الببتيدات من مكتبة عرض بالعاثية تعدل التعبير الجيني في خلايا اللحمة المتوسطة وتحفيز تكون العظم في عيوب العظام Unicortical

الهدف العام من هذه التجربة هو تحديد التسلسلات التي تزيد من قدرة الخلايا الميزنكيمية على التمايز وتعزز ترميم العظام. تتمثل الخطوة الأولية في عزل العاثيات (phage) التي ترتبط بالعظم عن طريق تقنية الفرز الحيوي (biopanning). بعد ذلك، يتم تحديد تسلسلات الببتيد التي ترتبط بالخلايا الميزنكيمية، وتحديد التغيرات اللاحقة في التعبير الجيني.

إجراء التجارب لتحديد كيفية إيصال تسلسلات الببتيد إلى العظام لأغراض تجديدية. وكخطوة نهائية، يتم فحص ترميم العظام نسيجياً؛ حيث يمكن أن تقدم النتائج مجتمعة رؤى مهمة حول آليات تمايز الخلايا في المختبر (in vitro) وترميم العظام في الجسم الحي (in vivo). وتكمن مزايا استخدام تقنية biopanning مع مكتبة عرض الفاج (phage display) في قدرتنا على تحديد ببتيدات تستهدف العظام ويمكن استخدامها لتحفيز تمايز الخلايا الميزنكيمية وتعزيز ترميم العظام.

وفي نهاية المطاف، قد تكون هذه التسلسلات الببتيدية مفيدة في الأنماط العلاجية لترميم العظام وعلاج فقدان الكتلة العظمية مثل نقص تكثف العظام وهشاشة العظام. وبناءً على دراسة أظهر فيها ULA و Pascal أن تقنية biop panning يمكن استخدامها لعزل التسلسلات الببتيدية التي تستهدف الأوعية الدموية، فقد اخترنا تكييف هذه الطريقة لاستقصاء الآليات في العظام. وبالنسبة لإجراء biop panning في الجسم الحي، تم ضخ 10^10 وحدة تشكيل لوحية من مكتبة ببتيدات عرض الفاج N-E-B-P-H-D 12 عبر قلب فأر من سلالة valve C يبلغ من العمر 10 أسابيع.

بعد مرور خمس دقائق تقريبًا، يتم القتل الرحيم للفأر، ثم كشف وتشريح عظام الفخذ، وقطع النهايات وإزالة نخاع العظم. يتم شطف عظمة الفخذ اليسرى من الداخل والخارج باستخدام PBS لـ 10 مرات. بعد ذلك، تُضاف العظمة إلى بكتيريا ER 2 5 3 7.

من أجل إزالة العاثيات غير المرتبطة، استخدم حليباً مجففاً خالياً من الدسم بنسبة 2% في حقنة ذات إبرة قياس 21 غيج لرش القناة المتوسطة في عظم الفخذ الأيمن 10 مرات. الآن قم بشطف العاثيات المرتبطة من القناة المتوسطة باستخدام محلول glycine المنظم بحمض الهيدروكلوريك. pH 2.2 تم تعادله باستخدام one mo la triss.

لتضخيم العاثية، أضف EIT إلى بكتيريا ER 2 5 3 7 وزرعها لمدة 4.5 hours. انقل الرواسب الطافية بعناية إلى أنابيب جديدة، ثم رسب العاثية ثلاث مرات بإضافة polyethylene glycol ومحلول Sodium chloride، ثم حضن الأنابيب طوال الليل عند درجة حرارة four °C.

أخيراً، أعد تعليق الراسب في محلول TBS مع 0.02% Sodium azide. قم بعملية التتريق (plaque) للبكتريوفاج على أطباق لتحديد وحدات تكوين اللويحات (plaque forming units) لـ EITs المُضخمة. كرر إجراء الفرز الحيوي (bio panning) في الجسم الحي لكل من الفاجات التي تم استخلاصها والتي لم يتم استخلاصها أربع مرات.

تضخيم العاثيات المجمعة في مستنبتات بكتيرية. تنقية وتقدير كمية تسلسل DNA، وهو DNA العاثيات النهائي، باستخدام البادئ 98 المرفق مع طقم عرض العاثيات. ومن المهم حساب تكرار تمثيل تسلسل DNA العاثيات.

قم الآن بتصنيع ببتيدات تدمج تتابعًا بذريًا من glycine glycine glycine sine lysine وقم بمضاعفة خلايا D1، وهي سلالة مستنسخة من خلايا النخاع العظمي السدوية متعددة القدرات في الفئران تم تطويرها في مختبرنا، حتى تصل إلى نسبة تلاقي 90%. قم بمعالجة الخلايا بالتربسين ثم استخدم جهاز الطرد المركزي لترسيبها وعدّها من أجل صبغ الببتيد، ثم ازرع الخلايا على شرائح آبار غرفية مطلية بالجيلاتين واستزرعها لمدة 24 ساعة.

اغسل الخلايا بمحلول PBS وثبّتها باستخدام 4% paraldehyde لمدة 30 دقيقة. قم الآن بإجراء عمليات الحضانة للحجب باستخدام glycine، يليه BSA Aden ثم BBSA. محلول حجب البيوتين.

أضف 100 µM من ببتيدات L seven و R one المرتبطة بالبيوتين. ثم قم بغسل الخلايا ثلاث مرات باستخدام PBS لمدة خمس دقائق في كل مرة. أضف تخفيفاً بنسبة 1:1000 من LOR strippin، ثم غطِّ العينات بورق القصدير واحضنها في درج مظلم لمدة 30 دقيقة.

اغسل الخلايا وثبّت الشرائح الغطائية باستخدام وسط التثبيت vector shield. ثم قم بتحليل الشرائح تحت مجهر فلوري قبل 24 ساعة من الجراحة. انقع أسطوانات الإسفنج الجيلي.

انقل أسطوانات الرغوة الهلامية المحتوية على 20 micromolar من الببتيد L seven أو R one أو محلول PBS المنظم الخالي من الببتيد إلى أطباق زراعة معقمة ذات 12 بئراً، وتحفظ مبردة طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C حتى موعد الجراحة. ضع المركب الرغوي الهلامي على الثلج حتى وقت الاستخدام.

باستخدام مثقاب هوائي تحت الري بمحلول ملحي، يتم إحداث عيب عظمي أحادي القشرة، بيضاوي الشكل وكبير الحجم، بعرض 3 mm وطول 8 mm. تُعالج الفجوة العظمية باستخدام رغوات هلامية مُحضرة عن طريق إدخال جميع السقالات المزروعة باستخدام نقر خفيف. يتم القتل الرحيم للجرذان وجمع عظم الظنبوب في نقاط زمنية محددة، مع التحقق بعناية من وجود العيب العظمي، ثم تثبيت عظم الظنبوب المستخلص في محلول فورمالين منظم متعادل بتركيز 10% من أجل التقطيع بالشمع البارافيني.

أخيراً، يتم صبغ جميع مقاطع الأنسجة بصبغة الهيماتوكسيلين والإيوزين لتمييز المصفوفة العظمية. يسمح استخدام الـ Aden المسمى بالفلوريسين إيزوثيوسيانات بالكشف المجهري عن ارتباط الببتيدات بالخلايا التي نمت في المختبر. وهنا، ترتبط الببتيدات بالخلايا الميزانشيمية في المزرعة لتحديد التأثير المكون للعظم للببتيدات على الخلايا.

يمكن معالجة الخلايا الميزانشيمية المستزرعة مخبرياً ببيبتيدات اختبارية لتحديد التغيرات في مورفولوجيا الخلايا. فعلى سبيل المثال، في اليوم الرابع، تبدأ الخلايا في التجمع وتكبر هذه التجمعات مع مرور الوقت لتشكل عقيدات. ومن المثير للاهتمام أن مقطع العظم المصبوغ بـ h و e يظهر تألقاً ذاتياً تحت الأشعة فوق البنفسجية UV.

يُسهّل هذا التباين الأكبر بين الأنسجة العظمية وغير العظمية إجراء تحليلات لقياس كمية العظم في المقاطع المنسوجية لتحديد مدى إصلاح العظام في العيوب التي عولجت باستخدام gelfoam بالإضافة إلى الببتيد. ومقارنةً باستخدام gelfoam وحده هنا، أظهرت العيوب التي مُلئت بـ plus peptide أكبر قدر من إصلاح العظم القشري مع مرور الوقت. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم أن تكون منهجياً للغاية في إدخال البيانات نظراً للعدد الكبير من العينات التي ستتراكم حتماً بمرور الوقت حتى تختار المجموعة النهائية من الببتيدات.

إن تطوير تقنية الغربلة الحيوية داخل الجسم الحي (in vivo biopanning) لتحديد الببتيدات التي تستهدف العظام يعني أن لدينا الآن أدوية محتملة يمكن استخدامها كعلاج لإصلاح العظام وعلاج فقدان العظام. كما أن إحدى الآليات التي يقوم عليها إصلاح العظام تشارك أيضاً في عملية فقدان العظام. إن فهم هذه الآليات بمزيد من التفصيل وامتلاك أدوات يمكن استخدامها لعلاج اضطرابات مثل الكسور المتأخرة وهشاشة العظام سيساعد في تحسين العلاجات التي يمكن ابتكارها في مجال الرعاية الصحية.