المقترنة تسجيلات المشبك من تصحيح للسيارات ، والخلايا العصبية في العضلات الهيكلية الهدف اسماك الزرد

الهدف العام من هذا الإجراء هو الحصول على تسجيلات فيزيولوجية كهربائية متزامنة لجهد الفعل في عصبون حركي والاستجابة المشبكية المرتبطة به في العضلة المستهدفة. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق إزالة الجلد من الجانب العلوي للسمكة. وتتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في كشف الحبل الشوكي عن طريق إزالة جميع خلايا العضلات الظهرية التي تعلوه.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في كشف العضلة السريعة المستهدفة عن طريق إزالة الطبقة العليا من العضلة البطيئة. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي تطبيق تثبيت التيار (current clamp) على عصبون الـ coddle الأولي أو عصبون الـ cap، وتطبيق تثبيت الجهد (voltage clamp) على العضلة الهيكلية المستهدفة. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج تظهر الاستجابات المشبكية في العضلة المرتبطة بإطلاق جهود الفعل في العصبون الحركي، وذلك من خلال تثبيت التيار المتزامن للعصبون الحركي وتثبيت الجهد للعضلة المستهدفة.

يوفر نموذج LaVar Super Fish مزيجاً من المزايا التي تسهل تسجيل العصبون الحركي والعضلة الهيكلية المقترنة، حيث يسمح الحجم الصغير للعضلة بإجراء تثبيت جهد فعال، كما تتيح الخصائص النمطية للعصبون الحركي في الغطاء سهولة التعرف عليه والوصول إليه. سأقوم الآن باستعراض الإجراءات المطلوبة لتأسيس تقنية تثبيت الرقعة (patch clamp) لكل من العصبون والعضلة. قبل البدء في الإجراء، قم بتحضير خمسة محلول أساسية، وهي: محلول الحمام، ومحلول الحمام مع Trica، ومحلول الحمام مع IDE، والمحلول الداخلي للعصبون، والمحلول الداخلي للعضلة.

بعد ذلك، اجمع يرقة واحدة من سمك الزيبرا يتراوح عمرها بين 72 إلى 96 ساعة وضعها في محلول الحمام مع الـ trica. في غضون دقيقة واحدة من التعرض للمخدر، لن تستجيب السمكة. وللتحقق من ذلك، ضع السمكة فوق طبق بلاستيكي وقم بفصل الرأس باستخدام شفرة حلاقة مزدوجة الحواف تحت المجهر الستيريو.

انقل السمكة إلى غرفة تسجيل زجاجية مطلية بمادة السارد ومملوءة بمحلول bass. قم بعمل سديلة جلدية بالقرب من الطرف المنخاري للسمكة باستخدام دبوس لتوفير قبضة مناسبة لملقط دقيق. قم بإزالة الجلد العلوي عن طريق الإمساك به بالقرب من الدبوس المنخاري باستخدام ملقط دقيق.

قم بتقشير الجلد ببطء في اتجاه الذيل لإزالته. قم بمعالجة السمكة بـ 3 mL من محلول الحمام الذي يحتوي على form IDE لمدة تتراوح من 3 إلى 5 دقائق لمنع انقباضات العضلات التي قد تتداخل مع التسجيلات. اغسل العينة خمس مرات بمحلول حمام عادي.

قم بإزالة جزء من الطبقة السطحية للعضلات فوق خمسة إلى ستة قطع عضلية عن طريق الكشط برفق باستخدام جانب دبوس من التنجستن. انقُل السمكة إلى مجهر رأسي موجود داخل قفص فاراداي لحجب الضوضاء الكهربائية. المجهر مجهز بمنصة ثابتة ذات مسافة عمل طويلة، وعدسة شيئية 40 x، وتقريب يتراوح من 0.5 إلى 4 x.

يتم تركيب المجهر على منصة إزاحة XY آلية. ومن أجل تحريك العينة بين العصب والعضلة تحت قوة تكبير عالية، يساعد استخدام بصريات تباين التداخل التفاضلي في رؤية العصبونات تحت تكبير 0.5x. استخدم ماصة ذات فتحة واسعة بقطر 15 ميكرون لإزالة العضلات التي تغطي المنطقة وكشف الحبل الشوكي.

يتم تطبيق ضغط سلبي باستخدام سرنجة مخصصة للاستخدام مرة واحدة سعة 3 cc، ويتم إزالة الخلايا العضلية واحدة تلو الأخرى. تُكرر هذه العملية لخمس إلى ست قطع ظهرية من العضلات الهيكلية. وتُستخدم الماصة ذات الفوهة العريضة ذاتها لإزالة الطبقتين العلويتين من العضلات البطنية للحصول على العضلات الهيكلية السريعة المستهدفة.

بهذا تكتمل التحضيرات للتسجيلات المزدوجة، ويتم زيادة تكبير المجهر إلى 1.6 x تقريباً. تُفحص القطع النظيفة لتحديد مواقع العصبونات القبعية. يحتوي كل قطع HEMI من النخاع الشوكي على عصبون حركي قبعي واحد كبير بقطر 10 micron.

تقع هذه الجسيمة التي تتخذ شكل دمعة بشكل سطحي تحت الـ spinal Jira، بالقرب من النهاية الـ coddle للحد القطعي. يتم اختيار عصبون cap للتسجيل، ويُمسح قطاع الـ coddle المرتبط به ومجال العضلات المستهدفة البطني للتحقق من سلامتهما. يتم وضع قطبين كهربائيين للترقيع من أجل التسجيل، أحدهما للعصبون والثاني للعضلة.

يتميز القطب العلوي بميل بسيط لاختراق الجافية الشوكية القوية، وبفتحة طرفية يبلغ قطرها حوالي 2 ميكرون. أما القطب السفلي فله ميل أكثر حدة لتسجيل تثبيت الجهد بمقاومة منخفضة في العضلات الهيكلية. ضع قطب العصبون بزاوية تقارب 30 درجة لاختراق الجافية الشوكية.

على بُعد نصف قطعة تقريبًا في الاتجاه المنقاري من عصبون القبعة المحدد، قم بدفع القطب الكهربائي باستخدام جهاز تحكم في الدفع المحوري مع تطبيق ضغط إيجابي مستمر ولطيف يبلغ حوالي 60 millimeters mercury. وبينما يخترق القطب الكهربائي الأم الجافية، قد يزاح عصبون القبعة بسبب التدفق الناتج عن القطب، مما يتطلب إعادة ضبط التركيز. وعندما يلامس القطب جسم الخلية (SOMA) لعصبون القبعة، يتم تحرير الضغط الإيجابي، وهو ما يؤدي عادةً إلى تكوين فوري لختم جيجا (giga seal).

ومع ذلك، في بعض الحالات التي يفشل فيها تشكيل الختم، يصبح من الضروري تطبيق ضغط سلبي خفيف. وبعد تشكيل الختم، يتم ضبط جهد القطب الكهربائي عند 80- millivolts، ويؤدي تطبيق الضغط السلبي إلى تمزيق الغشاء الخلوي. وتتميز العصبون القبعي بمقاومة دخل تتراوح بين 140 إلى 180 mega ohms وجهد فعل يتجاوز 40+ millivolts.

يتم اختبار ذلك عن طريق حقن خطوات إزالة استقطاب متزايدة تدريجياً تحت وضع تثبيت التيار حتى يتم تحفيز جهد الفعل. بعد ذلك، يتم نقل المجهر إلى العضلة البطنية باستخدام المترجم الآلي XY. وتحت قوة تكبير عالية، يتم اختيار خلية عضلية سريعة من الحقل المستهدف.

يتم دفع قطب العضلة نحو خلية العضلة المستهدفة تحت ضغط إيجابي، والذي يؤدي عند تحريره إلى تكوين ختم جيجا (giga seal)، ثم يتم ضبط جهد القطب إلى -50 millivolts لتعطيل قنوات الصوديوم. وتحت شفط خفيف، يتم تمزيق غشاء الخلية. ويشير انخفاض المقاومة إلى 100 to 200 mega ohms والظهور المفاجئ لإشارة عابرة سعوية كبيرة إلى نجاح الدخول واختبار الزوج.

يتم تسجيل العصبون الحركي وهو يزول استقطابه من خلال حقن تيارات كهربائية تزداد تدريجياً حتى يتم تحفيز جهد فعل. عند هذه النقطة، يجب أن يظهر تيار الصفيحة النهائية في العضلة؛ ويؤدي الاستمرار في تحفيز العصبون الحركي بتردد 1 hertz إلى ظهور تيارات الصفيحة النهائية دون أي فشل. ومع زيادة تردد التحفيز إلى 100 hertz، تتقلب سعة تيارات الصفيحة النهائية وتتعرض لنضوب وظيفي خلال 10 seconds من التحفيز.

عادةً ما يكون تسجيل العصبون مستقراً لمدة تصل إلى ساعة واحدة، ولكن الخلايا العضلية تتدهور وهو ما يظهر في صورة زيادة في المقاومة التسلسلية. وعند حدوث ذلك، يتم إما إنهاء التجربة أو تثبيت خلية عضلية أخرى باستخدام تقنية تثبيت الرقعة (patch clamp). يجب إتمام جميع التسجيلات في غضون ساعة واحدة.

بمجرد إتقان تسجيل زوج واحد، يمكن إتمام عملية التسجيل في غضون ساعة إلى ساعة ونصف. ومن الممكن أيضاً الحصول على زوج إضافي أو زوجين من القطاعات المجاورة. وينتج عن يوم تسجيل نموذجي ما بين زوجين إلى ثلاثة أزواج.

توفر تسجيلات العصبون الحركي والعضلة الهيكلية المزدوجة فرصة فريدة لاستكشاف الآليات الأساسية للنقل العصبي العضلي. وعند استخدامها بالتزامن مع سلالات الأسماك الطافرة في الحركة (Motility mutant fish lines)، يمكنها تحديد مصدر الخلل الوظيفي العصبي العضلي وتقديم رؤى جديدة حول الآليات الكامنة وراء الأمراض البشرية مثل متلازمة النقائل.