الحفظ بالتبريد من كتل الأنسجة القشرية للجيل الثقافات متعلق بالخلايا العصبية التخصيب

مرحبا ، اسمي آلان وأنا مختبر دكتور هورني لو في جامعة كاليفورنيا إيرفين في قسم علم الأعصاب والسلوك. وأنا بوب. اليوم ، سيظهر لك الدكتور هارو بروتوكولا سريعا وفعالا وموثوقا به للحفاظ الروتيني بالتبريد على كتل الأنسجة القشرية من أجل التنكس اللاحق لثقافات الخلايا العصبية الأولية عالية الجودة.

لذلك دعونا نبدأ. يتم تحميل المناديل النظيفة والمفرومة في قوارير التبريد التي تحتوي على 10٪ TMSO. وسط التجميد.

يتم تحميل قوارير التبريد في حاوية تجميد وتوضع عند سالب 80 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل. ثم توضع قوارير التبريد المجمدة في النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل. لزراعة قارورة التيار المتردد المبردة تذوب في حمام ماء دافئ وتشطف ب HBSS دافئ لإزالة DMSO المتبقي.

تتم إضافة HBSS الطازج جنبا إلى جنب مع tryin d ns للتفكك ، وبعد ذلك تتم إضافة DMM مع 10٪ EBS. لوقف النشاط الأنزيمي الانفصامي ، يتم تدوير الخلايا وإعادة تعليق الحبيبات في DMM الطازج بالإضافة إلى 10٪ EBS وطلاءها على أطباق البولي ليسين المغلفة مسبقا. بعد 24 ساعة ، تغير DMM إلى وسط عصبي قاعدي مكمل ونما لمدة 10 أيام.

يستخدم هذا البروتوكول شفرة حلاقة فولاذية لتقطيع الأنسجة القشرية قبل الاستخدام. يجب تعقيم ماكينة الحلاقة في 70٪ من الإيثانول لمدة ساعتين على الأقل. يتم إنشاء محلول الملح المخزن HBSS من Hank عن طريق تخفيف محلول مخزون 10 × في ماء معقم ، ثم يتم الاحتفاظ بمحلول X-H-B-S-S إما على الجليد أو عند أربع درجات مئوية حتى معالجة الأنسجة.

يستخدم أكسيد ثنائي ميثيل السلفت أو DMSO كمادة تبريد محمية في وسائط التجميد. يستخدم هذا البروتوكول تخفيف الحجم والحجم بنسبة 10٪ من DMSO في واحد يجب أن يختلط X-H-B-S-S-D-M-S-O تماما قبل التخزين عند أربع درجات مئوية. يتم استخدام Nalgene وحاوية التجميد للتحكم في معدل تجميد العينات.

حاوية التجميد محملة بقوارير التبريد سعة 2.5 مل تم تمييزها مسبقا. من الجيد أيضا تسمية حاويات التجميد نفسها إذا كان لديك أكثر من واحدة وملاحظة الحاوية المقابلة على الصفراء. يتم إحضار وسائط التجميد التي كانت باردة سابقا بنسبة 10٪ DMSO ، وكذلك حاوية التجميد ، إلى خزانة أمان بيولوجية معقمة.

هنا يضاف ملليلتر واحد من وسائط التجميد ببطء إلى كل من قارورة التبريد بعد التأكد من أن الأغطية آمنة ، ضع حاوية التجميد مع القوارير عند أربع درجات مئوية لمدة ساعتين على الأقل قبل معالجة الأنسجة. يجب شطف شفرة الحلاقة المعقمة مسبقا جيدا. ثلاث أو ثلاث دقائق من الغسل.

يجب أن يكون استخدام الماء المعقم كافيا لإزالة أي إيثانول متبقي. يجب أن يكون إجراء الغسيل هذا سريعا لأن ماكينة الحلاقة عرضة للأكسدة من الغمر المطول والماء المعقم. قبل تنظيف الأنسجة يجب وضعها على كيس ثلج.

اشطفها قليلا بقطعة باردة X-H-B-S-S لإزالة أي حطام عائم حر. تستخدم الإبر المعقمة لتنظيف قطع الأنسجة من أي أغشية وأوعية دموية متبقية. يجب توخي الحذر للحفاظ على السلامة الهيكلية للأنسجة أثناء التنظيف.

مع زيادة هذا ، ستكون كفاءة تقطيع الأنسجة النظيفة مختلفة بشكل واضح عن الأنسجة الخام ويجب إزالة معظم الأغشية أو الأوعية الدموية. بمجرد تنظيف المناديل وشطفها ، يمكن أن يبدأ التقطيع. من المهم عمل قطع نظيفة للأنسجة مما يؤدي إلى تكوين كتل بحجم ملليمتر واحد تقريبا.

الكتل ذات المستوى الكبير جدا ، وتنتج الخلية المنخفضة عند الذوبان. ومع ذلك ، يجب أيضا تجنب المعالجة الزائدة للكتل الأصغر. يمكن جمع الأنسجة المفرومة باستخدام ماصة تلقائية وبعضها بارد X-H-B-S-S.

تأكد من شطف الطبق باستخدام HBSS لاستعادة جميع الأنسجة التي تم جمعها. ثم تضاف الأنسجة إلى حجم كبير من X-H-B-S-S وتترك لتسقط في القاع ، مما يؤدي إلى تكوين حبيبات معبأة بشكل فضفاض. يؤدي ذلك إلى تنظيف أي حطام متبقي قد يكون موجودا أثناء استقرار الأنسجة في HBSS ، واسترجع حاوية التجميد المبردة مسبقا وقوارير التبريد قبل تخصيص الأنسجة.

تأكد من فك جميع القوارير لتسريع عملية ملء الأنسجة. يجب أن يقتصر التعرض ل DMSO في درجة حرارة الغرفة على ما لا يزيد عن 10 دقائق. من الجيد العمل مع حاوية تجميد واحدة في كل مرة حتى يتم استخدام جميع الأنسجة.

ابدأ في شفط الغطاء الزائد للأنسجة الرخوة ، حبيبات الذرة بالقرب من الحبيبات قدر الإمكان دون إزعاجها. ثم ضع طرف فتحة بعرض 200 ميكرولتر على ماصة. لا تستخدم فتحة طرف أصغر لأنها ستضر ببنية الكتل التي تذهب إلى أسفل حبيبات كتلة الأنسجة.

اجمع 200 ميكرولتر من الأنسجة ببطء. أضف هذا المنديل إلى قارورة التبريد وانتقل إلى التالي حتى تمتلئ جميع القوارير. قد تحتاج إلى قاعدة مدتها 10 دقائق.

ضع حاوية التجميد بسرعة في قوارير مجمدة سالبة 80 درجة مئوية لمدة أربع ساعات على الأقل أو طوال الليل إذا كان الوقت محدودا. بعد وقت كاف ، قم بإزالة حاوية التجميد من الفريزر وقم بتخصيص قوارير التبريد إلى صندوق التبريد في أسرع وقت ممكن. ضع صندوق التبريد في رف صندوق من النيتروجين السائل للتخزين طويل الأجل.

قم بإزالة كمية كريو من النيتروجين السائل في أسرع وقت ممكن ، مما يحد من صناديق التبريد يؤدي التعرض لدرجة حرارة الغرفة إلى إذابة العينة بسرعة عن طريق الغمر في حمام مائي بدرجة حرارة 37 درجة مئوية. احتفظ دائما بالغطاء فوق الماء. تحقق بشكل متكرر واستمر في الذوبان حتى يتم ملاحظة ثلج صغير P.

قبل إحضاره إلى خزانة الأمان ، قم بتعقيم cryo vile بنسبة 70٪ من الإيثانول. تابع إضافة أنسجة الذوبان إلى كمية كبيرة من الأنسجة الدافئة X-H-B-S-S إذا بقيت الأنسجة على جدران الحقير الكري. يتم جمعها بلطف باستخدام HBSS.

بمجرد جمع كل الأنسجة. اقلب الأنبوب ثلاث إلى أربع مرات واترك الأنسجة تستقر في الأسفل. تضمن هذه الخطوة تخفيفا كافيا ل DMSO.

بمجرد تسوية الأنسجة ، استنشق أكبر قدر ممكن من السوبر ناتين. ثم أضف 10 مل من الطازجة الدافئة X-H-B-S-S إلى هذا. أضف 300 ميكرولتر من 0.25٪ تريبسين و 50 ميكرولتر من الحمض النووي.

استمر في فصل الأنسجة بتحريض لطيف ، مما يؤدي إلى تعليق خلوي غائم بعد فصل الأنسجة. أوقف النشاط الأنزيمي عن طريق إضافة DM الدافئ بالإضافة إلى معلقات خلايا الانفيوژن المركزي EPS المخصبة بنسبة 10٪ في مصل الأبقار عند 1200 جم لمدة خمس دقائق. أعد تعليق حبيبات الخلية في DMEM الطازج بالإضافة إلى 10٪ EBS واللوحة إلى الألواح المطلية بالبولي ليسين.

اسمح للخلايا بالالتصاق بالأطباق لمدة 30 دقيقة. ثم استبدل الوسائط ب DM جديد بالإضافة إلى 10٪ EBS. بعد 24 ساعة ، استبدل الوسائط المحتوية على DM بوسائط عصبية قاعدية مكملة ب N two و B 27 وتنمو لمدة 10 أيام.

لقد قمنا للتو بتفصيل بروتوكول واسع وفعال وموثوق به مع الحفاظ الروتيني على البكاء لكتل الأنسجة القشرية. حظا سعيدا جدا.