تحليل حركية مرنا الصادرات النووية في خلايا الثدييات التي Microinjection

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس حركية التصدير النووي لـ mRNA في الخلايا الثديية. ويتم تحقيق ذلك من خلال الحقن المجهري لـ mRNA أو DNA أولاً في نوى خلايا المزارع النسيجية الثديية. وبعد الحقن المجهري، يتم تثبيت العينات بعد فترات تحضين متنوعة.

يتم بعد ذلك صبغ mRNA عن طريق التهجين الموضعي الفلوري أو fish. والخطوة النهائية من الإجراء هي تصوير الخلايا وقياس كمية الفلورة في السيتوبلازم والنواة. وفي النهاية، يمكن قياس معدل تصدير mRNA من خلال الجمع بين الحقن المجهري والمجهر الفلوري.

مرحباً، أنا SRG AV من مختبر Alex Palazzo في قسم الكيمياء الحيوية بجامعة تورنتو. أنا Stefan Toski، أيضاً من مختبر Palazzo. أنا Amy من مختبر Palazzo، وأنا Khi Maha David من مختبر Palazzo.

سنعرض لكم اليوم إجراءً لإدخال mRNA في نوى خلايا زراعة الأنسجة الثديية عن طريق الحقن المجهري. كما سنبين كيفية صبغ mRNA باستخدام التهجين الفلوري الموضعي (FISH). نحن نستخدم هذه الإجراءات في مختبرنا لدراسة حركية تصدير mRNA النووي في الخلايا الثديية.

فلنبدأ الآن. قبل عملية الحقن المجهري، قم بتخفيف حمض DNA البلازميدي المُحضّر مسبقاً ليكون تركيزه ما بين 50 و 200 micrograms per milliliter في محلول الحقن المنظم. بعد ذلك، أضف Oregon Green 488 أو OG المرتبط بـ 70 kilodalton dextran إلى الخليط لتمكين تحديد الخلايا التي تم حقنها.

سيساعد الديكستران المقترن بـ OG في تحديد كمية السائل التي تم حقنها في النواة والكمية التي تسربت إلى السيتوبلازم. يتم طرد العينات مركزياً عند 13,000 G ودرجة حرارة أربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل لترسيب أي مواد جسيمية قد تعيق طرف الإبرة. اختر خط الخلايا الثديية المراد حقنها مجهرياً بناءً على المعايير الموصوفة في البروتوكول المكتوب.

تُستخدم سبع خلايا في عينة العرض التوضيحية هذه. توضع الخلايا على شرائح غطاء مغسولة بالحمض في أطباق بتري بحجم 30 مليمتر قبل 24 ساعة على الأقل من الحقن المجهري. ومن الناحية المثالية، يجب أن تكون الطبقة الخلوية أحادية الطبقة متلاصقة بنسبة تتراوح تقريبًا من 70 إلى 90% عند وقت الحقن للسماح بتحديد الخلايا المحقونة بسهولة، ويتم إحداث جرح في الطبقة الخلوية أحادية الطبقة قبل الحقن باستخدام رأس ماصة بلاستيكي سعة 200 ميكرولتر.

قم بخدش جرح متقاطع على شريحة الغطاء واترك الخلايا لتتعافى في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل الحقن. وبالنسبة للحقن المجهري، استخدم مجهراً مقلوباً معزولاً على طاولة هوائية لتقليل الاهتزازات التي قد تشوش عملية الحقن المجهري. وباستخدام طرف تحميل هلام einor، قم بإزالة حوالي 1 µL من الجزء العلوي من عينة الطرد المركزي لتجنب تشتيت الراسب.

أدخل طرف الماصة في الطرف الخلفي لإبرة حقن مجهري مجهزة مسبقاً ثم قم بتفريغ السائل. سينسحب السائل إلى طرف الإبرة عن طريق الخاصية الشعرية. يجب أن يظهر سطح مقعر بالقرب من الطرف في غضون خمس إلى 30 ثانية.

ضع الإبرة المملوءة بالسائل في العصا وثبتها في المجهر الدقيق (micro manipulator). وبزاوية 45 درجة، قم بمعاينة الإبرة باستخدام العدسة الشيئية 10x ووضعها في مركز مجال الرؤية بالقرب من المستوى البؤري. وباستخدام مقابض الضبط الخشنة للمجهر الدقيق، يتم توصيل العصا عبر أنبوب بمحقنة زجاجية، والتي تُستخدم لتوليد الضغط اللازم لدفع السائل من طرف الإبرة.

للحفاظ على ضغط ثابت، يتم تثبيت المحقنة على مشبك أنابيب. وباستخدام سدادتين مطاطيتين ومشبكين معدنيين، ارفع الإبرة بضعة مليمترات لمنع تعرضها للتلف في الخطوات اللاحقة، ثم أعد المجهر إلى الخلف. وبالضغط على مكبس المحقنة، قم بزيادة الضغط.

من 0.5 إلى سنتيمترين مكعبين. ضع طبق بتري يحتوي على شريحة غطاء بها طبقة أحادية مصابة. على منصة العرض، اسحب المجهر للخلف.

قم بتحريك العمود للأمام إلى وضع عمودي بحيث يكون المكثف محاذياً للإبرة للدخول في السائل. يجب القيام بذلك بعناية لمنع كسر الإبرة على غطاء الشريحة. وباستخدام العدسة الشيئية 10x، حدد مركز الجرح المتقاطع وضع الإبرة فوق الخلايا المراد حقنها.

قم بزيادة التكبير عن طريق التبديل إلى العدسة الشيئية 40 x. بعد ذلك، قم بخفض الإبرة وتوسيطها باستخدام مقابض الضبط الدقيق في عصا التحكم. ابدأ الحقن عند أحد أركان تقاطع الجرح عن طريق خفض الإبرة حتى تلامس النواة.

بمجرد الحقن، تطرأ على الخلية تغير ملحوظ في سطوع الطور. استمر على طول إحدى حواف صليب الجرح. ومن أجل التحديد السهل للخلايا المحقونة أثناء التصوير، من الضروري ضبط ضغط الحقن بشكل صحيح لكل إبرة.

يجب أن يكون الضغط مرتفعاً بما يكفي لاختراق الغشاء البلازمي والغشاء النووي، ولكن ليس لدرجة تؤدي إلى قتل الخلايا. قم بالحقن المجهري للخلايا على طول حافة الجرح لفترة زمنية محددة. ومع الممارسة، يمكن حقن عدة مئات من الخلايا خلال هذه الفترة.

في حالة حقن الحمض النووي البلازميدي (plasma DNA)، يتم تحضين الخلايا المحقونة مجهرياً عند 37 °C في حضانة زراعة الأنسجة لمدة 20 دقيقة قبل التثبيت، ثم يتم إيقاف عملية النسخ عن طريق معالجة الخلايا بـ 1 µg/mL من مادة alpha, a mantin المذابة في وسط النمو. حيث يعمل هذا التركيز بفاعلية على تثبيط النسخ من البلازميدات المحقونة مجهرياً.

أعد الخلايا إلى الحاضنة واتركها لتصدير mRNA المُصنّع حديثاً. يمكن إعادة استخدام إبرة واحدة لحقن عدة شرائح غطائية. ومع ذلك، يجب استبدال الإبرة عند تغيير نوع DNA أو RNA الذي يتم حقنه مجهرياً.

علاوة على ذلك، بمجرد إزالة الإبرة من العصا، يجب التخلص منها للحصول على قياس دقيق لحركية تصدير mRNA من النواة. يجب تثبيت عينات منفصلة عند الدقيقة 0، والدقيقة 15، والدقيقة 30، والدقيقة 60، والدقيقة 120. بعد المعالجة بـ alpha manin في الوقت المناسب، يتم سحب وسط النمو وغسل الخلايا مرتين في 2 mL من محلول PBS.

من المهم الحفاظ على رطوبة شرائح الغطاء من خلال تقليل الوقت الذي لا تكون فيه مغمورة في السائل. قم بتثبيت الخلايا بإضافة 2 mL من 4%Aldehyde في PBS، ثم حضن الخلايا لمدة 15 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل العينات المثبتة مرتين إضافيتين، قم بنفاذية الخلايا باستخدام 2 mL من 0.1%Triton X 100 في PBS، ثم حضن الخلايا مرة أخرى لمدة 15 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

أخيراً، اغسل العينات مرتين إضافيتين لتحضيرها لعملية التهجين. اغسل الخلايا مرتين باستخدام محلول غسيل من محلول 1X SSC يحتوي على 25 إلى 60% formamide. بعد ذلك، جهز غرفة التصبيغ للتهجين عن طريق تغطية قاع طبق بتري بقطر 150 millimeter بالماء ووضع قطعة من paraform فوق السطح.

قم بإزالة الماء عن طريق قلب الطبق، مما يسمح للبارافورم بالالتصاق بقاع الطبق. قم بإزالة أي فقاعات هوائية يدوياً من كل شريحة غطاء سيتم صبغها. انقل قطرات بحجم 100 µL من محلول التهجين بواسطة الماصة فوق البارافورم.

لاحظ أنه يجب تحسين كمية formage لبروتين السمكة المحدد المستخدم فيه بمساعدة الملقط. قم بإزالة شريحة غطاء تحتوي على الخلايا المثبتة من طبق بتري بقطر 30 مليمتر. وباستخدام ورق ترشيح watman، جفف الجانب الخلفي من شريحة الغطاء واسحب المحلول المنظم الزائد من الجانب الأمامي دون تجفيف الخلايا.

بعد ذلك، ضع غطاء الشريحة بحيث يكون الوجه لأسفل فوق محلول السمك. كرر هذه العملية لكل غطاء شريحة. بعد إعادة وضع غطاء غرف التصبيغ، قم بتحضين العينات لمدة تتراوح من 5 إلى 18 ساعة عند 37 °C.

قم بتجهيز عدة غرف غسيل بنفس الطريقة التي تم بها تجهيز غرفة الصبغ؛ حيث يتم وضع واحد ملل من محلول الغسيل المنظم باستخدام الماصة على البارافورم الخاص بغرفة الغسيل. بعد انتهاء فترة الحضنة، قم بإزالة الشرائح الغطائية من غرفة الصبغ عن طريق وضع واحد ملل من محلول الغسيل المنظم. وبجوار الشريحة الغطائية، يجب أن يسحب السائل تحت كل عينة عن طريق الخاصية الشعرية.

بعد ذلك، قم بإزالة شرائح التغطية باستخدام الملقط وضع كل واحدة منها على قطرة من محلول الغسيل الذي تم تحضينه في درجة حرارة الغرفة لمدة خمس دقائق. اغسل كل شريحة تغطية مرتين إضافيتين ليصبح المجموع ثلاث غسلات لكل شريحة تغطية. باستخدام الماصة، ضع من 10 إلى 30 µL من محلول التثبيت المحتوي على DAPI على شريحة زجاجية مغسولة مسبقاً. يمكن لكل شريحة أن تستوعب شريحتي تغطية باستخدام الملقط وورق ترشيح واتمان.

جفف الجزء الخلفي من أغطية الشرائح، وقم بامتصاص السائل الزائد من الجانب الأمامي للغطاء دون تجفيف العينات. ضع كل غطاء شريحة ووجهه لأسفل فوق قطرة من محلول التثبيت. يمكن تخزين العينات المثبتة عند درجة حرارة 4 °C.

توضح هذه الصور آثار alpha mantin على نسخ DNA البلازميد المحقون في خلايا NIH 3T3 الليفية، والتي عولجت مسبقاً بتركيزات متفاوتة من alpha mantin. تم حقن هذه الخلايا بـ TFL s delta i plasmid DNA و OG conjugated 70 kilo dextran. ويمثل كل صف حقلاً واحداً من مجال الرؤية تم تصويره لـ OG 70 kilodalton dextran و T uts delta I mRNA.

من الواضح أن التركيزات العالية من الدواء قد ثبطت تمامًا إنتاج نسخ T UTS delta I، في حين لم يُلاحظ ذلك عند التركيزات المنخفضة. موضح هنا هو المخطط الزمني لتكلفة التصدير النووي لـ mRNA. حُقنت سبع خلايا بـ T UTS delta i plasma DNA وديكستران بوزن 70 kilodalton مقترن بـ OG.

بعد مرور 30 دقيقة، عولجت الخلايا المحقونة بـ alpha mantin وحُضنت عند 37 درجة مئوية لمدة صفر دقيقة، و60 دقيقة، و120 دقيقة. ثم تم تثبيت الخلايا وصبغها باستخدام مسبار ضد T UTS delta I mRNA، وباستخدام أجسام مضادة ضد ER marker trap alpha؛ حيث يمثل كل صف حقلاً واحداً من الخلايا.

للحصول على معلومات حول كيفية قياس تصدير mRNA كمياً، يرجى الرجوع إلى النص المتاح عبر الإنترنت هنا. تم تكبير النقطة الزمنية 120 دقيقة. ولإظهار التموضع المشترك لـ TFS delta I mRNA في الشبكة الإندوبلازمية، تم عرض تراكب لـ T UTS delta I mRNA باللون الأخضر و trap alpha باللون الأحمر. يمكن العثور على معلومات حول كيفية صبغ mRNA المشترك مع البروتينات في النص المتاح عبر الإنترنت.

لقد عرضنا لكم للتو كيفية قياس حركية التصدير النووي لـ mRNA عن طريق الحقن المجهري. عند تنفيذ هذا الإجراء، من المهم تذكر أن الحقن المجهري الناجح يتطلب تحضيراً مناسباً. وتتوفر خطوات أساسية مثل تحضير عينات DNA و RNA، وسحب الإبر، ومحاذاة المعدات البصرية، واستكشاف أخطاء الحقن المجهري وإصلاحها في البروتوكول المكتوب الخاص بنا.

عند تصوير وتحليل mRNA المحقون مجهرياً، من المهم أن يقتصر التكميم على الخلايا التي استقبلت أكثر من 90% من السائل المحقون داخل النواة. ويمكن تقييم نجاح الحقن النووي من خلال تصور توزيع dextran الأخضر العضوي في النواة والسيتوبلازم. يرجى الرجوع إلى البروتوكول المتاح عبر الإنترنت لمزيد من المعلومات حول تصميم مجسات الأسماك واستخدام برامج تحليل الصور لتحليل توزيع mRNA في السيتوبلازم والنواة.

هذا كل شيء. شكراً لمشاهدتكم، وبالتوفيق في تجاربكم.