تحليل حركية مرنا الصادرات النووية في خلايا الثدييات التي Microinjection

الهدف العام من هذا الإجراء هو قياس حركية التصدير النووي للرنا المرسال في خلايا الثدييات. يتم تحقيق ذلك عن طريق الحقن الدقيق الأول للحمض النووي الريبي المرسال أو الحمض النووي في نوى خلايا زراعة أنسجة الثدييات. بعد الحقن المجهري ، يتم إصلاح العينات بعد فترات حضانة مختلفة.

ثم يتم تلطيخ الرنا المرسال بالتهجين الفلوري في الموقع أو الأسماك. الخطوة الأخيرة من الإجراء هي تصوير الخلايا وتحديد كمية التألق في السيتوبلازم والنواة. في النهاية ، يمكن قياس معدل تصدير mRNA من خلال مزيج من الحقن المجهري والفحص المجهري الفلوري.

مرحبا ، أنا SRG AV من مختبر Alex Palazzo في قسم الكيمياء الحيوية بجامعة تورنتو. أنا ستيفان توسكي ، أيضا من مختبر بالازو. أنا إيمي من مختبر Palazzo وأنا Khi Maha David من مختبر Palazzo

سنعرض لك اليوم إجراء لإدخال mRNA في نوى خلايا زراعة أنسجة الثدييات عن طريق الحقن المجهري. سنوضح أيضا كيفية تلطيخ الرنا المرسال بالفلورسنت في تهجين C الثاني. نستخدم هذه الإجراءات في مختبرنا لدراسة حركية التصدير النووي للرنا المرسال في خلايا الثدييات.

لذلك دعونا نبدأ. قبل الحقن المجهري ، تم إعداد الحمض النووي للبلازما مسبقا إلى ما بين 50 و 200 ميكروغرام لكل مليلتر في مخزن الحقن. بعد ذلك في Oregon Green 4 88 أو OG مترافق إلى 70 كيلودالتون ديكستران إلى الخليط لتمكين التعرف على الخلايا المحقونة.

سيساعد ديكستران المترافق OG في تحديد كمية السائل التي تم حقنها في النواة ومقدار التسرب إلى جهاز الطرد المركزي للسيتوبلازم. العينات عند 13 ، 000 جم وأربع درجات مئوية لمدة 20 دقيقة على الأقل لتكسير أي جسيمات قد تعيق طرف الإبرة. اختر خط خلية الثدييات المراد حقنه بشكل دقيق بناء على المعايير الموضحة في تكلفة البروتوكول المكتوبة.

يتم استخدام سبع خلايا لهذه البذور التوضيحية. تنزلق الخلايا الموجودة على غطاء المغسول بالحمض في أطباق بتري مقاس 30 ملم قبل 24 ساعة على الأقل من الحقن المجهري. من الناحية المثالية ، يجب أن تكون الطبقة الأحادية للخلية حوالي 70 إلى 90٪ ملتصقة في وقت الحقن للسماح بالتعرف السهل على الخلايا المحقونة ، ويتم جرح الطبقة الأحادية للخلية قبل الحقن باستخدام طرف ماصة بلاستيكية سعة 200 ميكرولتر.

حفر جرح متقاطع على زلة الغطاء واترك الخلايا لتتعافى في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 15 دقيقة على الأقل قبل الحقن. بالنسبة للحقن المجهري ، استخدم مجهرا مقلوبا معزولا على طاولة هوائية لتقليل الاهتزازات التي يمكن أن تتعطل في عملية الحقن المجهري. باستخدام طرف محمل هلام einor ، قم بإزالة ما يقرب من ميكرولتر واحد من أعلى عينة جهاز الطرد المركزي لتجنب تعطيل الحبيبات.

أدخل طرف الماصة في الواجهة الخلفية لإبرة الحقن المجهري الجاهزة وأخرج السائل. سيتم سحب السائل إلى طرف الإبرة عن طريق العمل الشعري. يجب أن يكون الغضروف المفصلي بالقرب من الحافة مرئيا في غضون خمس إلى 30 ثانية.

ضع الإبرة المملوءة بالسوائل في العصا وقم بتثبيتها في المعالج الدقيق. بزاوية 45 درجة ، تخيل الإبرة باستخدام الهدف 10 × وضعها في وسط مجال الرؤية بالقرب من المستوى البؤري. باستخدام مقابض المناولة الدقيقة الخشنة ، يتم توصيل العصا بواسطة أنبوب بحقنة زجاجية ، والتي تستخدم لتوليد الضغط المطلوب لإخراج السائل من طرف الإبرة.

للحفاظ على ضغط ثابت ، يتم تثبيت المحقنة على مشبك الأنبوب. باستخدام سدادتين مطاطيتين ومشابك معدنية ، ارفع الإبرة بضعة ملليمترات لمنع تلفها في الخطوات اللاحقة ثم ادفع المجهر للخلف. عمود ، قم بزيادة الضغط عن طريق الضغط على مكبس المحقنة.

0.5 إلى سنتيمترين مكعبين. ضع طبق بتري يحتوي على زلة غطاء بطبقة أحادية الجرح. في مرحلة المشاهدة ، اسحب المجهر للخلف.

عمود للأمام إلى وضع رأسي مما يتسبب في محاذاة المكثف في الإبرة لدخول السائل. يجب أن يتم ذلك بعناية لمنع الإبرة من الانكسار على زلة الغطاء. باستخدام هدف 10 × ، حدد مركز الجرح المتقاطع وضع الإبرة فوق الخلايا المراد حقنها.

قم بزيادة التكبير عن طريق التبديل إلى الهدف 40 ×. ثم قم بخفض الإبرة وتوسيطها باستخدام مقابض الضبط الدقيقة في عصا التحكم. ابدأ الحقن في أحد أركان صليب الجرح عن طريق خفض الإبرة للتلامس مع النواة.

بمجرد الحقن ، يكون للخلية تغيير ملحوظ في سطوع الطور. استمر على طول إحدى حواف صليب الجرح. لسهولة التعرف على الخلايا المحقونة أثناء التصور ، من الأهمية بمكان ضبط ضغط الحقن بشكل صحيح لكل إبرة.

يجب أن يكون الضغط مرتفعا بما يكفي لاختراق البلازما والأغشية النووية ، ولكن ليس مرتفعا لدرجة قتل الخلايا. حقن الخلايا الدقيقة على طول حافة الجرح لفترة زمنية محددة. مع الممارسة ، يمكن حقن عدة مئات من الخلايا خلال هذه الفترة.

إذا كان حقن الحمض النووي في البلازما يحتضن الخلايا المحقونة الدقيقة عند 37 درجة مئوية في حاضنة زراعة الأنسجة لمدة 20 دقيقة قبل التثبيت ، فقم بإنهاء النسخ. عن طريق معالجة الخلايا بميكروغرام واحد لكل مليلتر ألفا ، يذوب المانتين في وسط النمو. يمنع هذا التركيز بشكل فعال النسخ من البلازميدات المحقونة الدقيقة.

ضع الخلايا مرة أخرى في الحاضنة واسمح للخلايا بتصدير الرنا المرسال المركب حديثا. يمكن إعادة استخدام إبرة واحدة لحقن زلات غطاء متعددة. على الرغم من أن الإبرة تحتاج إلى الاستبدال عندما يتغير نوع الحمض النووي أو الحمض النووي الريبي الذي يتم حقنه الدقيق.

علاوة على ذلك ، بمجرد إزالة الإبرة من العصا ، يجب التخلص منها للحصول على قياس دقيق لحركية التصدير النووي mRNA. يجب تثبيت العينات المنفصلة عند صفر دقيقة و 15 دقيقة و 30 دقيقة و 60 دقيقة و 120 دقيقة. بعد علاج ألفا مانين في الوقت المناسب ، استنشق وسط النمو واغسل الخلايا مرتين في ملليلترين من محلول PBS.

من المهم الحفاظ على رطوبة زلات الغطاء عن طريق تقليل الوقت الذي لا تغمره في السائل. قم بإصلاح الخلايا عن طريق إضافة ملليلترين من 4٪ الألدهيد في PBS ، واحتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة. بعد غسل العينات الثابتة مرتين أخريين ، قم باختراق الخلايا بملليلترين من 0.1٪ Triton X 100 في PBS ، مرة أخرى ، احتضان الخلايا لمدة 15 دقيقة على الأقل في درجة حرارة الغرفة.

أخيرا ، اغسل العينات مرتين إضافيتين لتحضير العينات للتهجين. اغسل الخلايا مرتين باستخدام مخزن مؤقت للغسيل لمحلول XSSC واحد يحتوي على 25 إلى 60٪ من منتصف الشكل. ثم قم بإعداد غرفة التلوين للتهجين عن طريق تغطية قاع طبق بتري 150 ملم بالماء وطفو قطعة من الطفيلي في الأعلى.

قم بإزالة الماء عن طريق قلب الطبق ، مما يسمح للشكل بالالتصاق بقاع الطبق. قم بإزالة أي فقاعات هواء يدويا لكل زلة غطاء ليتم تلطيخها. ماصة 100 قطرات ميكرولتر من محلول التهجين على الطفيلة.

لاحظ أنه يجب تحسين كمية التشكيل لمحترف الأسماك المعين الذي يتم استخدامه بمساعدة الملقط. قم بإزالة زلة الغطاء بالخلايا الثابتة من طبق بتري مقاس 30 ملم. باستخدام ورق الترشيح watman ، جفف الجانب الخلفي من زلة الغطاء وقم بفتيل المخزن المؤقت الزائد من الجانب الأمامي دون تجفيف الخلايا.

ثم ضع زلة الغطاء ووجهها لأسفل على محلول السمك. كرر هذه العملية لكل زلة غطاء. بعد وضع غطاء غرف التلوين مرة أخرى ، احتضان العينات لمدة خمس إلى 18 ساعة عند 37 درجة مئوية.

قم بإعداد العديد من غرف الغسيل بنفس الطريقة التي تم بها تحضير غرفة التلوين لكل ماصة زلة غطاء ملليلتر واحد من عازلة الغسيل على شكل غرفة الغسيل. بعد الحضانة ، قم بإزالة زلات الغطاء من حجرة التلوين عن طريق سحب مليلتر واحد من محلول الغسيل. بجانب زلة الغطاء ، يجب سحب السائل أسفل كل عينة عن طريق العمل الشعري.

ثم قم بإزالة زلات الغطاء بالملقط وضع كل منها على قطرة من درجة حرارة الغرفة المحتضنة لمدة خمس دقائق. اغسل كل زلة غطاء مرتين أخريين ليصبح المجموع ثلاث غسلات لكل ماصة زلة غطاء من 10 إلى 30 ميكرولترا من محلول التركيب مع وضع dappy على شريحة مغسولة مسبقا. يمكن أن تستوعب كل شريحة زلتين للغطاء باستخدام ملقط وورق ترشيح واتمان.

جفف الجزء الخلفي من زلات الغطاء وقم بفتيل السائل الزائد من الجانب الأمامي من زلة الغطاء دون تجفيف العينات. ضع كل زلة غطاء ووجهها لأسفل على قطرة من محلول التركيب. يمكن تخزين العينات المركبة عند أربع درجات مئوية.

هنا أظهرت تأثيرات ألفا مانتين على نسخ الحمض النووي للبلازما المحقون المعاهد الوطنية للصحة ثلاث خلايا ليفية T ، والتي تمت معالجتها مسبقا بتركيزات متفاوتة من ألفا مانتين. تم حقنها مع TFL s دلتا I ، بلازميد DNA و OG مترافق 70 كيلو وديكستران. يتوافق كل صف مع مجال رؤية واحد تم تصويره ل OG 70 كيلودالتون ديكستران و T uts delta I mRNA.

من الواضح أن التركيزات العالية من المخدرات تمنع تماما إنتاج T UTS دلتا النص الأول ، في حين لم يلاحظ ذلك بتركيزات أقل. تفعيلك. فيما يلي مسار زمني لتكلفة التصدير النووي mRNA. تم حقن سبع خلايا مع T UTS دلتا أنا الحمض النووي للبلازما و OG مترافق 70 كيلودالتون ديكستران.

30 دقيقة من الحقن ، تم علاج الخلايا المحقونة بألفا مانتين وتحضنها عند 37 درجة مئوية لمدة صفر دقيقة و 60 دقيقة و 120 دقيقة. ثم تم تثبيت الخلايا وتلطيخها بمسبار ضد T UTS delta I mRNA. ومع وجود الأجسام المضادة ضد مصيدة علامة ER ألفا ، يتوافق كل صف مع حقل واحد من الخلايا.

للحصول على معلومات حول كيفية تحديد تصدير mRNA ، يرجى الرجوع إلى النص عبر الإنترنت هنا. تم تفجير النقطة الزمنية البالغة 120 دقيقة لإثبات تحديد موقع TFS delta I mRNA في er ، يظهر تراكب من T UTS delta I mRNA باللون الأخضر والمصيدة ألفا باللون الأحمر. يمكن العثور على معلومات حول كيفية تلطيخ الرنا المرسال بالبروتينات في النص عبر الإنترنت.

لقد أوضحنا لكم للتو كيفية قياس حركية التصدير النووي ل mRNA عن طريق الحقن المجهري. عند تنفيذ هذا الإجراء ، من المهم أن تتذكر أن الحقن المجهري الناجح يتطلب التحضير المناسب. يتم وصف الخطوات الرئيسية مثل الحمض النووي والحمض النووي الريبي ، وإعداد العينة ، وسحب الإبر ، ومحاذاة المعدات البصرية ، واستكشاف الأخطاء وإصلاحها في الحقن المجهري في بروتوكولنا المكتوب.

عند تصوير وتحليل mRNA المحقون الدقيق ، من المهم أن يقتصر القياس الكمي على الخلايا التي تلقت أكثر من 90٪ من السائل المحقون في النواة. يمكن تقييم الحقن النووي الناجح من خلال تصور توزيع ديكستران الأخضر في النواة والسيتوبلازم. يرجى الرجوع إلى بروتوكولنا عبر الإنترنت للحصول على مزيد من المعلومات حول تصميم مجسات الأسماك واستخدام برنامج تحليل الصور لتحليل توزيع الرنا المرسال في السيتوبلازم في النواة.

هذا كل شيء. شكرا لك على المشاهدة ونتمنى لك التوفيق في تجاربك.