لإعداد متفرقة الشبكية إلى سجل الاستجابة الخفيفة وراثيا من إعتبر خلايا الشبكية العقدة

الهدف العام من هذا الإجراء هو تسجيل الاستجابات المستثارة بالضوء من الخلايا العقدية المحددة جينيًا في شبكية عين الفأر المعزولة. ويتم تحقيق ذلك أولاً عن طريق تشريح الشبكية من عين الفأر، ثم تتمثل الخطوة الثانية من الإجراء في معالجة الشبكية بإنزيم لإزالة ما تبقى من الجسم الزجاجي.

تتمثل الخطوة الثالثة من الإجراء في تثبيت الشبكية بحيث يكون جانب خلايا العقدة للأعلى في غرفة التسجيل، وتثبيت الغرفة على منصة المجهر، وتحديد خلايا العقدة المحددة جينياً. أما الخطوة النهائية من الإجراء فهي الحصول على تسجيل للخلية الكاملة لخلية العقدة المحددة وتسجيل الاستجابات المستحثة بالضوء. وفي النهاية، يمكن الحصول على نتائج توضح الخصائص الوظيفية لنوع محدد من خلايا العقدة في شبكية الفأر، وتحديد الإشارات التي تنقلها إلى الدماغ من خلال تسجيلات تثبيت الرقعة للخلية الواحدة.

مرحباً، اسمي تيفاني شميدت، وأنا طالبة دراسات عليا في تخصص العلوم العصبية في مختبر الدكتور باولو كا فوجي بجامعة مينيسوتا. تتيح هذه التقنية تحديد وتسجيل مجموعة محددة من الخلايا العقدية الموُسومة جينياً، وإجراء تحليل مورفولوجي لاحق لها. يمكن لهذه التقنية المساعدة في الإجابة على أسئلة جوهرية في مجال المجال البصري، مثل كيفية معالجة الأنواع الفرعية المختلفة من الخلايا العقدية للميزات الأساسية للمنبهات البصرية قبل إجراء الجراحة.

لإزالة الشبكية، تتمثل المهمة الأولى في تحضير المحاليل الثمانية اللازمة للتجربة. تتوفر مكونات جميع المحاليل المستخدمة في هذه التجربة في النص المصاحب. انقلي 200 milliliters من المحلول خارج الخلوي إلى بيكر سعة 250 milliliter لتخزين الشبكية.

ضع المحلول خارج الخلوي المتبقي في قمع فصل لإجراء التروية بالجاذبية أثناء التسجيل. يجب الحفاظ على كلا المحلولين مشبعين بـ 95%oxygen و 5%carbon dioxide في جميع الأوقات. ولتصوير التغصنات أثناء التجربة، أضف متتبعاً فلورياً مثل LOR 5 94 إلى المحلول داخل الخلوي.

إذا كنت تخطط لإجراء كيمياء نسيجية مناعية بعد تسجيل الخلية الكاملة، فأضف 0.3% neuro biotin إلى المحلول داخل الخلوي. وبمجرد تحضير المحاليل اللازمة، قم بقتل فأر عن طريق الاختناق بثاني أكسيد الكربون، ثم استخرج مقلة العين عن طريق إدخال ملقط رقم اثنين بزاوية بلطف خلف العين ورفع المقلة للخارج. استخدم مقصات جراحة العيون لإزالة العضلات خارج المقلة ولقطع العصب البصري.

ضع مقلة العين في طبق بتري بقطر 35 مليمتر مملوء بمحلول خارج خلوي. استأصل القرنية باستخدام مقص جراحة العيون، ثم اسحب العدسة باستخدام ملقط رقم 5. استخدم الملقط رقم 5 لتمزيق الصلبة وقطع ما تبقى من العصب البصري عند نقطة التقاء الشبكية والصلبة.

اسحب الشبكية برفق بعيداً عن تجويف العين عن طريق تمرير الملقط في المسافة بين الشبكية والصلبة. ولتوفير الوقت، قم بتنفيذ كل خطوة على كلتا الشبكيتين. قبل الانتقال إلى الخطوة التالية، ثمة خطوة حاسمة وهي إزالة الجسم الزجاجي الملتصق بالشبكية. ابدأ باستخدام الملقط للإمساك بالجسم الزجاجي الشفاف الموجود فوق الشبكية.

إذا تمت إزالة الجسم الزجاجي بنجاح، فسترى مادة جيلاتينية شفافة صغيرة على طرف الملقط. قُم بتقطيع كل شبكية إلى نصفين لزيادة كمية الأنسجة القابلة للاستخدام ولتسهيل تثبيت الشبكية في غرفة التسجيل. ضع الشبקיات في المحلول خارج الخلوي المؤكسج في درجة حرارة الغرفة وقلل التعرض للضوء من خلال السماح فقط بالحد الأدنى من الضوء المحيط، مثل الضوء المنبعث من شاشات الكمبيوتر؛ حيث تظل الشبקיات حيوية لمدة ست ساعات تقريبًا.

بعد عملية التشريح، خذ 500 microliters من المحلول خارج الخلوي من المحلول الذي تُغمر فيه الشبקיات الإضافية. قم بتخفيفه بإضافة جزء من محلول إنزيم collagenase hyaluronidase.

ضع محلول الإنزيم في طبق بتري بقطر 35 مليمتر، ثم انقل إحدى الشبكيات المُشرحة إلى طبق البتري. قم بتدوير طبق البتري لمدة 15 دقيقة مع استمرار الضخ اللطيف لمزيج من 95% oxygen و5% carbon dioxide في المحلول. يعمل محلول الإنزيم على إزالة أي بقايا من الجسم الزجاجي، مما يسهل الوصول إلى طبقة الخلايا العقدية. بالنسبة للشبكيات المأخوذة من حيوانات أصغر سناً تحتوي على كمية أقل من الجسم الزجاجي، أو في حال ملاحظة آثار سلبية، يمكن تقليل مدة الهضم إلى خمس دقائق.

باستخدام ماصة نقل بلاستيكية مقصوصة الطرف، يتم إزالة الشبكية من الوسط الذي يحتوي على الإنزيم. ثم تُغسل الشبكية جيداً في محلول خارج الخلوي.

انقل الشبكية إلى غرفة التسجيل. مع توجيه طبقة المستقبلات الضوئية للأسفل، قم بسحب أي سائل متبقٍ باستخدام ماصة أو منديل ورقي، ثم افرد جوانب الشبكية لبسط النسيج. احرص على لمس حواف الشبكية فقط وتجنب لمس طبقة الخلايا العقدية.

لتثبيت الشبكية، ضع حلقة من البلاتين مع شبكة من النايلون فوق الشبكية، ثم املأ الغرفة فوراً بالمحلول خارج الخلوي. قم بتركيب غرفة التسجيل على منصة المجهر، ثم صل أنبوب الإرواء بالجاذبية للمحلول خارج الخلوي، وأنبوب الشفط الفراغي، وسلك التأريض. اضبط الجاذبية بحيث يقطر المحلول بمعدل 1 mL في الدقيقة أو أسرع.

إذا كان معدل التروية بطيئاً جداً، فلن يتم تزويد الأنسجة بالأكسجين بشكل كافٍ وقد يتعطل الإرسال الإشاري التشابكي. الخطوة التالية هي إعداد القطب للتسجيل بـ "الرقعة" للخلية الكاملة (whole cell patch recording). اختر ماصة ذات مقاومة تتراوح بين ثلاثة إلى خمسة ميجا أوم.

املأ ماصة التسجيل بجزء مذاب من المحلول داخل الخلوي، ثم أدخلها في حامل الماصة باستخدام الإضاءة بالأشعة تحت الحمراء وبصريات تباين التداخل التفاضلي أو DIC تحت عدسة شيئية 10x. قم بمعاينة الشبكية وماصة التسجيل. يُستخدم ضوء الأشعة تحت الحمراء لتقليل تعرض الشبكية للضوء المرئي وللحد من التكيف الضوئي، ثم انتقل إلى عدسة شيئية 40x واجعل القطب الكهربائي مرئياً فوق النسيج مباشرة.

يعبر سلالة الفئران المستخدمة في هذه الدراسة عن EGFP في خلايا العقدة، وبالتالي تكون خلايا العقدة مرئية تحت الفلورة فوق المجهرية. يضيء المجهر الشبكية بالفلورة فوق المجهرية عند 480 nanometers. إذا كانت الشبكية سليمة، فيجب أن تكون خلايا العقدة الفردية مرئية.

ستحتوي الشبقيات غير السليمة على نوى حبيبية كبيرة ويجب التخلص منها. اختر إحدى الخلايا العقدية الفلورية للتسجيل واستخدم شريطًا لاصقًا لتمييز الخلية المختارة على شاشة الكمبيوتر. انتقل إلى البصريات بالأشعة تحت الحمراء بحيث يكون جسم الخلية العقدية المختارة مرئيًا.

ضع قطب التسجيل بالقرب من خلية العقدة المستهدفة. قم بتنظيف المنطقة التي تغطي الخلية مباشرة عن طريق تطبيق ضغط إيجابي بسيط على قطب التسجيل. يتم تطبيق ضغط القطب عبر سرنجة بلاستيكية سعة 12 cc متصلة بحامل الماصة بواسطة أنبوب بولي إيثيلين عند نقطة الصفر في المضخم.

أي إزاحات في الجهد. ضع القطب الكهربائي على خلية العقدة المختارة حتى تظهر نقرة على سطح الخلية. ومع ضبط المضخم في وضع تثبيت الجهد، قم بتطبيق نبضة اختبار ومراقبة التيار المار عبر الماصة.

قم بتطبيق ضغط سلبي لإنشاء سدادة بين القطب والخلية. قم بتحرير الضغط السلبي عندما تبدأ السدادة في التشكل، وانتظر حتى يشير تيار الاحتفاظ إلى وجود سدادة كهربائية من نوع "جيجا" (giga seal) بين غشاء الخلية والماصة. قم بتطبيق نبضات خفيفة من الضغط السلبي حتى تظهر العوابر السعوية التي تشير إلى الوصول إلى وضع تسجيل الخلية الكاملة، ثم قم بتحرير أي ضغط مطبق.

إذا كانت مقاومة الوصول أكبر من 30 mega ohms، فيمكن في كثير من الأحيان تحسين ذلك عن طريق تطبيق نبضات إضافية خفيفة جداً من الضغط السلبي. بعد الحصول على وضع الخلية الكاملة، قم بإطفاء الأشعة تحت الحمراء وتغطية المجهر بقطعة قماش سوداء. اترك الخلية لتتكيف مع الظلام لمدة خمس دقائق.

بعد مرور خمس دقائق، يكون التحضير جاهزاً للتسجيل. في وضع تثبيت التيار (current clamp mode)، قم بتشغيل تحفيز الضوء الأبيض للمجال الكامل وسجل استجابة خلية العقدة. إذا كان سيتم تحفيز خلية العقدة عدة مرات، فيجب السماح للشبكية بالتكيف مع الظلام حسب الضرورة بين عمليات التحفيز.

يمكن أيضاً تعديل المحفز الضوئي في هذه المرحلة ليشمل محفزات نمطية أو لونية من أجل تقييم خصائص استجابة الخلايا العقدية، وبعد التسجيل، سيكون المتتبع الفلوري الموجود في المحلول داخل الخلوي قد انتشر إلى الزوائد الشجرية عن طريق التبديل بين الفلورة فوق البؤرية (epi fluorescence) وبصريات الأشعة تحت الحمراء ذات التباين التفاضلي (DIC). يمكن رؤية المتتبع تحت الفلورة فوق البؤرية عند 594 nanometers، ويمكنك فحص الزوائد الشجرية لتحديد ما إذا كانت الخلية العقدية من النوع التشغيلي-الإيقافي (on-off) أو الطبقية (stratified). لقد انتشر النيوروبيوتين (neuro biotin) الذي أضيف إلى المحلول داخل الخلوي في الخلية العقدية، لذا فإن الخطوة التالية هي تحضير الشبكية للكيمياء النسيجية المناعية.

اسحب الماصة برفق لتقليل اضطراب الغشاء الخلوي. لاحظ أنه إذا قمت بتسجيل وملء خلية عقدية شبكية واحدة فقط لكل تحضير، يمكنك حينئذٍ إجراء ارتباطات محددة بين الخلية العقدية المسجلة ومورفولوجيتها التفصيلية. بعد ذلك، ضع الشبكية في محلول Paraform aldehyde وثبتها طوال الليل عند درجة حرارة 4 °C بعد التثبيت الليلي.

اشطف الشبكية المثبتة في PBS مع تغيير محلول PBS ست مرات على الأقل على مدار ساعتين أو أكثر. بعد الشطف، انقل الشبكية إلى طبق يحتوي على محلول الحجب، وضع الطبق على جهاز هزاز واتركه لمدة ساعتين. وفي درجة حرارة الغرفة، استبدل محلول الحجب بمحلول كشف السبتوكوكوس (strep evidence solution)، وأعد الشبكية إلى جهاز الهزاز واتركها لتحضن لمدة يومين عند درجة حرارة أربع درجات Celsius.

بعد مرور يومين، يتم شطف الشبكية باستخدام محلول PBS عن طريق إجراء ست عمليات شطف مدة كل منها 20 دقيقة لتهيئة الشبكية للتثبيت. توضع الشبكية على شريحة زجاجية بحيث يكون جانب الخلايا العقدية للأعلى باستخدام Vector Shield. تُغطى وسائط التثبيت بغطاء زجاجي، ثم تُغلق الحواف بطلاء الأظافر؛ ويمكن الآن فحص الخلايا العقدية الموسومة باستخدام المجهر البؤري (confocal microscope).

يوضح هذا الشكل خلايا العقدة الشبكية الموجبة لـ GFP التي تم تصويرها تحت إضاءة فلورية فوقية بتكبير 40 مرة على اليسار، وتحت إضاءة DIC على اليمين. إذا كانت الشبكية سليمة وكانت عملية التشريح ناجحة، فستظهر خلايا العقدة الفردية تحت إضاءة DIC عند التكبير العالي. أما الشبكيات غير السليمة فستظهر بها نوى محببة كبيرة ويجب التخلص منها.

يوضح هذا الشكل نوع الاستجابة الضوئية النموذجية لخلية عقدية شبكية حساسة للضوء ذاتياً من النوع M2. وستختلف خصائص الاستجابة اعتماداً على نوع الخلية العقدية الشبكية التي تم وسمها جينياً في تحضير معين. إذا كانت الاستجابة التشابكية لخلية عقدية معينة سليمة، فيجب أن تستجيب الخلية عند بدء الضوء أو توقفه من خلال جهود الفعل.

وفي حالة خلية عقدية حساسة للضوء ذاتياً، حيث يحدث إزالة استقطاب مستمرة، يُظهر هذا الشكل لخلية عقدية مملوءة بالنيوروبيوتين مورفولوجيا خلية عقدية شبكية نمطية من النوع M1 off stratifying ذات حساسية ضوئية ذاتية. وبعد إجراء التسجيل من الخلية الكاملة، تتيح الكيمياء النسيجية المناعية إيجاد ارتباط بين المورفولوجيا الشجيرية والاستجابة الكهرومغناطيسية للخلية العقدية الشبكية. وأثناء محاولة تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أكسجة بئر الشبكية وتروية الأنسجة بسرعة من أجل الحفاظ على الاستجابات التشابكية.

شكراً لمشاهدتكم هذا العرض التوضيحي.