نظام الفيروسة الألفاوية Transducing : أدوات لتصور العدوى في البعوض الناقل

فيروسات ألفا هي فيروسات الحمض النووي الريبي التي تنتقل عن طريق البعوض والتي تصيب باستمرار خلايا البعوض الحساسة بأقل قدر من الأمراض الخلوية. يوضح هذا البروتوكول فائدة أنظمة تحويل فيروس ألفا المعدية التي تعبر عن مراسلي الفلورسنت للكشف عن عدوى النواقل وانتقال الفيروسات. قم أولا بإطعام إناث البعوض بوجبة دم تحتوي على فيروس ألفا ذي الأهمية، ثم حدد كفاءة عدوى البعوض، واختر فقط البعوض الذي يعبر عن جين العلامة.

بعد ذلك ، احصد اللعاب من البعوض المصاب وأظهر قابلية الانتقال عن طريق إصابة خلايا البعوض المستزرعة باللعاب الذي تم جمعه. النتائج التي تم الحصول عليها عن طريق المجهر الفلوري epi. تصور تقريرا عن البروتين مثل GFP وبالتالي تتبع عدوى النواقل وانتقال الفيروس في الثمانينيات أو أنواع البعوض في التيسير الكمي.

يمكن استخدام أنظمة التعبير عن فيروس ألفا أو ATSs لتقييم التعبير الجيني والبعوض الناقل بسرعة لكل من دراسات الفيروسات المفصلية وكذلك قبل القيام بعمليات معالجة أكثر صعوبة للبعوض مثل انتقال البعوض. سيظهر هذه الإجراءات الدكتور إيرما سانشيز فارغاس والدكتور إريك موسيل وآرون فيليبس من مختبر الدكتور كين أولسون. من أجل إنتاج فيروس TS في خلايا Bhk 21 ، استخدم فيروس مؤتلف symbis يعبر عن مراسل GFP بعد النسخ في المختبر ، ومعدل كهربائي لنظام تحويل فيروس ألفا الجيني إلى خلايا bhk 21.

ثم أنقذ الفيروس وتضخيمه قبل الإصابة. البعوض الرئيسي لتغذية الدم بكفاءة من وحدة تغذية اصطناعية عن طريق الحرمان من الطعام. قم بإزالة السكر قبل 24 ساعة والماء قبل 12 ساعة من الرضاعة.

الحصول على دم مختلط تم الحصول عليه تجاريا مع مزرعة الخلية المحضرة مشتقة من معلق فيروس TS لعدوى الأمعاء الوسطى الفعالة للبعوض. قم بصياغة 10 إلى سبع وحدات تشكيل اللويحات لكل عيار فيروس مليلتر لوجبة الدم لتحفيز البعوض على الاحتقان. أضف TP إلى التركيز النهائي 0.02 مولار.

ضع غشاء معوي لعلامة المسام فوق فم وحدة التغذية الزجاجية المغلفة بالماء. بعد ذلك ، قم بإعداد المغذيات بماء دائري 37 درجة مئوية. ثم ضع الماصة في الوجبة في الغرفة وضع المغذيات بإحكام على الكرتون.

بعد إطعام البعوض لمدة 10 إلى 30 دقيقة ، قم بفرز البعوض المخدر البارد للعينات المحتقنة بالدم للسماح بتكاثر وانتشار فيروس TS في البعوض المختار. احتضنها عند 28 درجة مئوية و 75٪ رطوبة نسبية لمدة ثمانية إلى 10 أيام. من أجل شل حركة البعوض.

ضع الورق الكرتوني على أربع درجات مئوية لمدة 15 دقيقة تقريبا. الآن ، انقل خمسة إلى 10 بعوض إلى طاولة تبريد مكيفة للاستخدام على مجهر الفلورسنت. فحص وفرز البعوض بناء على وجود أو عدم وجود تألق.

أعد البعوض المختار إلى الكرتون الورقي لاستخدامه حسب الرغبة. في هذه المرحلة ، حدد كفاءة العدوى باستخدام شدة الفلورسنت كوكل. أخيرا ، قم بتشريح الأنسجة مثل الأحشاء الوسطى ، والغدد SIV ، والأجسام الدهنية ، وراقب التألق.

يمكن تشريح هذه الأعضاء والأنسجة في أوقات مبكرة إذا رغبت في ذلك. حرمان البعوض من مصدر السكر لمدة 24 ساعة قبل التغذية. قم بإعداد أنبوب شعري سعة 50 ميكرولتر تم تسخينه وسحبه وقصه بثلاثة إلى خمسة ميكرولترات من كارجيل.

زيت الغمر من النوع B لضمان عدم هروب البعوض. قم بإزالة أرجلهم وأجنحتهم. الآن أدخل الحباب في الأنبوب.

راقب بعناية قطرات اللعاب التي تنضح من البروبوس إلى زيت الغمر. إذا لزم الأمر ، ضع قطرة من 1٪ بيلوكاربين على صدر البعوض لزيادة إفراز اللعاب بعد 60 إلى 90 دقيقة ، وإزالة البعوض وتخزينه لعزل الفيروس في المستقبل. الآن لحصاد المحلول من الأنبوب الشعري ، قم بطرد خليط زيت اللعاب في أنبوب يحتوي على 500 ميكرولتر من 20٪ F-B-S-P-B-S معقم.

قم بتصفية اللقاح من خلال مرشح حقنة 0.2 ميكرون ، ثم استخدم هذا اللقاح لإصابة الخلايا المستنبتة في خلايا البعوض. يتم تقييم فعالية العدوى بخمسة فيروسات DS MRE 16 GFP الأولية عن طريق التعبير عن GFP. بمرور الوقت ، أصيبت هذه الخلايا بالفيروس عند 0.01 تعدد العدوى.

يسمح المجهر الفلوري epi برؤية الجسم بالكامل ل GFP في البعوض المصاب وكذلك في أجزاء الجسم المختلفة هنا بعد 10 أيام من الإصابة. يشير التعبير الانتقائي للأعضاء عن GFP إلى انتشار العدوى. عادة ما يكون لدى الأمعاء الوسطى عدوى بؤر مميزة في وقت مبكر بعد تناول وجبة دم تحتوي على فيروس ينتشر في جميع أنحاء الأمعاء الوسطى الخلفية في أوقات لاحقة بعد الإصابة.

يتم الإشارة إلى هذه الأحداث من قبل مراسلي GFP و DS RED. يشير اختبار الانتقال إلى أن خمسة فيروسات DS MRE 16 GFP رئيسية تعبر بثبات عن GFP طوال فترة الحضانة الخارجية. في البعوض هنا ، يتم اكتشاف GFP ولعاب البعوض في وقت مبكر يصل إلى ثمانية أيام بعد الإصابة.

بعد مشاهدة هذا الفيديو ، يجب أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إصابة فيروس A TS عن طريق الفم إلى البعوض ، وكيفية تقييم العدوى الفيروسية بصريا في البعوض ، وكيفية تقييم انتقال الفيروس من البعوض.