نقل الفيروسات العدسية للخلايا السلفية العصبية للتنظيم اللاجيني لتعبير ألفا سينوكلين

قم بإذابة الخلايا السلفية العصبية أو الشخصيات غير القابلة للعب المخزنة مع مادة حاصلة بالتبريد في كتلة حرارية.

تعبر هذه الشخصيات غير القابلة للعب عن زيادة ألفا سينوكلين ، وهو عامل رئيسي في مرض باركنسون.

انقل الخلايا المذابة إلى أنبوب يحتوي على وسائط قاعدية دافئة لتخفيف مادة الحمالات بالتبريد.

جهاز طرد مركزي لحبيبات الخلايا ، وإزالة المادة الطافية ، وإعادة تعليق الحبيبات في الوسائط العصبية.

أضف تعليق الخلية إلى لوحة متعددة الآبار المطلية ب ECM واحتضانها للسماح بالتصاق الخلية وانتشارها.

أضف نواقل الفيروسات العدسية التي تحتوي على دليل الحمض النووي الريبي ، وميثيل ترانسفيراز Cas9-DNA المعطل ، وجين مقاوم للمضادات الحيوية.

احتضان لتسهيل دخول الفيروس ، والنسخ العكسي للحمض النووي الريبي الفيروسي ، والاندماج في جينوم المضيف ، والتعبير الجيني المعدل.

يوجه دليل الحمض النووي الريبي dCas9 إلى جين ألفا سينوكلين ، حيث تقلل مثيلة الحمض النووي بوساطة ميثيل ترانسفيراز من تعبير ألفا سينوكلين.

استبدل الوسائط بوسائط عصبية تحتوي على المضادات الحيوية لتحديد الخلايا المنقولة ، بينما تخضع الخلايا غير المنقولة لموت الخلايا المبرمج.

ضع Cryovial مع MD NPC في كتلة حرارية 37 درجة مئوية لمدة دقيقتين وانقل الخلايا المذابة إلى أنبوب مخروطي سعة 15 مليلتر مع 10 مل من DMEM-F12 الدافئ.

جهاز طرد مركزي عند 300 جم لمدة خمس دقائق. استنشق المادة الطافية وأعد تعليق الخلايا في ملليلترين من وسط N2B2 الكامل الدافئ مسبقا. أضف ملليلترين من N2B27 إلى تعليق الخلية وقم بلوحة ملليلترين من الخلايا في كل بئر من لوحة BMM المغطاة بستة آبار معدة مسبقا.

احتضان الخلايا عند 37 درجة مئوية مع 5٪ CO_2 بين عشية وضحاها. عندما تكون MD NPCs عند التقاء 70٪ ، قم بتحويلها عن طريق إضافة لترين صغيرين من ناقلات دليل الفيروسات الحمضية RNA d-Cas9-DNMT3A وقم بتدوير اللوحة برفق. بعد احتضان الخلايا في نفس الظروف كما كان سابقا لمدة 16 ساعة ، استبدل وسط N2B27 بعد 48 ساعة من التنبيغ.

أضف N2B27 مع خمسة ميكروغرام لكل مليلتر من البيرومايسين