 1% sarcas seal ومزيج مثبطات البروتياز (proteus inhibitor cocktail) مع التقليب لمدة 120 دقيقة عند 37 degrees Celsius. ولإجراء تدرج السكروز، ضع العينة فوق 900 milliliters من 320 millimolar سكروز ثم قم بالطرد المركزي لمدة 60 دقيقة.

عند 100,000 ×g ودرجة حرارة 10 °C. تخلص من السائل الطافي وأعد تعليق الراسب في 10 milliliters من كلوريد الصوديوم بتركيز 2.3 molar و5% Sarco seal. الآن، قم بمعالجة العينة بالموجات فوق الصوتية خمس مرات لمدة 40 seconds وبقدرة قصوى تبلغ 70% على فترات زمنية مدتها دقيقة واحدة.

قم بتوزيع 1 mL من العينة في أنابيب إبندورف، ثم استخدم جهاز الطرد المركزي لمدة 15 دقيقة عند 13,000 ×g ودرجة حرارة 4 °C. اغسل الرواسب مرتين باستخدام TBS، واحفظ المخزونات عند -70 °C. قم بدمج أنبوب واحد من قضبان PreOn المنقاة باستخدام عبوة واحدة من الفلوروكروم DITE 649 وفقاً لبروتوكول الشركة المصنعة.

أخيراً، استبدل محلول صبغ الـ dite بمحلول PBS عن طريق الطرد المركزي عبر أعمدة الترشيح. تُحفظ في حصص حجم كل منها 20 µL عند درجة حرارة -70 °C بعيداً عن الضوء حتى وقت الاستخدام. يشمل هذا القسم الحقن داخل الصفاق، وتلقيح البريون، واستعادة الخلايا من الصفاق، والعقد الليمفاوية المنصفية والمساريقية، والطحال مباشرة قبل استخدام البريون الفلوري ذو الحلقة D.

أمسك الفئران من 1 إلى 50 في محلول PBS من خلال شد فرو الرقبة الظهري باستخدام الإبهام والسبابة. أدر الفأر برفق ليكون مواجهاً لك، وثبت الذيل بإصبع الخنصر. ضع الفأر في وضعية الاستلقاء (supinate)، مع رفع الجذع الخلفي فوق الرأس وإمساكه بحيث يكون مقلوباً قليلاً.

باستخدام محقنة إنسولين عيار 30، احقن 100 µL من قضبان pion الفلورية، على بُعد سنتيمتر واحد جانبيًا من الخط الناصف ومن سنتيمتر إلى سنتيمترين أماميًا من المفصل الحرقفي العجزي. أدخل الإبرة لمسافة سنتيمتر واحد عبر الجلد بزاوية 45 درجة باتجاه الإنسي. بالنسبة لفئران التحكم، استخدم تخفيفًا بنسبة 1:50 من الخرزات الفلورية أو محلول PBS وحده. ووفقًا للتصميم التجريبي، اترك الفئران لفترة الحضانة المحددة لبدء التحليلات.

يتم القتل الرحيم للفئران وفقاً لبروتوكولات لجنة رعاية واستخدام الحيوان المعتمدة. يتم حقن 10 milliliters من PBS في التجويف البريتوني باستخدام سرنجة سعة 12 milliliter وإبرة قياس 25 gauge. يتم تحريك الفأر بلطف بشكل طولي لمدة دقيقة واحدة للمتابعة في عملية تشريح الفأر.

بلل الجانب البطني من فراء الفأر جيداً باستخدام 70%ethanol. ارفع الجلد عند الخط الناصف أسفل القفص الصدري مباشرة باستخدام الملقط، وقم بعمل شق صغير في الجلد باستخدام المقص. ثم قم بإجراء شق في الجلد بطول ثلاثة إلى خمسة سنتيمترات في كلا الاتجاهين نحو الرأس والذيل.

أجرِ شقين بطول سنتيمترين من الخط الناصف باتجاه الجانبين من كل طرف، ثم قم بإزاحة الجلد وتثبيته بالدبابيس للكشف عن التجويفين البريتوني والصدري. استخلص معلق الخلايا من البريتون باستخدام المحقنة ذاتها وإبرة عيار 16. ضع النضحة في أنبوب مخروطي سعة 15 milliliter واحفظها على الثلج.

اقطع بعناية الغشاء الرقيق الشفاف المحيط بالبريتون، ثم أزِح الصدر للكشف عن المنصف. حدد الآن من عقدتين إلى أربع عقد ليمفاوية منصفية وقم بإزالتها، والتي تقع ظهرياً وجانبياً قليلاً ومجاورة للغدة الزعترية، ومجاورة إنسياً للشريان الرأسي العضدي بالقرب من الجانب البطني للقصبة الهوائية. بعد ذلك، حدد ما يصل إلى ست عقد ليمفاوية مساريقية مدمجة في النسيج المساريقي الأبيض الرخو الذي يثبت الأمعاء بالجدار البطني الخلفي وقم بإزالتها.

احفظ العقد اللمفاوية في ملليلتر واحد من وسط PMI 1640 على الثلج حتى اكتمال التشريح. وأخيراً، حدد موقع الطحال واستخرجه؛ وهو عضو طويل أحمر داكن يقع جانبيًا بالنسبة لخط المنتصف وظهريًا بالنسبة للأمعاء في الجانب الأيسر من الفأر.

باستخدام مكبس حقنة سعة 1 مل، قم بهرس وضغط العقد اللمفاوية عبر مصفاة شبكية بمسام 40 ميكرون في 3 مل من PBS داخل طبق بتري بلاستيكي. اشطف المصفاة بـ 2 مل إضافية من PBS، ثم انقل معلق الخلايا الكلي البالغ 5 مل إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مل. كذلك، اشطف طبق بتري بـ 5 مل إضافية من PBS وانقلها إلى الأنبوب نفسه.

قم بطرد العينة مركزياً لمدة خمس دقائق عند 250 gs. تخلص من الراشح وأعد تعليق الكتلة الخلوية. انقل الخلايا المعزولة في 1 مل من fax buffer إلى أنبوب EOR سعة 1.5 مل.

عادةً ما يمكن استخدام بروتوكول الصبغ هذا لتحديد المجموعات الفرعية للخلايا المناعية، وذلك باستخدام أجسام مضادة فلورية ضد علامات سطح الخلايا المناعية المعروفة جيداً لدمج جميع الأجسام المضادة في محلول تنظيم الفاكس (fax buffer). قبل الاستخدام مباشرة، يتم عد الخلايا وتوزيع 10⁶ من الخلايا في أنابيب إبندورف (einor tubes)، ثم تجميع الخلايا عن طريق الطرد المركزي وغسل الراسب مرتين باستخدام 1 مل من محلول تنظيم الفاكس لحظر مستقبلات FC الداخلية.

قم بتحضين الخلايا في 100 µL من 2 ng/mL من rat anti-US CD 1632 لمدة 20 دقيقة على الثلج، ثم قم بترسيب الخلايا وغسلها باستخدام fax buffer. بعد ذلك، أضف 100 µL من 1 ng/mL من الأجسام المضادة الفلورية المناسبة أو مجموعة من الأجسام المضادة إلى كل عينة وقم بتحضينها على الثلج لمدة ساعة واحدة، مع إضافة 100 µL من fax buffer وحده إلى الخلايا الضابطة، ثم قم بترسيب الخلايا وغسلها مرتين باستخدام fax buffer.

أعد تعليق الخلايا في 1 mL من محلول act buffer، واتركها في الحضانة على الثلج لمدة دقيقة واحدة. ولتحليل كريات الدم الحمراء، قم بترسيب الخلايا وغسلها باستخدام محلول fax buffer، ثم أعد تعليق الخلايا في 1 mL من محلول fax buffer. قم بتحليل العينات باستخدام جهاز قياس التدفق الخلوي (flow cytometer)، والذي يحتوي عادةً على ليزرات إثارة بأطوال موجية 405 و488 و633 nm، ومن 5 إلى 10 كواشف للانبعاث الفلوري.

يُعد متجانس الدماغ المصاب ببريونات خام غنياً جداً بالبريونات. تتضمن عملية التنقية استخدام المنظفات، والإذابة، والطرد المركزي الفائق لمتجانس دماغ حيوان الـ E two elk. والمنتج الناتج هو بروتياز.

يُظهر تحليل التدفق الخلوي (fax analysis) المقاوم لـ K لمجموعات خلوية محددة أن الخلايا المقدمة للمستضد تستقر في الصفاق بحلول الساعتين وتستبقي الخرزات الفلورية وعصيات البريون. أظهرت الخلايا المستمدة من الفئران التي تم حقنها بالخرزات والبريونات فلورة ملحوظة، خاصة في الخلايا الوحيدة، والخلايا التغصنية، والبلعميات.

وُجدت أيضًا أحاديات الخلية والخلية التغصنية والبلعميات الحاملة لـ PreOn في العقد اللمفاوية المنصفية. وبعد مرور ساعتين من التلقيح، لم نرصد أي خرزات أو قضبان PreOn في العقد اللمفاوية الفموية أو المساريقية. وفي هذه التجربة، استعرض الفيديو عدة بروتوكولات لتنقية قضبان البريون المتكتلة من الدماغ المصاب لإجراء حقن داخل الصفاق، ولتحديد العقد اللمفاوية وعزلها بشكل صحيح، وأخيرًا لعزل الخلايا المناعية وصبغها.