Name: نظام الفيروسة الألفاوية Transducing : أدوات لتصور العدوى في البعوض الناقل (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-11-24T16:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 12 s
Description: اكتشف استخدام نظام الفيروس الألفا الناقل للتعبير عن البروتينات الفلورية في البعوض البالغ. تتيح هذه الطريقة تتبع العدوى وانتقال الفيروس بكفاءة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

ويؤيد هذا العمل من قبل المعاهد الوطنية للصحة (NIH R01 AI46435) وRMRCE (NIH AI065357).

<ol><li>Brault, A. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infection+patterns+of+o%27nyong+nyong+virus+in+the+malaria-transmitting+mosquito+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Infection patterns of o'nyong nyong virus in the malaria-transmitting mosquito Anopheles gambiae.</a> Insect Mol. Biol. 13, 625-625 (2004).</li>
<li>Campbell, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Aedes+aegypti+uses+RNA+interference+in+defense+against+Sindbis+virus+infection%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Aedes aegypti uses RNA interference in defense against Sindbis virus infection.</a> BMC. Microbiol. 8, 47-47 (2008).</li>
<li>Cirimotich, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Suppression+of+RNA+interference+increases+alphavirus+replication+and+virus-associated+mortality+in+Aedes+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22BMC.+Microbiol%22%5BJournal%5D)">Suppression of RNA interference increases alphavirus replication and virus-associated mortality in Aedes aegypti mosquitoes.</a> BMC. Microbiol. 9, 49-49 (2009).</li>
<li>Capurro, deL. ara, M, <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Virus-expressed%2C+recombinant+single-chain+antibody+blocks+sporozoite+infection+of+salivary+glands+in+Plasmodium+gallinaceum-infected+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Am.+J.+Trop.+Med.+Hyg%22%5BJournal%5D)">Virus-expressed, recombinant single-chain antibody blocks sporozoite infection of salivary glands in Plasmodium gallinaceum-infected Aedes aegypti.</a> Am. J. Trop. Med. Hyg. 62, 427-427 (2000).</li>
<li>Foy, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+new+Sindbis+virus+transducing+system+and+its+characterization+in+three+Culicine+mosquitoes+and+two+lepidopteran+species%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of a new Sindbis virus transducing system and its characterization in three Culicine mosquitoes and two lepidopteran species.</a> Insect Mol. Biol. 13, 89-89 (2004).</li>
<li>Foy, B. D., Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alphavirus+transducing+systems%5BTitle%5D)+AND+%22Adv.+Exp.+Med.+Biol%22%5BJournal%5D)">Alphavirus transducing systems.</a> Adv. Exp. Med. Biol. 627, 19-19 (2008).</li>
<li>Franz, A. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Engineering+RNA+interference-based+resistance+to+dengue+virus+type+2+in+genetically+modified+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Engineering RNA interference-based resistance to dengue virus type 2 in genetically modified Aedes aegypti.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103, 4198-4198 (2006).</li>
<li>Hahn, C. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Infectious+Sindbis+virus+transient+expression+vectors+for+studying+antigen+processing+and+presentation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Infectious Sindbis virus transient expression vectors for studying antigen processing and presentation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 89, 2679-2679 (1992).</li>
<li>Keene, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+acts+as+a+natural+antiviral+response+to+O%27nyong-nyong+virus+%28Alphavirus%3B+Togaviridae%29+infection+of+Anopheles+gambiae%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">RNA interference acts as a natural antiviral response to O'nyong-nyong virus (Alphavirus; Togaviridae) infection of Anopheles gambiae.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 101, 17240-17240 (2004).</li>
<li>Lundstrom, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Expression+of+mammalian+membrane+proteins+in+mammalian+cells+using+Semliki+Forest+virus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Expression of mammalian membrane proteins in mammalian cells using Semliki Forest virus vectors.</a> Methods Mol. Biol. 601, 149-149 (2010).</li>
<li>Myles, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Alphavirus-derived+small+RNAs+modulate+pathogenesis+in+disease+vector+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Alphavirus-derived small RNAs modulate pathogenesis in disease vector mosquitoes.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 105, 19938-19938 (1993).</li>
<li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genetically+engineered+resistance+to+dengue-2+virus+transmission+in+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Genetically engineered resistance to dengue-2 virus transmission in mosquitoes.</a> Science. 272, 884-884 (1996).</li>
<li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+expression+of+chloramphenicol+acetyltransferase+in+Aedes+albopictus+%28C6%2F36%29+cells+and+Aedes+triseriatus+mosquitoes+using+a+double+subgenomic+recombinant+Sindbis+virus%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">The expression of chloramphenicol acetyltransferase in Aedes albopictus (C6/36) cells and Aedes triseriatus mosquitoes using a double subgenomic recombinant Sindbis virus.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 24, 39-39 (1994).</li>
<li>Olson, K. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+Sindbis+virus+expression+system+that+efficiently+expresses+green+fluorescent+protein+in+midguts+of+Aedes+aegypti+following+per+os+infection%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of a Sindbis virus expression system that efficiently expresses green fluorescent protein in midguts of Aedes aegypti following per os infection.</a> Insect Mol. Biol. 9, 57-57 (2000).</li>
<li>Parikh, G. R., Oliver, J. D., Bartholomay, L. C., C, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+haemocyte+tropism+for+an+arbovirus%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">A haemocyte tropism for an arbovirus.</a> J. Gen. Virol. 90, 292-292 (2009).</li>
<li>Pierro, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+an+orally+infectious+Sindbis+virus+transducing+system+that+efficiently+disseminates+and+expresses+green+fluorescent+protein+in+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development of an orally infectious Sindbis virus transducing system that efficiently disseminates and expresses green fluorescent protein in Aedes aegypti.</a> Insect Mol. Biol. 12, 107-107 (2003).</li>
<li>Rutledge, L. C. W. ard, A, R., Gould, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Studies+on+the+feeding+response+of+mosquitoes+to+nutritive+solutions+in+a+new+membrane+feeder%5BTitle%5D)+AND+%22Mosq.+News%22%5BJournal%5D)">Studies on the feeding response of mosquitoes to nutritive solutions in a new membrane feeder.</a> Mosq. News. 24, 407-407 (1964).</li>
<li>Sanders, H. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sindbis+virus+induces+transport+processes+and+alters+expression+of+innate+immunity+pathway+genes+in+the+midgut+of+the+disease+vector+Aedes+aegypti%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Sindbis virus induces transport processes and alters expression of innate immunity pathway genes in the midgut of the disease vector Aedes aegypti.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1293-1293 (2005).</li>
<li>Uhlirova, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Use+of+Sindbis+virus-mediated+RNA+interference+to+demonstrate+a+conserved+role+of+Broad-Complex+in+insect+metamorphosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Use of Sindbis virus-mediated RNA interference to demonstrate a conserved role of Broad-Complex in insect metamorphosis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 100, 15607-15607 (2003).</li>
<li>Vanlandingham, D. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+and+characterization+of+a+double+subgenomic+chikungunya+virus+infectious+clone+to+express+heterologous+genes+in+Aedes+aegypti+mosquitoes%5BTitle%5D)+AND+%22Insect+Biochem.+Mol.+Biol%22%5BJournal%5D)">Development and characterization of a double subgenomic chikungunya virus infectious clone to express heterologous genes in Aedes aegypti mosquitoes.</a> Insect Biochem. Mol. Biol. 35, 1162-1162 (2005).</li>
<li>Wang, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+inducing+or+inhibiting+apoptosis+on+Sindbis+virus+replication+in+mosquito+cells%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Gen.+Virol%22%5BJournal%5D)">Effects of inducing or inhibiting apoptosis on Sindbis virus replication in mosquito cells.</a> J. Gen. Virol. 89, 2651-2651 (2008).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

قدم هنا طرق تمكين الباحثين من متابعة إصابة الألفاوية في الثقافة خلية البعوض والحشرات البالغات. وفيما يلي موجز لمزايا ومساوئ استخدام الفيروسات المنشطات في الجدول 2. يمكن أن يكون استنساخ ATS المعدية التلاعب وراثيا للتعبير عن أي الحكومة الإسرائيلية والتي استخدمت للتعبير عن الأضداد سلسلة واحدة ، من المكثفات رني ، الرناوات العقاقير استهداف الجينات الذاتية ، والبروتينات الموالية لأفكارك. إذا لم يتم استخدام مراسلة ، ثم جزء من التصوير هذه الطريقة ليست ذات الصلة. ومع ذلك ، فإن العديد من البروتوكولات ذاتها ضرورية لانقاذ فيروس المنشطات ، ونشر ، والعدوى من البعوض. هناك قيود في حجم القصوى من التحوير عند إدراجها في نظام الألفاوية transducing. المعوقات تختلف تبعا لحجم السلالة الأبوية المستخدمة لتوليد المنشطات ، ولكن عادة ما تكون حول 1KB على الرغم من استخدام الجينات أكبر مراسل luciferase مثل يراعة في بناء المنشطات لاستخدامها في البعوض. وينبغي أن مختبرات الأبحاث مع مبلغ متواضع من الفيروسات الخلفية تكون قادرة على استخدام المنشطات عقب هذه البروتوكولات. وقد قام عدد من المختبرات البحثية بالفعل باستخدام SINV القائم على المنشطات و.

<table><tbody><tr><td>طقم QIAprep Spin Miniprep</td><td>Qiagen</td><td>27104</td><td></td></tr><tr><td>طقم MAXIscript</td><td>Ambion</td><td>AB1312</td><td>تأكد من استخدام طقم يحتوي على البوليميراز المناسب للبنية الجزيئية المستخدمة.</td></tr><tr><td>نظير القبعة (m&lt;sup&gt;7&lt;/sup&gt;G(5&amp;rsquo;)ppp(5&amp;rsquo;)G))</td><td>Ambion</td><td>AM8050</td><td></td></tr><tr><td>حاقن النانولتر Nanoject II</td><td>Drummond Scientific</td><td>3-000-204</td><td></td></tr><tr><td>جهاز التحكم في الخلايا الكهربائي Electro Cell Manipulator</td><td>Harvard Apparatus</td><td>ECM 630</td><td></td></tr></tbody></table>

نظام الفيروسة الألفاوية transducing : أدوات لتصور العدوى في البعوض الناقل

Alphavirus Transducing System:  Tools for Visualizing Infection in Mosquito Vectors

الفيروسة الألفاوية نظم transducing (ATSs) هي أدوات مهمة للتعبير عن الجينات في المصالح (الحكومة الإسرائيلية) خلال العدوى. وتستمد من استنساخ [كدنا] ATSs من الفيروسات التي تنتقل عن طريق البعوض الحمض النووي الريبي (جنس الفيروسة الألفاوية ؛ عائلة الفيروسات الطخائية). جنس الفيروسة الألفاوية يحتوي على حوالي 30 نوعا مختلفا فيروس ينقله البعوض. Alphaviruses هي فيروسات يلفها واحدة تحتوي على الحمض النووي الريبي الجينوم الذين تقطعت بهم السبل (~ 11.7 كيلو بايت). Alphaviruses تدوين a مرنا subgenomic التي بترميز البروتينات الهيكلية للفيروس اللازمة لEncapsidation للجينوم ونضوج الفيروس. وعادة ما تكون Alphaviruses lytic عالية في خلايا الفقاريات ، ولكن بإصرار تصيب الخلايا البعوض عرضة الباثولوجيا الخلوية مع الحد الأدنى. هذه الصفات تجعلها أدوات ممتازة للتعبير الجينات في البعوض الناقل. تستمد ATSs الأكثر شيوعا في الاستخدام من فيروس سندبيس (SINV). واسعة من الأنواع tropism SINV يسمح للعدوى من cells8 الحشرات ، والطيور ، والثدييات. ومع ذلك ، فقد استمدت من ATSs alphaviruses 9،10،20 الأخرى أيضا. يرصد الأجنبية التعبير الجيني ممكن عن طريق إدخال إضافي موقع subgenomic الفيروسي RNA أو الشروع المروج. يستخدم ATSs التي يتم وضع تسلسل الجينات الخارجية 5 &#39;إلى الجينات الهيكلية للتعبير البروتين الفيروسي مستقرة في الحشرات. يستخدم ATSs ، الذي يتوضع على تسلسل الجين 3 &#39;إلى الجينات الهيكلية ، لتحريك ورني الصمت تعبيرا عن هذا الجين في الحشرات. وقد أثبتت ATSs إلى أن تكون أدوات قيمة لفهم التفاعلات ناقلات الممرض ، وتفاصيل الجزيئي للتكاثر الفيروس ودورات الصيانة 3،4،11،19،21 المعدية. على وجه الخصوص ، وقد تم التعبير عن صحفيين الفلورسنت وbioluminescent مفيدة تتبع عدوى فيروسية في انتقال الفيروس وناقلات 5،14-16،18. بالإضافة إلى ذلك ، فقد وصفت الاستجابة المناعية باستخدام ناقلات سلالتين من SINV هندسيا للتعبير عن 2،9 GFP. هنا ، فإننا نقدم وسيلة لإنتاج SINV تحتوي مراسل فلوري (GFP) من استنساخ [كدنا] المعدية. هو كتب المعدية ، وكامل طول الحمض النووي الريبي من استنساخ [كدنا] الخطي. هو عرض المعدية RNA في الخلايا المستهدفة المتساهلة التي electroporation. خلايا Transfected توليد جزيئات الفيروس المعدية معربا عن الحكومة العراقية. ويستخدم الفيروس ليصيب البعوض تحصد ، كما هو موضح هنا ، أو الأنواع المضيفة الأخرى (لا يظهر هنا). ويتم تقييم الكفاءة عن طريق الكشف عن ناقلات مضان خارج المعى المتوسط ​​أو عن طريق انتقال الفيروس رصد 7. استخدام مراسل الفلورسنت كما يسمح للحكومة العراقية لتقدير ملاءمة لانتشار الفيروس في جميع أنحاء ثقافة الخلية ، لتحديد معدل نشر ، والعدوى في البعوض المكشوفة ، وانتقال الفيروس من البعوض ، ويوفر مقياسا السريع المتجه من الكفاءة.

ووصف الطرق لاستخدام نظم الفيروسة الألفاوية transducing صحفيين للتعبير عن فلوري في التجارب المختبرية والبعوض البالغ. ويمكن تكييف هذه التقنية للتعبير عن أي مصلحة من البروتين بدلا من أو بالإضافة إلى أحد الصحفيين.

نظام الفيروسة الألفاوية Transducing : أدوات لتصور العدوى في البعوض الناقل

تُعد أنظمة نقل الفيروسات الأبفاوية (Alphavirus transducing systems - ATSs) أدوات هامة للتعبير عن الجينات المستهدفة (GOI) أثناء العدوى. وتُشتق أنظمة ATSs من مستنسخات الحمض النووي المتمم (cDNA) لـ...

تُعد الفيروسات ألفا (Alpha viruses) فيروسات RNA ينقلها البعوض، وتصيب خلايا البعوض القابلة للإصابة بشكل مستمر مع حدوث أدنى قدر من الاعتلال الخلوي. يوضح هذا البروتوكول فائدة أنظمة نقل الفيروسات ألفا المعدية التي تعبر عن مراسلين فلوريين للكشف عن إصابة النواقل وانتقال الفيروس. أولاً، يتم تغذية إناث البعوض بوجبة دم تحتوي على فيروس ألفا المراد دراسته، ثم يتم تحديد كفاءة إصابة البعوض، واختيار البعوض الذي يعبر عن الجين الواسم فقط.بعد ذلك، يتم جمع اللعاب من البعوض المصاب وإثبات القدرة على الانتقال عن طريق إصابة خلايا البعوض المستنبتة باللعاب الذي تم جمعه. يتم الحصول على النتائج باستخدام المجهر الفلوري. يتم تصور تقرير لبروتين مثل GFP وبذلك يتم تتبع عدوى الناقل وانتقال الفيروس بواسطة أنواع البعوض من فصيلة Aedes أو Culex.يمكن استخدام أنظمة تعبير فيروسات ألفا (Alpha virus expression systems) أو أنظمة ATS لتقييم التعبير الجيني والبعوض الناقل بسرعة، وذلك في دراسات الفيروسات المنقولة بالمفصليات (arbovirus) وكذلك قبل إجراء تلاعبات أكثر تعقيداً في البعوض، مثل التعديل الوراثي للبعوض (mosquito transgenesis). سيقوم بشرح هذه الإجراءات كل من د. إيرما سانشيز فارغاس، ود. إريك موسيل، وآرون فيليبس من مختبر د. كين أولسون. ومن أجل إنتاج فيروس TS في خلايا Bhk 21، استخدم فيروساً مأشوباً من نوع symbis يعبر عن المراسل GFP بعد عملية النسخ في المختبر (in vitro transcription)، ثم قم بنقل RNA الخاص بنظام تحويل فيروس ألفا الجينومي إلى خلايا bhk 21 عن طريق التثقيب الكهربائي (electro rate).بعد ذلك، قم باستعادة الفيروس وتكثيره قبل عملية العدوى. هيئ البعوض للتغذية الدموية الفعالة من مغذٍ اصطناعي عن طريق الحرمان من الغذاء؛ حيث يتم إزالة السكر قبل 24 ساعة والماء قبل 12 ساعة من عملية التغذية.امزج دماً حيوانياً تم الحصول عليه تجارياً ومزال منه التجلط أو مضاف إليه السترات مع معلق فيروس TS المشتق من زراعة الخلايا المعدة مسبقاً، وذلك لضمان عدوى فعالة للمعي المتوسط في البعوض. قم بتحضير عيار فيروسي بتركيز 10⁷ وحدة مكونة للبقع لكل ملليلتر في وجبة الدم لتحفيز البعوض على الامتلاء. أضف TP ليصل إلى تركيز نهائي قدره 0.02 molar.ضع غشاءً معوياً مسامياً فوق فوهة وحدة التغذية الزجاجية ذات الغلاف المائي. بعد ذلك، قم بتجهيز وحدات التغذية باستخدام مياه جارية بدرجة حرارة 37 degrees Celsius. ثم انقل الوجبة بواسطة الماصة إلى الحجرة وضع وحدات التغذية بإحكام فوق الكرتون.بعد تغذية البعوض لمدة تتراوح من 10 إلى 30 دقيقة، يتم فرز البعوض المخدر بالتبريد لاختيار العينات الممتلئة بالدم للسماح بتكاثر وانتشار فيروس TS في البعوض المختار. تُحضن الحشرات عند درجة حرارة 28 °C ورطوبة نسبية 75% لمدة تتراوح من ثمانية إلى 10 أيام، وذلك من أجل تثبيت البعوض.ضع الكرتونة التي تحتوي على الورق في درجة حرارة 4 °C لمدة 15 دقيقة تقريبًا. الآن، انقل من 5 إلى 10 بعوضات إلى طاولة تبريد مهيأة للاستخدام مع مجهر فلوري. افحص البعوضات وصنفها بناءً على وجود أو غياب الفلورية.أعد البعوض المختار إلى الكرتون الورقي لاستخدامه حسب الرغبة. وفي هذه المرحلة، حدد كفاءة العدوى باستخدام شدة الفلورية كمؤشر. وأخيرًا، قم بتشريح الأنسجة مثل الأمعاء المتوسطة، وغدد SIV، والأجسام الدهنية، وراقب وجود الفلورية.يمكن تشريح هذه الأعضاء والأنسجة في أوقات أبكر إذا رغبنا في ذلك. احرم البعوض من مصدر السكر لمدة 24 ساعة قبل التغذية. جهز أنبوبًا شعريًا سعة 50 microliter تم تسخينه وسحبه وقصه، مع وضع من ثلاثة إلى خمسة microliters من Cargill.ضع زيت الغمر من النوع B لضمان عدم هروب البعوض. قم بإزالة أرجلها وأجنحتها. الآن، أدخل الخرطوم في الأنبوب.راقب بعناية قطرات اللعاب التي تفرز من الخرطوم في زيت الغمر. إذا لزم الأمر، ضع قطرة من pilocarpine بتركيز 1% على صدر البعوضة لزيادة إفراز اللعاب. بعد 60 إلى 90 دقيقة، قم بإزالة البعوض وتخزينه لعزل الفيروسات في المستقبل. والآن لجمع المحلول من الأنبوب الشعري، قم بطرد خليط اللعاب والزيت في أنبوب يحتوي على 500 µL من 20%F-B-S-P-B-S المعقم.قم بترشيح اللقاح باستخدام مرشح حقنة بمسامية 0.2 micron، ثم استخدم هذا اللقاح لإصابة الخلايا المستزرعة من خلايا البعوض. يتم تقييم كفاءة الإصابة بفيروس five prime DS MRE 16 GFP عن طريق تعبير GFP. وبمرور الوقت، تم إصابة هذه الخلايا بالفيروس بمعدل تعدد إصابة 0.01 multiplicity of infection.يتيح مجهر الفلورسنت فوق البنفسجي (epi fluorescence microscope) رؤية الجسم بالكامل لبروتين GFP في البعوضة المصابة، وكذلك في أجزاء الجسم المختلفة هنا بعد 10 أيام من الإصابة. ويُعد التعبير الانتقائي لبروتين GFP في أعضاء معينة مؤشراً على انتشار العدوى. وعادةً ما تحتوي الأمعاء المتوسطة على بؤر عدوى متميزة في وقت مبكر بعد تناول وجبة دم تحتوي على الفيروس، والتي تنتشر لاحقاً في جميع أنحاء الجزء الخلفي من الأمعاء المتوسطة في أوقات لاحقة بعد الإصابة.يتم الإشارة إلى هذه الأحداث بواسطة المراسلين GFP و DS RED. ويشير اختبار الانتقال إلى أن فيروس five prime DS MRE 16 GFP يعبر عن GFP بشكل مستقر طوال فترة الحضانة الخارجية. وفي البعوضة هنا، يتم الكشف عن GFP في لعاب البعوض في وقت مبكر يصل إلى ثمانية أيام بعد الإصابة.بعد مشاهدة هذا الفيديو، ينبغي أن يكون لديك فهم جيد لكيفية إعداء البعوض فيروس A TS عن طريق الفم، وكيفية التقييم البصري لإصابة البعوض بالفيروس، وكيفية تقييم انتقال الفيروس من البعوض.

alphavirus-transducing-system-tools-for-visualizing-infection

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

علم المناعة والعدوى

نحن تصف طريقة لعملية وشاشة الميدانية التي تم جمعها. البعوض لمجموعة متنوعة من الفيروسات من خلال فحص خلايا فيرو الثقافة من خلال استخدام هذه التقنية ، وقد اكتشفنا 9 فيروسات مختلفة من الأسر التصنيفية 4 في البعوض التي تم جمعها في ولاية كونيتيكت.

الكشف عن الفيروسات المعدية التي جمعت من الحقل عن طريق البعوض فيرو خلية الفحص الثقافة

الاستفادة من التقدم في مجال التنمية وfluorophore تكنولوجيا التصوير ، وهي طريقة بسيطة لوضع العلامات اليكسا فلور من حمى الضنك ولقد ابتكر الفيروس لتصور التفاعلات المبكرة بين الفيروس والخلية.

تصور فيروس حمى الضنك من خلال وصفها اليكسا فلور

الكروموسوم اللوحة هي طريقة مفيدة لدراسة تنظيم نواة الخلية وتطور karyotype. هنا، نظهر نهجا لعزل وتضخيم مناطق محددة ذات أهمية من كروموسومات البوليتين المفردة التي تستخدم لاحقا للفلورسنت ثنائي وثلاثي الأبعاد في التهجين الموقعي (FISH).

2D و 3D كروموسوم اللوحة في البعوض الملاريا

تستخدم هذه المخطوطة ومقرها فيجي المفتوحة المصدر حزمة البرامج VirusMapper لتطبيق تحليل جسيم واحد إلى صور مجهرية فائقة الدقة من أجل توليد نماذج دقيقة للبنية النانو.

المصدر المفتوح تحليل واحد الجسيمات لسوبر قرار المجهري مع VirusMapper

نحن تقرير استخدام اصطناعية إينترونيك صغيرة رنا تعبير استراتيجية لتطوير غير تالف المؤتلف دينسوفيروس (آيدف) بعوض الزاعجة المصرية في فيفو نظام التسليم. ويرد وصف إجراء مفصل للبناء والتعبئة والتغليف، والتحليل الكمي لناقلات رايدف، وكذلك فيما يتعلق بالإصابة باليرقات.

استخدام دينسوفيروس المؤتلف البعوض ناقل توصيل جينات للتحليل الوظيفي للجينات في يرقات البعوض

الحالي متعدد التشخيص للكشف عن زيكا، الشيكونغونيا، وفيروسات حمى الضنك تتطلب إعداد نماذج معقدة ومكلفة للأجهزة، وهي صعبة الاستخدام في البيئات قليلة الموارد. علينا إظهار تشخيص التي يستخدمها التضخيم متحاور مع تحقيقات منقولة حبلا محددة الهدف لكشف والتفريق بين هذه الفيروسات مع حساسية عالية وخصوصية.

متعدد التضخيم متحاور على أساس منهاج التشخيصية للكشف عن زكى وداء شيكونغونيا وحمى الضنك 1

نقدم هنا، البروتوكولات لتحديد إيمونومودولاتورس 1) الفيروسات المشفرة التي تروج للنسخ المتماثل المفصليات وعوامل المضيف 2) حقيقية النواة التي تقيد المفصليات النسخ المتماثل. تسمح هذه الأساليب المستندة إلى الأسفار والتلألؤ الباحثين سرعة الحصول على قراءات الكمية من النسخ المتماثل المفصليات في فحوصات التبسيط مع انخفاض نسب الإشارات إلى الضجيج.

التهابات المفصليات كفحص أدوات للتعرف على العوامل المضادة للفيروسات إيمونومودولاتورس والمضيف الفيروسية

ويمكن للبروتوكول المقدم أن يحدد كفاءة البعوض Aedes aegypti في حالات الإصابة بفيروس معين، مثل زيكا، في بيئة احتواء.

تحليلات كفاءة النواقل على بعوض Aedes aegypti باستخدام فيروس زيكا

هذه المنهجية، التي شملت التغذية الفموية وعدوى الحقن داخل الصدر، يمكن أن تقيم بشكل فعال تأثير حواجز الأمعاء الوسطى و / أو الغدد اللعابية على عدوى الفيروسات المنقولة بالمفصليات.

العدوى الفيروسية التجريبية في البعوض البالغ عن طريق التغذية الفموية والحقن المجهري

تم العثور على العديد من التسلسلات الجديدة الشبيهة بالفيروسات في البعوض بسبب الاستخدام المكثف لتقنيات التسلسل. نحن نقدم إجراء فعالا لعزل الفيروسات وتضخيمها باستخدام الفقاريات وخطوط خلايا البعوض ، والتي قد تكون بمثابة أساس للدراسات المستقبلية حول الفيروسات المرتبطة بالبعوض ، بما في ذلك الفيروسات التي ينقلها البعوض والفيروسات الخاصة بالبعوض.

عزل الفيروسات المرتبطة بالبعوض من البعوض الذي تم جمعه في الحقول

يصف هذا البروتوكول كيفية قياس بيانات معلمات الحياة الشائعة في بعوض الزاعجة المصرية ، بما في ذلك الخصوبة ، وحجم الجناح ، والخصوبة ، ونسبة الجنس ، والقدرة على البقاء ، وأوقات النمو ، ومساهمة الذكور ، وطول عمر البالغين. يمكن استخدام هذه القياسات لتقييم لياقة البعوض المعدل وراثيا.

القياس الكمي لتكاليف اللياقة البدنية في بعوض الزاعجة المصرية المعدلة وراثيا

اكتشف استخدام نظام الفيروس الألفا الناقل للتعبير عن البروتينات الفلورية في البعوض البالغ. تتيح هذه الطريقة تتبع العدوى وانتقال الفيروس بكفاءة عالية.

نظام الفيروسة الألفاوية Transducing : أدوات لتصور العدوى في البعوض الناقل

استكشف المزيد من الفيديوهات