بروتوكول للانتاج من الصليب الوراثية للطفيليات الملاريا القوارض

الهدف العام من هذا الإجراء هو إجراء تهجين جيني لطفيلي الملاريا الذي يصيب القوارض plasmodium yoi من أجل توليد ذرية معاد تركيبها. يتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق حقن مجموعة من الفئران بلقاح مختلط يحتوي على المستنسخين الأبويين للطفيليات المراد تهجينها. تُستخدم الفئران المصابة بعد ذلك لتغذية البعوض، حيث تندمج الأمشاج من كل سلالة أبوية لتكوين زيجوت ثنائي الصيغة الصبغية؛ ويمكن أن يؤدي الانقسام الاختزالي في هذه المرحلة إلى إعادة التركيب الجيني، مما ينتج عنه ذرية معاد تركيبها.

يتم بعد ذلك جمع الأبواغ المهدبة الناتجة من الغدد اللعابية للبعوض وإعادة حقنها في فئران مستقبلة سلبية، وذلك للحصول على طفيليات في المرحلة الدموية، والتي تتضمن مستنسخات ريكومبينانت فردية يمكن عزلها عن طريق التخفيف المحدود. في التجربة الناجحة، ستكون نسبة 5 إلى 10% من الخطوط المستنسخة ريكومبينانت، ويمكن توصيفها عن طريق التنميط الجيني للعلامات الجينية المناسبة. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال أبحاث الملاريا، مثل ما هي المحددات الجينية للمقاومة الدوائية والقدرة على الانتقال في الملاريا؟

الطفيليات: تُترك قارورتان تحتويان على مرحلة الدم المجمدة من طفيليات الملاريا المراد تهجينها في درجة حرارة الغرفة. في هذا المثال، سلالتا طفيليات ملاريا القوارض المستخدمتان هما plasmodium yoi و plasmodium nigeriensis. يتم تجهيز سرنجة بإبرة قياس 22 إلى 30، وسحب 400 µL من PBS بـ pH 7.4 باستخدام السرنجة ذاتها.

اسحب 100 µL من الدم المصاب بـ Thor، واقلب المحقنة لأعلى وأسفل حتى يتم خلط المحتوى بشكل متجانس. خلال هذا العرض التوضيحي، سيتم استخدام حيوانات مخدرة لتقليل الألم والتوتر. يتم التخدير عن طريق حقن 50 µL من مزيج عقار التخدير الذي يحتوي على 82.5 mg/kg من الكيتامين، و 7.5 mg/kg من الزيلازين في الصفاق لفأر.

راقب الفئران للتأكد من عمق التخدير ومنع الوفاة. باستخدام هذا الإجراء، ستظل الفئران تحت التخدير لمدة تتراوح من 20 إلى 30 دقيقة. قبل الإفاقة، احقن 200 µL من محلول يحتوي على الطفيليات مباشرة في الصفاق للفأر.

عند الانتهاء، تخلص من المحقنة في حاوية الأدوات الحادة. باستخدام هذه الطريقة، قم بإصابة فأرين بكل نوع من الطفيليات المراد تهجينها بعد ثلاثة إلى خمسة أيام من الحقن. ستتطور الطفيليات في مرحلة الدم في الفئران المصابة.

اقطع طرف ذيل الفئران المانحة المصابة بسلالات الطفيليات المختلفة باستخدام مقص معقم. اجمع قطرة من دم ذيل الفأر على شريحة مجهرية وقم بإعداد لطخات دم رقيقة. صبغ لطخة الدم الرقيقة باستخدام صبغة guillem.

لن تقوم صبغة Guillem SA بصبغ خلايا الدم الحمراء غير المصابة بسبب افتقار هذه الخلايا إلى النواة، بينما ستقوم صبغة SAI بصبغ نواة الطفيليات الموجودة في خلايا الدم الحمراء المصابة؛ حيث تظهر الطفيليات في خلايا الدم الحمراء على شكل مراحل حلقية، وأطوار تروفوزويت (trophozoites)، وأطوار شيزونت (schizonts)، وميروزويتات (merozoites) متفجرة. وبمجرد أن تصل نسبة فقر الدم إلى 1-5% في كلا الفأرين، يمكن جمع طفيليات المرحلة الدموية لإجراء عدوى المستعمرات المختلطة.

قص طرف ذيل الفئران المانحة المصابة بالطفيليات المختلفة. السلالات باستخدام مقصات معقمة كما تم وصفه سابقاً. اجمع ميكرولتر واحد من دم ذيل الفأر باستخدام أنبوب شعري زجاجي في ملليلتر واحد من PBS معقم، واستخدم 20 ميكرولتر من معلق الدم لتحليل كثافة خلايا الدم الحمراء باستخدام cell ome.

باستخدام قياسات كثافة خلايا الدم الحمراء والباراسيتيميا، قم بتخفيف عينات الدم في محلول ملحي ستراتي فسيولوجي للحصول على تركيز من خلايا الدم الحمراء المصابة يبلغ مليون خلية لكل 100 µL. امزج عينة من الدم المصاب من المتبرعين الاثنين بنسبة واحد إلى واحد للحصول على لقاح مستنسخ مختلط. بعد ذلك، احقن 100 µL من العينة المختلطة في تجويف الصفاق لكل فأر سيتم إصابته.

استخدم فأرين لإصابات المستنسخ الواحد للسماح بالتأكد من نجاح انتقال كل سلالة أبوية. يجب أن تبدأ المراحل الجنسية للطفيلي، والتي تسمى المذنبات الذكرية والأنثوية، في الظهور في دم الفئران بعد حوالي أربعة أيام من الإصابة في تلك النقطة الزمنية. ابدأ بمراقبة الفئران يومياً لرصد ظهور المذنبات عن طريق جمع دم الذيل كما تم وصفه سابقاً وإعداد لطخات دم رقيقة ومستمرة من دم الذيل.

يمكن تمييز الخلايا الذكرية والأنثوية بفضل وجود حبيبات أو صبغات كبيرة. يكون سيتوبلازم الخلايا الذكرية وردي اللون، بينما يكون سيتوبلازم الخلايا الأنثوية أزرق اللون. وتظهر الفجوة الكبيرة فقط في الخلايا الناضجة.

بمجرد الكشف عن وجود خلايا ناضجة من كلا الجنسين، يمكن استخدام الفئران لإطعام البعوض. احقن 50 µL من محلول الكيتامين والزيلازين والمخدر في البريتون لكل فأر مصاب. وبمجرد تخدير الفئران، ضع فأراً واحداً ووجهه لأسفل فوق قفص يحتوي على 50 إلى 100 أنثى من بعوض Anis defense enzyme التي حُرمت من مصدر السكر لمدة 24 ساعة، واترك البعوض يتغذى لمدة 30 دقيقة دون انقطاع.

يتم القتل الرحيم للفئران بطريقة إنسانية فور انتهاء فترة التغذية. في حالة نجاح الانتقال، وبعد تسعة أيام من التغذية، ستكون المشيجيات التي امتصتها البعوض قد اندمجت لتكون زيجوتات ثنائية المجموعة الكروموسومية تنضج إلى كيسات بيضية، والتي يمكن رؤيتها في المعى المتوسط للحشرات. وكلما تم اكتشاف عدد أكبر من الكيسات البيضية، زادت احتمالية تولد طفيليات معاد تركيبها.

استخدم جهاز شفط لجمع من خمس إلى 10 بعوضات مصابة من القفص وانقل البعوضات إلى وعاء صغير. قم بتخدير البعوضات باستخدام غاز ثاني أكسيد الكربون وانقلها إلى أطباق بتري زجاجية موضوعة على الثلج. يتم استبعاد ذكور البعوض التي تكون قرون استشعارها أكثر كثافة بشكل ملحوظ من الإناث.

املأ محقنتين بمحلول PBS وثبتهما بإبر قياس 26 ومقاس نصف بوصة. ضع حوالي 100 µL من محلول PBS من إحدى المحقنتين على شريحة زجاجية. انقل من خمس إلى عشرات من البعوض الإناث المخدرة إلى قطرة محلول PBS وضع الشريحة تحت مجهر التشريح باستخدام الإبر.

قم بإزالة أجنحة وأرجل كل بعوضة، ثم أمسك الحشرة من منطقة الصدر ونهاية البطن. اسحب الجسم بعيداً عن بعضه حتى يتحرر المعي المتوسط، وهو جسم يشبه الكيس الأبيض. افصل المعي المتوسط وتخلص من بقية الجسم أثناء إجراء عملية التشريح.

تأكد من الحفاظ على رطوبة الأمعاء المتوسطة باستخدام محلول PBS من إبر التشريح. ضع غطاء شريحة فوق الأمعاء المتوسطة بمجرد اكتمال عملية التشريح. افحص الأمعاء المتوسطة تحت مجهر ضوئي بقوة تكبير 100 مرة.

ستكون الأكياس المبيضية (OOS) قابلة للتمييز كبنى دائرية ذات جدران سميكة تقع على السطح الخارجي للأمعاء المتوسطة. قم بعدد الأكياس المبيضية (OOS) في كل أمعاء متوسطة. بعد 17 يوماً من التغذية، يجب أن تكون السبوروزويتات المتحررة من الأكياس المبيضية قد هاجرت إلى الغدد اللعابية (SIV) للبعوض، وهي السبوروزويتات الخاصة بطفيليات الملاريا.

خلايا مغزلية الشكل رقيقة لحصاد السبوروزويتات. أولاً، قم بتجهيز أنبوب تجميع باستخدام مقص نظيف. اقطع غطاء أنبوب إينور صغير سعة 500 microliter.

سخّن طرف إبرة معقمة بمقياس 19 وقم بثقب قاع الأنبوب. املأ ثلث الأنبوب بجدار زجاجي لإنشاء مرشح. أدخل أنبوب المرشح داخل أنبوب einor أكبر سعة 1.5 milliliter.

بمجرد تجهيز جهاز الترشيح، قم بجمع البعوض وتخديره كما تم وصفه سابقاً. قم بتثبيت الحشرات في الهواء لإجراء التشريح كما سبق، ثم قم بإزالة البعوض والرؤوس والأجنحة والأرجل والبطون. يبقى الصدر فقط وهو الذي يحتوي على غدد siv المصابة.

باستخدام ملقط دقيق الرأس، انقل الصدر إلى جهاز تجانس سعة 1.5 milliliter يحتوي على 500 microliters من PBS. قم بتجنيس الصدر على الثلج لتحرير السبوروزويتات من الغدد اللعابية، وباستخدام ماصة زجاجية، انقل النواتج المجانسة إلى جهاز الترشيح. قم بطرد أنبوب الترشيح مركزياً لمدة تتراوح من 10 إلى 20 ثانية بسرعة 1000 rotations per minute.

بمجرد إجراء عملية الطرد المركزي للمجانسات، يتم جمع السائل المترشح باستخدام سرنجة مزودة بإبرة قياس 22 إلى 30. يتم حقن 100 إلى 500 microliters من معلق السبوروزويت في الصفاق لدى الفأر. ابدأ بمراقبة كثافة الخلايا الموازية وكريات الدم الحمراء في الفئران بعد ثلاثة أيام من الإصابة.

اختر فأراً تظهر عليه نسبة طفيليات تتراوح من 0.1 إلى 1%، وبحيث تحتوي خلايا الدم الحمراء المصابة لديه في الغالب على طفيليات مفردة، ليكون متبرعاً في إجراء الاستنساخ. اسحب كمية مناسبة من الدم في PBS، ثم خفف دم الذيل المأخوذ من الفأر في محلول بارد بنسبة واحد إلى واحد من مصل العجل ومحلول رينجر للثدييات، وذلك للوصول إلى تركيز يتراوح من 0.6 إلى 1 خلية دم حمراء مصابة لكل 100 µL، واحفظ اللقاح على الثلج. نظف موقع الحقق الوريدي في الذيل باستخدام الإيثانول.

احقن 100 µL من الدم المصاب المخفف في كل واحد من 100 فأر. وبهذه الطريقة، يجب أن يتلقى كل فأر إما طفيلياً واحداً أو لا شيء. في التجربة الناجحة، ستظهر نسبة 20 إلى 50% من الفئران نسبة طفيليات تتراوح بين 0.1 إلى 0.5% في اليوم الثامن.

بعد مرور خمسة إلى سبعة أيام، يتم فحص الفئران للتأكد من وجود طفيليات في المرحلة الدموية عن طريق فحص لطخات الدم الرقيقة المستدامة. بعد ذلك، يمكن تحديد الأنماط الجينية للطفيليات الناتجة عن التهجين عبر تفاعل البوليميراز المتسلسل (PCR) للحمض النووي DNA المستخلص من عينات دم الذيل، وذلك باستخدام علامات جينية على كروموسومات مختلفة مثل الساتلات الميكروية (microsatellites) وتعدد أشكال النوكليوتيدات المفردة (single nucleotide polymorphisms). وتُعتبر الطفيليات التي تشتق مواقعها الجينية المستقلة من النسيلتين الأبويتين نسخيلات معاد تركيبها.

يمكن حفظ الدم المأخوذ من الحيوانات المصابة بالطفيليات المؤشبة بالتبريد لاستخدامه مستقبلاً. في التجربة الناجحة، ستمتلك نسبة تتراوح من 5 إلى 10% من إجمالي الفئران سلالات مؤشبة مستقلة. بعد مشاهدة هذا الفيديو، سيكون لديك فهم جيد لكيفية إجراء العملية الجينية في مرض الملاريا.

الطفيلي بالإضافة إلى الوسط yoi. يمكن تطبيق هذه الطريقة بالتساوي على أنواع أخرى من الطفيليات.