Name: تحليل حركية مرنا الصادرات النووية في خلايا الثدييات التي Microinjection (فيديو) | JoVE Journal
Uploaded: 2010-12-04T13:00:00.000+00:00
Duration: 11 min 32 s
Description: تعلم قياس حركية تصدير مرنا النووي في خلايا الثدييات باستخدام الحقن الدقيق والتهجين الموضعي الفلوري. تتيح هذه الطريقة تتبع ديناميكيات مرنا بدقة عالية.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

نود أن نشكر غوميز E. للحصول على المشورة المفيدة وايلد ألف لسماحه لنا باستخدام معدات مختلفة. وأيد هذا العمل من خلال منحة لوكالة فرانس برس من المعهد الكندي للبحوث الصحية (سندات السعر العائم 102725).

<ol><li>Luo, M. J., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+is+required+for+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Splicing is required for rapid and efficient mRNA export in metazoans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 96, 14937-14942 (1999).</li>
<li>Bossie, M. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Movement+of+macromolecules+between+the+cytoplasm+and+the+nucleus+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Curr.+Opin.+Genet.+Dev%22%5BJournal%5D)">Movement of macromolecules between the cytoplasm and the nucleus in yeast.</a> Curr. Opin. Genet. Dev. 2, 768-774 (1992).</li>
<li>Farny, N. G., Hurt, J. A., Silver, P. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Definition+of+global+and+transcript-specific+mRNA+export+pathways+in+metazoans%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Definition of global and transcript-specific mRNA export pathways in metazoans.</a> Genes Dev. 22, 66-78 (2008).</li>
<li>Audibert, A., Weil, D., Dautry, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+kinetics+of+mRNA+splicing+and+transport+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell.+Biol%22%5BJournal%5D)">In vivo kinetics of mRNA splicing and transport in mammalian cells.</a> Mol. Cell. Biol. 22, 6706-6718 (2002).</li>
<li>Snaar, S. P., Verdijk, P., Tanke, H. J., Dirks, R. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Kinetics+of+HCMV+immediate+early+mRNA+expression+in+stably+transfected+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell.+Sci%22%5BJournal%5D)">Kinetics of HCMV immediate early mRNA expression in stably transfected fibroblasts.</a> J. Cell. Sci. 115, 321-328 (2002).</li>
<li>Palazzo, A. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signal+sequence+coding+region+promotes+nuclear+export+of+mRNA%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Biol%22%5BJournal%5D)">The signal sequence coding region promotes nuclear export of mRNA.</a> PLoS Biol. 5, e322-e322 (2007).</li>
<li>Valencia, P., Dias, A. P., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Splicing+promotes+rapid+and+efficient+mRNA+export+in+mammalian+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Splicing promotes rapid and efficient mRNA export in mammalian cells.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 3386-3391 (2008).</li>
<li>Palazzo, A. F., Eng, C. H., Schlaepfer, D. D., Marcantonio, E. E., Gundersen, G. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Localized+stabilization+of+microtubules+by+integrin-+and+FAK-facilitated+Rho+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Localized stabilization of microtubules by integrin- and FAK-facilitated Rho signaling.</a> Science. 303, 836-839 (2004).</li>
<li>Keller, H. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Proper+alignment+of+the+microscope%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Proper alignment of the microscope.</a> Methods Cell Biol. 72, 45-55 (2003).</li>
<li>Mathews, D. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Incorporating+chemical+modification+constraints+into+a+dynamic+programming+algorithm+for+prediction+of+RNA+secondary+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.S.A%22%5BJournal%5D)">Incorporating chemical modification constraints into a dynamic programming algorithm for prediction of RNA secondary structure.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 101, 7287-7292 (2004).</li>
<li>Görlich, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+signal+sequence+receptor+has+a+second+subunit+and+is+part+of+a+translocation+complex+in+the+endoplasmic+reticulum+as+probed+by+bifunctional+reagents%5BTitle%5D)+AND+%22J.+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">The signal sequence receptor has a second subunit and is part of a translocation complex in the endoplasmic reticulum as probed by bifunctional reagents.</a> J. Cell Biol. 111, 2283-2294 (1990).</li>
<li>Perales, R., Bentley, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((%22Cotranscriptionality%22%3A+the+transcription+elongation+complex+as+a+nexus+for+nuclear+transactions%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">"Cotranscriptionality": the transcription elongation complex as a nexus for nuclear transactions.</a> Mol. Cell. 36, 178-191 (2009).</li>
<li>Buratowski, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progression+through+the+RNA+polymerase+II+CTD+cycle%5BTitle%5D)+AND+%22Mol.+Cell%22%5BJournal%5D)">Progression through the RNA polymerase II CTD cycle.</a> Mol. Cell. 36, 541-546 (2009).</li>
<li>Maniatis, T., Reed, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+extensive+network+of+coupling+among+gene+expression+machines%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An extensive network of coupling among gene expression machines.</a> Nature. 416, 499-506 (2002).</li>
<li>Carter, M. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcript+copy+number+estimation+using+a+mouse+whole-genome+oligonucleotide+microarray%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Transcript copy number estimation using a mouse whole-genome oligonucleotide microarray.</a> Genome Biol. 6, 61-61 (2005).</li>
</ol>

الإعلان عن أي تضارب في المصالح.

Microinjection هو أداة قوية يمكن استخدامها لدراسة عدد من العمليات الخلوية المختلفة. خلافا ترنسفكأيشن الخلية التقليدية ، microinjection يسمح للباحث أن أعرض على نحو فعال الأحماض النووية في نوى الخلايا خلال فترة زمنية ضيقة جدا. نتيجة لذلك ، يمكن للمرء أن إجراء تحليلات الحركية مثل تحديد أسعار التصدير مرنا والتطويع اللغوي مرنا ، وتخليق البروتين. وعلاوة على ذلك ، لأن الإطار الزمني لهذه التجربة هي قصيرة نسبيا ، يمكن للمرء أن يعرض الخلايا إلى مركبات سامة داخل فترات زمنية قصيرة دون تكبد آثار عديد المظاهر. وعلاوة على ذلك ، يمكن المثبطة أو تنشيطية المركبات مثل البروتينات السلبية السائدة ، وشارك في حقن مع الأحماض النووية. أخيرا ، تجنب microinjections شرط الكواشف ترنسفكأيشن ، التي غالبا ما تكون سامة للخلايا ، ويمكن التشويش على الخليوي وظائف مختلفة. مرنا مقابل حقن الحمض النووي البلازميد اختيار منها الحمض النووي لحقن سيعتمد على عدد من الاعتبارات. التالية البلازميد حقن الحمض النووي ، والجيش الملكي النيبالي الثاني بوليميريز ليس فقط يجمع مرنا ، ولكن أيضا من العوامل المجندين البروتين لنص 12،13 الوليدة. منذ هذه العوامل تحكم الأحداث مثل تجهيز مرنا ، تصدير المواد النووية والتوطين حشوية ، يمكن استخدام حقن الحمض النووي البلازميد لتقييم كيف يقترن النسخ لعمليات المصب. وإن كان من الممكن أن يقترن النسخ لتصدير المواد النووية 14 ، وجدنا أن يتم تصدير مرنا حقن أسرع قليلا مما كان عليه في كتب مرنا فيفو 6. أسباب ذلك ليست واضحة في الوقت الراهن ، ولكن هذه النتيجة قد تشير إلى أن مرنا كما مركبة جديدة تنبثق من الحمض النووي الريبي البلمرة الثاني ، قد تكون مرتبطة أنه حتى في المجمعات التي تؤخر تصدير المواد النووية. هناك بعض المزايا مع حقن مرنا. أولا ، لا يملك الباحث في استخدام مثبطات البلمرة الجيش الملكي النيبالي ، والتي قد تؤثر على كيفية خلايا تنظيم عملية التمثيل الغذائي عموما من الحمض النووي الريبي. ثانيا ، يمكن تعديل الحمض النووي الريبي في المختبر قبل الحقن. على سبيل المثال ، يمكن توليفها مع مختلف mRNAs نظائرها سقف 5 &#39;أو بولي (A) أطوال الذيل من أجل تقييم كيف تؤثر هذه الميزات تصدير المواد النووية 6. ثالثا ، يمكن أن يكون المبلغ المحدد من الحمض النووي الريبي الذي يتم حقنه يقدر تقريبا. بعد بروتوكول المبينة أعلاه ، فإننا نقدر أن يتم حقن حوالي 20،000 إلى 50،000 في كل جزيئات النواة ، التي هي صغيرة نسبيا بالمقارنة مع العدد الكلي للمخطوطات في خلية الثدييات نموذجي (400،000 إلى 850،000 الجزيئات) 15. أما العيب الرئيسي مرنا مع الحقن هو أنه خلال microinjection ، تسرب بعض السوائل الحقن في السيتوبلازم أمر لا مفر منه. منذ مرنا حقنه مباشرة في السيتوبلازم غير مستقرة على مدى فترات طويلة (ألف قصر ، والمراقبة غير منشورة) ، يجب اتخاذ المزيد من الحيطة لتحديد الخلايا التي كميا. عموما نحن نحلل الخلايا التي تلقت&gt; 90 ٪ من السوائل الحقن في النواة ، وفقا لتقييم توزيع OG - ديكستران.

<table><tbody><tr><td>محلول الحقن المنظم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>140 mM KCl و 10 mM HEPES، pH 7.4</td></tr><tr><td>ديكستران Oregon Green 488-70kD</td><td>Invitrogen</td><td>D7173</td><td>يمكن تخزين محلول مركز بتركيز 10mg/ml في محلول الحقن المنظم لفترات طويلة عند -80&amp;#x00B0;C</td></tr><tr><td>أنابيب شعرية من البوروسيليكات</td><td>World Precision Instruments, Inc.</td><td>1B100F-4</td><td></td></tr><tr><td>رؤوس ماصات تحميل الهلام لتحميل إبر الحقن</td><td>Eppendorf</td><td>022351656</td><td></td></tr><tr><td>مجهر</td><td>Nikon Instruments</td><td>Eclipse Ti-S</td><td></td></tr><tr><td>المتحكم الدقيق</td><td>Narishige International</td><td>NT-88-V3MSH</td><td></td></tr><tr><td>سرنجة للحقن</td><td>BD Biosciences</td><td>512311</td><td></td></tr><tr><td>محلول PBS المنظم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>137 mM NaCl، 2.7 mM KCl، 10 mM Na&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;، 2 mM KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;، pH 7.4</td></tr><tr><td>محلول SSC المنظم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>150 mM NaCl، 15 mM سترات الصوديوم، pH 7.4</td></tr><tr><td>4% بارافورمالدهايد</td><td>Electron Microscopy Sciences</td><td>15686</td><td>يتم تخفيف محلول مركز من 37% بارافورمالدهايد في محلول PBS</td></tr><tr><td>0.1% Triton X-100 (Surfact-Amps)</td><td>Thermo Fisher Scientific, Inc.</td><td>28314</td><td>يتم تخفيف محلول مركز من 10% Triton X-100 في محلول PBS</td></tr><tr><td>فورماميد</td><td>Fisher Scientific</td><td>F84-1</td><td></td></tr><tr><td>كبريتات الديكستران</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1585-100</td><td></td></tr><tr><td>tRNA من &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R1753</td><td></td></tr><tr><td>معقد فاناديل ريبوسيد (VRC)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R3380</td><td></td></tr><tr><td>ورق ترشيح واتمان</td><td>VWR international</td><td>28298-020</td><td></td></tr><tr><td>طاولة التحكم في الاهتزاز</td><td>Kinetic Systems</td><td>5702E-3036-21</td><td></td></tr><tr><td>Fluoromount G</td><td>SouthernBiotech</td><td>0100-20</td><td></td></tr><tr><td>&amp;alpha;-amanitin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A2263</td><td></td></tr><tr><td>بارافيلم</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td></td></tr><tr><td>جهاز سحب الماصات الدقيقة Flaming/Brown</td><td>Sutter Instrument Co.</td><td>P-97</td><td></td></tr><tr><td>شحم مفرغ</td><td>Dow Corning</td><td>695400008</td><td></td></tr><tr><td>T7 RNA polymerase</td><td>New England Biolabs</td><td>M0251S</td><td></td></tr><tr><td>Poly(A) polymerase</td><td>Ambion</td><td>AM1350</td><td></td></tr><tr><td>محلول التهجين المنظم</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>100mg/ml كبريتات الديكستران، 5mM VRC، 150mM NaCl، 15mM سترات الصوديوم، 0.5mg/ml &lt;em&gt;E. coli&lt;/em&gt; tRNA، 60% فورماميد</td></tr></tbody></table>

تحليل حركية مرنا الصادرات النووية في خلايا الثدييات التي microinjection

Analysis of mRNA Nuclear Export Kinetics in Mammalian Cells by Microinjection

في حقيقيات النوى ، وكتب رسول الحمض النووي الريبي (الرنا) في النواة ، ويجب أن يتم تصديرها إلى السيتوبلازم للوصول إلى آلية الترجمة. على الرغم من انه تمت دراسة تصدير المواد النووية من مرنا نطاق واسع في البويضات القيطم 1 لين العريكة وراثيا والكائنات مثل الخميرة (2) وذبابة الفاكهة المستمدة خط S2 الخلية 3 ، وقد أجريت دراسات قليلة في خلايا الثدييات. وعلاوة على ذلك يمكن فقط حركية التصدير مرنا في الخلايا الجسمية الثدييات يمكن الاستدلال 4،5 بشكل غير مباشر. من أجل قياس حركية تصدير المواد النووية من خلايا الثدييات مرنا في زراعة الأنسجة ، وطورنا مقايسة التي توظف قوة microinjection مقرونا فلوري التهجين في الموضع (FISH). وقد استخدمت هذه المقايسات لإثبات أن في خلايا الثدييات ، ويتم تصدير معظم mRNAs بطريقة تعتمد على الربط 6،7 ، أو في الطريقة التي تتطلب تسلسل الحمض النووي الريبي معينة مثل الإشارة المنطقة تسلسل الترميز (SSCR) 6. في هذا الاختبار ، يتم microinjected الخلايا في المختبر إما مع مرنا توليفها أو DNA البلازميد الذي يحتوي على الجينات في المصالح. يتم تحضين الخلايا microinjected للحصول على نقاط زمنية مختلفة ومحددة ثم يتم تقييم الترجمة شبه الخلوية باستخدام الحمض النووي الريبي من الأسماك. على النقيض من ترنسفكأيشن ، حيث النسخ تحدث عدة ساعات بعد إضافة الأحماض النووية ، microinjection من الحمض النووي أو مرنا يتيح للتعبير السريع ويسمح لتوليد البيانات الحركية الدقيقة.

نحن هنا وصفا للمقايسة التي توظف قوة microinjection مقرونا الفلورسنت<em&gt; في الموقع</em&gt; التهجين من أجل قياس دقيق لحركية التصدير النووي في الخلايا الجسدية مرنا الثدييات.

تحليل حركية مرنا الصادرات النووية في خلايا الثدييات التي Microinjection

في حقيقيات النوى، يتم نسخ الحمض النووي الريبوزي المرسال (mRNA) في النواة، ويجب تصديره إلى السيتوبلازم للوصول إلى آلية الترجمة. وعلى الرغم من...

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس حركية تصدير mRNA النووي في الخلايا الثديية. ويتم تحقيق ذلك عن طريق الحقن المجهري لـ mRNA أو DNA أولاً في نوى خلايا المزارع النسيجية الثديية. وبعد الحقن المجهري، يتم تثبيت العينات بعد فترات حضانة متنوعة.يتم بعد ذلك صبغ الـ mRNA عن طريق التهجين الموضعي المتألق (fluorescent in situ hybridization) أو تقنية fish. وتتمثل الخطوة النهائية من الإجراء في تصوير الخلايا وقياس كمية الفلورة في السيتوبلازم والنواة. وفي النهاية، يمكن قياس معدل تصدير الـ mRNA من خلال مزيج من الحقن المجهري والمجهر الفلوري.مرحباً، أنا SRG AV من مختبر أليكس بالازو في قسم الكيمياء الحيوية بجامعة تورنتو. أنا ستيفان توسكي، أيضاً من مختبر بالازو. أنا إيمي من مختبر بالازو، وأنا خي ماها ديفيد من مختبر بالازو.سنعرض لكم اليوم إجراءً لإدخال mRNA في نويات خلايا زراعة الأنسجة الثديية عن طريق الحقن المجهري. كما سنوضح كيفية صبغ mRNA باستخدام التهجين الموضعي المتألق (fluorescent in situ hybridization). نحن نستخدم هذه الإجراءات في مختبرنا لدراسة حركية تصدير mRNA من النواة في الخلايا الثديية.لنبدأ الآن. قبل عملية الحقن المجهري، قم بتخفيف الحمض النووي البلازمي (plasma DNA) المُحضّر مسبقاً ليكون بتركيز يتراوح بين 50 و 200 micrograms per milliliter في محلول الحقن المنظم. بعد ذلك، أضف Oregon Green 488 أو OG المقترن بـ 70 kilodalton dextran إلى الخليط لتمكين تحديد الخلايا التي تم حقنها.سيساعد الديكستران المقترن بـ OG في تحديد كمية السائل التي تم حقنها في النواة والكمية التي تسربت إلى السيتوبلازم. يتم طرد العينات مركزياً عند 13,000 G ودرجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل لترسيب أي مواد جسيمية قد تعيق طرف الإبرة. اختر خط الخلايا الثديية المراد حقنها مجهرياً بناءً على المعايير الموضحة في بروتوكول التكلفة المكتوب.تُستخدم سبع خلايا لهذا النموذج التوضيحي. توضع الخلايا على شرائح غطاء مغسولة بالحمض في أطباق بتري بقطر 30 مليمتر قبل 24 ساعة على الأقل من الحقن المجهري. ومن الناحية المثالية، يجب أن تكون الطبقة الخلوية أحادية الطبقة متلاحمة بنسبة تتراوح تقريبًا بين 70 إلى 90% في وقت الحقن للسماح بتحديد الخلايا المحقونة بسهولة، ويتم إحداث جرح في الطبقة الخلوية أحادية الطبقة قبل الحقن باستخدام طرف ماصة بلاستيكية سعة 200 ميكرولتر.قم بخدش جرح متصالب على غطاء الشريحة واترك الخلايا لتتعافى في حضانة زراعة الأنسجة لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل الحقن. بالنسبة للحقن المجهري، استخدم مجهراً مقلوباً معزولاً على طاولة هوائية لتقليل الاهتزازات التي قد تعيق عملية الحقن المجهري. باستخدام طرف تحميل هلام einor، قم بإزالة حوالي 1 µL من الجزء العلوي من عينة جهاز الطرد المركزي لتجنب تشتيت الراسب.أدخل طرف الماصة في الطرف الخلفي لإبرة حقن مجهري مسبقة التصنيع ثم قم بتفريغ السائل. سينتقل السائل إلى طرف الإبرة بفعل الخاصية الشعرية. يجب أن يظهر سطح مقعر بالقرب من الطرف في غضون 5 إلى 30 ثانية.ضع الإبرة المملوءة بالسائل في العصا وثبتها في المجهر الدقيق. وبزاوية 45 درجة، قم بمعاينة الإبرة باستخدام العدسة الشيئية 10x وضعها في مركز مجال الرؤية بالقرب من المستوى البؤري. باستخدام مقابض المجهر الدقيق الخشنة، يتم توصيل العصا عبر أنبوب بمحقنة زجاجية، والتي تُستخدم لتوليد الضغط اللازم لطرد السائل من طرف الإبرة.للحفاظ على ضغط ثابت، يتم تثبيت المحقنة على مشبك أنابيب. باستخدام سدادتين مطاطيتين ومشبكين معدنيين، ارفع الإبرة بضعة مليمترات لمنع تلفها في الخطوات اللاحقة، ثم أرجع المجهر إلى الخلف. وبالضغط على مكبس المحقنة، قم بزيادة الضغط.من 0.5 إلى 2 سنتيمتر مكعب. ضع طبق بتري يحتوي على شريحة غطاء ذات طبقة أحادية مجروحة. على منصة العرض، قم بإرجاع المجهر للخلف.حرك العمود للأمام إلى وضع عمودي بحيث يتم محاذاة المكثف لتدخل الإبرة في السائل. يجب القيام بذلك بحذر لمنع كسر الإبرة على شريحة التغطية. باستخدام العدسة الشيئية 10x، حدد مركز التقاطع وضع الإبرة فوق الخلايا المراد حقنها.قم بزيادة التكبير عن طريق الانتقال إلى العدسة الشيئية 40 x. بعد ذلك، قم بخفض الإبرة وتوسيطها باستخدام مقابض الضبط الدقيق في عصا التحكم. ابدأ الحقن عند إحدى زوايا تقاطع الجرح عن طريق خفض الإبرة لإحداث تلامس مع النواة.بمجرد الحقن، يطرأ تغيير ملحوظ في سطوع طور الخلية. استمر على طول إحدى حواف صليب الجرح. ولضمان سهولة تحديد الخلايا المحقونة أثناء التصوير، من الضروري ضبط ضغط الحقن بشكل صحيح لكل إبرة.يجب أن يكون الضغط مرتفعاً بما يكفي لاختراق الغشاء البلازمي والغشاء النووي، ولكن ليس لدرجة تؤدي إلى قتل الخلايا. قم بالحقن المجهري للخلايا على طول حافة الجرح لفترة زمنية محددة. ومع التدريب، يمكن حقن عدة مئات من الخلايا خلال هذه الفترة.في حال حقن الحمض النووي البلازميدي (plasma DNA)، يتم تحضين الخلايا المحقونة مجهرياً عند 37 °C في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 20 دقيقة قبل التثبيت، ثم يتم إيقاف عملية النسخ عن طريق معالجة الخلايا بـ 1 µg/mL من مادة alpha-amanitin المذابة في وسط النمو. تمنع هذه التركيزات عملية النسخ من البلازميدات المحقونة مجهرياً بشكل فعال.أعد الخلايا إلى الحاضنة واتركها لتصدير mRNA المُصنع حديثاً. يمكن إعادة استخدام إبرة واحدة لحقن عدة شرائح غطاء. ومع ذلك، يجب استبدال الإبرة عند تغيير نوع DNA أو RNA الذي يتم حقنه مجهرياً.علاوة على ذلك، بمجرد إزالة الإبرة من العصا، يجب التخلص منها للحصول على قياس دقيق لحركية تصدير mRNA من النواة. يجب تثبيت عينات منفصلة عند الدقيقة صفر، و15 دقيقة، و30 دقيقة، و60 دقيقة، و120 دقيقة. بعد المعالجة بـ alpha manin في الوقت المناسب، يتم سحب وسط النمو وغسل الخلايا مرتين في 2 mL من محلول PBS.من المهم الحفاظ على رطوبة شرائح التغطية عن طريق تقليل الوقت الذي تقضيه دون غمر في السائل. قم بتثبيت الخلايا بإضافة 2 mL من الـ Aldehyde بتركيز 4% في PBS، ثم حضّن الخلايا لمدة 15 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل العينات المثبتة مرتين إضافيتين، قم بنفاذية الخلايا باستخدام 2 mL من Triton X 100 بتركيز 0.1% في PBS، ثم حضّن الخلايا مرة أخرى لمدة 15 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.أخيرًا، اغسل العينات مرتين إضافيتين لتحضيرها لعملية التهجين. اغسل الخلايا مرتين بمحلول غسيل من 1XSSC يحتوي على 25 إلى 60% formamide. ثم جهز غرفة التلوين للتهجين عن طريق تغطية قاع طبق بتري بقطر 150 millimeter بالماء وتعويم قطعة من paraformaldehyde على السطح.قم بإزالة الماء عن طريق قلب الطبق، مما يسمح للبارافورم بالالتصاق بقاع الطبق. قم بإزالة أي فقاعات هواء يدوياً من كل شريحة غطاء سيتم صبغها. استخدم الماصة لإضافة قطرات بحجم 100 µL من محلول التهجين فوق البارافورم.لاحظ أنه يجب تحسين كمية formage للبروتين السمكي المحدد المستخدم بمساعدة الملاقط. قم بإزالة غطاء الشريحة الذي يحتوي على الخلايا المثبتة من طبق بتري بقطر 30 millimeter. وباستخدام ورق ترشيح watman، جفف الجانب الخلفي من غطاء الشريحة وقم بسحب المحلول المنظم الزائد من الجانب الأمامي دون تجفيف الخلايا.بعد ذلك، ضع غطاء الشريحة بحيث يكون الوجه لأسفل فوق محلول السمك. كرر هذه العملية لكل غطاء شريحة. بعد إعادة وضع غطاء حجرات الصبغ، حضّن العينات لمدة تتراوح من 5 إلى 18 ساعة عند 37 °C.قم بتحضير عدة غرف غسيل بنفس الطريقة التي تم بها تحضير غرفة التصبغ؛ لكل شريحة غطاء، قم بنقل 1 mL من محلول الغسيل المنظم إلى البارافورم الخاص بغرفة الغسيل. بعد انتهاء فترة الحضن، قم بإزالة شرائح الغطاء من غرفة التصبغ عن طريق نقل 1 mL من محلول الغسيل المنظم. وبجوار شريحة الغطاء، يجب أن يسحب السائل تحت كل عينة عن طريق الخاصية الشعرية.بعد ذلك، قم بإزالة أغطية الشرائح باستخدام الملقط وضع كل غطاء على قطرة من محلول الغسيل المنقوع في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. اغسل كل غطاء شريحة مرتين إضافيتين لإجمالي ثلاث غسلات لكل غطاء شريحة، ثم اسحب ما بين 10 إلى 30 µL من محلول التثبيت مع DAPI باستخدام الماصة وضعها على شريحة مغسولة مسبقاً. يمكن لكل شريحة استيعاب غطائي شريحة باستخدام الملقط وورق ترشيح واتمان.جفف الجزء الخلفي من شرائح التغطية وقم بامتصاص السوائل الزائدة من الجانب الأمامي لشريحة التغطية دون تجفيف العينات. ضع كل شريحة تغطية مقلوبة على قطرة من محلول التثبيت. يمكن تخزين العينات المثبتة عند درجة حرارة 4 °C.تظهر هنا تأثيرات alpha mantin على نسخ الحمض النووي DNA البلازميدي المحقون في خلايا NIH 3T3 الليفية، والتي عولجت مسبقاً بتركيزات متفاوتة من alpha mantin. تم حقن هذه الخلايا بـ TFL s delta i، والحمض النووي البلازميدي DNA و OG conjugated 70 kilo and dextran. يمثل كل صف مجال رؤية واحد تم تصويره لـ OG 70 kilodalton dextran و T uts delta I mRNA.من الواضح أن التركيزات العالية من العقار قد ثبطت تمامًا إنتاج نسخة T UTS delta I، بينما لم يُلاحظ ذلك عند التركيزات المنخفضة. موضح هنا المسار الزمني لتكلفة التصدير النووي لـ mRNA. تم حقن سبع خلايا بـ T UTS delta i plasma DNA وديكستران بوزن 70 kilodalton مقترن بـ OG.بعد 30 دقيقة من حقن الخلايا، عولجت الخلايا بـ alpha mantin وحُضنت عند 37 درجة Celsius لمدة صفر دقيقة، و60 دقيقة و120 دقيقة. ثم ثُبتت الخلايا وصُبغت بمسبار ضد T UTS delta I mRNA، وبأجسام مضادة ضد ER marker trap alpha، حيث يمثل كل صف مجالاً واحداً من الخلايا.للحصول على معلومات حول كيفية قياس تصدير mRNA كمياً، يرجى الرجوع إلى النص المتاح عبر الإنترنت هنا. تم تكبير النقطة الزمنية 120 دقيقة. ولتوضيح التموضع المشترك لـ TFS delta I mRNA في الشبكة الإندوبلازمية (er)، يتم عرض تراكب لـ T UTS delta I mRNA باللون الأخضر وtrap alpha باللون الأحمر. يمكن العثور على معلومات حول كيفية صبغ mRNA المشترك مع البروتينات في النص المتاح عبر الإنترنت.لقد شرحنا لكم للتو كيفية قياس حركية التصدير النووي لـ mRNA عن طريق الحقن المجهري. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن الحقن المجهري الناجح يتطلب تحضيراً مناسباً. يتم وصف الخطوات الرئيسية مثل تحضير عينات DNA و RNA، وسحب الإبر، ومحاذاة المعدات البصرية، واستكشاف أخطاء الحقن المجهري وإصلاحها في البروتوكول المكتوب الخاص بنا.عند تصوير وتحليل الـ mRNA المحقون مجهرياً، من المهم أن يقتصر التحديد الكمي على الخلايا التي استقبلت أكثر من 90% من السائل المحقون داخل النواة. ويمكن تقييم نجاح الحقن النووي من خلال معاينة توزيع الـ organ green dextran في النواة والسيتوبلازم. يرجى الرجوع إلى البروتوكول الخاص بنا عبر الإنترنت لمزيد من المعلومات حول تصميم مجسات الأسماك واستخدام برامج تحليل الصور لتحليل توزيع الـ mRNA في السيتوبلازم والنواة.هذا كل شيء. شكراً للمشاهدة وبالتوفيق في تجاربكم.

analysis-mrna-nuclear-export-kinetics-mammalian-cells

Research

JoVE Journal

Biology

علم الأحياء

هنا علينا أن نظهر للحشوية...

Microinjection من البويضات المورق القيطم

الحقن المباشر للintranuclear [كدنا] هو أسلوب فعال لترنسفكأيشن بعد الإنقسامية الخلايا. هذا الأسلوب يوفر مستويات عالية من بروتين تعبير مغاير من يبني [كدنا] واحدة أو متعددة ، وتمكن وظيفة البروتين لدراستها في بيئة ذات الصلة من الناحية الفسيولوجية مع مجموعة متنوعة من المقايسات خلية واحدة.

Intranuclear Microinjection من الحمض النووي في الخلايا العصبية فصل الثدييات الكبار

يوصف بروتوكول لإعداد قوي وعصائر هيلا الصغيرة النووية. هذا البروتوكول هو قيمة للفحوصات التي تتطلب استخدام المجموعات الصغيرة من الخلايا، مثل الخلايا المعالجة بالأدوية أو رني. ينبغي أن تكون قابلة للتطبيق على طريقة طائفة واسعة من فحوصات الجينات وغيرها من أنواع الخلايا، بما في ذلك خلايا المريض.

على نطاق صغير مقتطفات النووية لفحوصات وظيفي من الجينات التعبير عن مكائن

نظرا لحجمها الكبير وتنظيمها البسيط نسبيا ، فإن خلايا ممرضة ذبابة الفاكهة مناسبة بشكل مثالي لدراسات تصوير الخلايا الحية. يصف هذا الفيديو طريقة الحقن المجهري لتوصيل المركبات الخارجية إلى الخلايا ، ويوضح البروتوكول المميز الإجراء باستخدام مجسات قليل النوكليوتيدات الفلورية التي تسمى المنارات الجزيئية (MBs) المستخدمة لتصور نصوص mRNA الذاتية.

الحقن المجهري لذبابة الفاكهة الخلايا الممرضة: طريقة للتوصيل داخل الخلايا

نحن هنا وصف طريقة لتصور الشبكة الهيولية الباطنة المرتبطة mRNAs والثدييات في خلايا الأنسجة. هذا الأسلوب الذي ينطوي على permeabilization الانتقائي للغشاء البلازما مع ديجيتونين لإزالة محتويات حشوية تليها...

تصور mRNAs والشبكة الإندوبلازمية في خلايا الثدييات المترجمة

يصف هذا البروتوكول طريقة لقياس بحساسية معدل النقل نوكلوسيتوبلاسميك داخل الخلايا العصبية الحركية مثل نسك-34 الخلايا عن طريق قياس التغير في الوقت الحقيقي في استيراد النووي للبروتين نلس-نيس-غفب.

فحص لقياس نوكلوسيتوبلاسميك النقل في الوقت الحقيقي داخل موتور الخلايا العصبية مثل نسك-34 الخلايا

التكوين الحيوي للsnRNAs snRNAs spliceosomal هي عملية معقدة تنطوي على مختلف المقصورات الخلوية. هنا، وظفنا الحقن الدقيق من snRNAs وصفت الفلورسنت من أجل رصد نقلها داخل الخلية.

تحليل توطين snRNA Spliceosomal في خلايا الهيلا البشرية باستخدام الحقن المجهري

قمنا بتطوير فحص مراسل التكوين الحيوي للحمض النووي الريبوزي المرسال الميكروي الإنتروني لاستخدامه في الخلايا في المختبر مع أربعة بلازميدات: واحد مع miRNA intronic ، واحد مع الهدف ، واحد للمبالغة في التعبير عن بروتين تنظيمي ، وواحد ل Renilla luciferase. تمت معالجة miRNA ويمكنه التحكم في تعبير luciferase عن طريق الارتباط بالتسلسل المستهدف.

فحص مراسل لتحليل نضج الحمض النووي الريبي الميكروي الإنتروني في خلايا الثدييات

Microinjection طريقة راسخة وفعالة لإدخال المؤثرات الأجنبية في الأجنة المخصبة الزرد. هنا ، علينا أن نظهر تقنية microinjection قوية لأداء overexpression مرنا ، والدراسات morpholino ضربة قاضية قليل النوكليوتيد الجينات في الزرد.

Microinjection من مرنا والعقاقير [أليغنوكليوتيد] Morpholino اسماك الزرد في الأجنة.

نحن تصف طريقة لتحليل تحوير N - مرتبطة glycans خلال السنوات الاولى من حياة جليكوبروتينات بعد الحيوي في خلايا الثدييات. ويتحقق ذلك من خلال نبض مطاردة تحليل عملية الأيض glycans المسمى ، وإطلاق سراح من الأنزيمية جليكوبروتينات والفحص بواسطة HPLC.

نبض مطاردة تحليل سلاسل السكر N - الموصولة من جليكوبروتينات في خلايا الثدييات

تعلم قياس حركية تصدير مرنا النووي في خلايا الثدييات باستخدام الحقن الدقيق والتهجين الموضعي الفلوري. تتيح هذه الطريقة تتبع ديناميكيات مرنا بدقة عالية.

تحليل حركية مرنا الصادرات النووية في خلايا الثدييات التي Microinjection

استكشف المزيد من الفيديوهات